IL-2（rs6822844）和IL-2Ra（rs2104286）單核苷酸多態(tài)性與原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的相關(guān)性研究

鄧妙，張紅艷，王沖，劉元偉，盛祝梅，張治芬

目前復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）的診斷標準尚不統(tǒng)一，我國通常將3次或3次以上，在妊娠28周之前的胎兒丟失稱為RSA[1]。RSA病因復(fù)雜，近年來，免疫因素在RSA中的作用越來越受到重視。研究顯示，約50%的RSA存在免疫功能紊亂[2]。免疫因素包括自身免疫和同種免疫，其中同種免疫型RSA仍處于研究階段，被稱為原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。輔助性T細胞1型/輔助性T細胞2型（Th1/Th2）比例失衡與多種免疫性疾病有關(guān)，也是URSA的重要機制[3-5]。研究顯示，白細胞介素2基因[IL-2（rs6822844）]及其受體α[IL-2Ra（rs2104286）]單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性硬化病、支氣管哮喘、1型糖尿病等多種Th1/Th2失衡性疾病有關(guān)[6-10]。然而，上述位點與URSA的相關(guān)研究目前未見報道。因此，本研究以中國浙江地區(qū)URSA患者為病例組，正常足月分娩的孕婦為對照組，分析2組患者上述位點等位基因和基因型頻率的分布差異，旨在探討IL-2（rs6822844）、IL-2Ra（rs2104286）與URSA的相關(guān)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月—2019年3月在杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院就診的URSA女性患者設(shè)為URSA組（145例），納入標準：URSA診斷標準參照2016年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會產(chǎn)科學(xué)組標準[1]。夫妻均行染色體核型分析、血常規(guī)、C-反應(yīng)蛋白、生殖道分泌物解脲支原體、沙眼衣原體和淋球菌培養(yǎng)、艾滋病病毒抗體、梅毒特異性抗體、乙型肝炎病毒免疫學(xué)、弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒及其他病原微生物、生化、凝血功能、血黏度、性激素、甲狀腺功能、生殖道超聲檢查、抗磷脂抗體、抗核抗體檢查，男方行精液檢查，排除遺傳、感染、內(nèi)分泌、解剖、血栓前狀態(tài)、自身免疫、男方因素等的影響。另以隨機數(shù)字法選取同期來本院正常足月分娩的孕婦為對照組（220例），納入標準：本次正常足月分娩，既往無自然流產(chǎn)、異位妊娠、早產(chǎn)史，無妊娠期糖尿病、妊娠期高血壓病史，無血栓栓塞、免疫性疾病及家族遺傳病史。2組患者均為浙江杭州地區(qū)漢族女性。URSA組年齡26～34歲，平均（29.68±2.35）歲，對照組年齡23～36歲，平均（29.12±3.54）歲，2組患者年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.805，P=0.072）。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及DNA提取2組病例均空腹采集2 mL靜脈血，乙二胺四乙酸二鉀抗凝。用購自北京天根生化科技有限公司的全血基因組DNA提取試劑盒，按說明書操作，提取的DNA樣本放置-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因型測定應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR），擴增引物由上海輝睿生物技術(shù)有限公司合成。引物序列及擴增條件，見表1。反應(yīng)體系：50 μL反應(yīng)體系，10×PCR緩沖液（無Mg2+）5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，25 mmol/L Mg2+3 μL，10 μmol/L正反向引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶1 μL，基因組DNA 5 μL，加注射用水至總體積50 μL。由上海生工生物工程股份有限公司完成PCR產(chǎn)物測定。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析?；蛐秃偷任换蝾l率在群體中的代表性采用Hardy-Weinberg平衡檢驗；基因型、等位基因與URSA的相對風(fēng)險率OR的95%CI計算采用Miettinen法；2組基因型、等位基因頻率比較均采用χ2檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗 URSA組IL-2Rα（rs2104286）AA基因型頻率觀察值為88.62%，如符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，AA基因型頻率=A等位基因頻率2，計算得A等位基因頻率期待值為88.66%，同理得G等位基因頻率期待值為11.75%。觀察值和期待值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.013，P=0.909），因此IL-2Rα （rs2104286） 基 因 型 頻 率 符 合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則，見表2。

2.2 IL-2（rs6822844）基因型及等位基因頻率分析2組研究對象IL-2（rs6822844）等位基因均為G，基因型均為GG，均未發(fā)現(xiàn)SNPs分布，見圖1（后插一）。

圖1 IL-2（rs6822844）GG基因型測序圖

2.3 IL-2Rα（rs2104286）基因型及等位基因頻率分析 2組研究對象IL-2Rα（rs2104286）位點均存在SNPs分布，共檢測出3種基因型，分別為AA、AG、GG，見圖2（后插一）。URSA組A等位基因頻率（88.62%）高于對照組（79.09%），且A等位基因攜帶者URSA患病風(fēng)險是G等位基因攜帶者的2倍（OR=2.06，95%CI：1.34～3.16，P=0.001）。URSA組AA基因型頻率（78.62%）高于對照組（61.81%），且AA基因型較AG+GG基因型URSA患病風(fēng)險增加約1倍（OR=2.27，95%CI：1.40～3.68，P=0.001），見表3。

圖2 IL-2Rα（rs2104286）3種基因型測序圖

3 討論

目前RSA的診斷標準尚不統(tǒng)一，與我國中華醫(yī)學(xué)會對RSA的定義不同，美國生殖醫(yī)學(xué)會將2次或2次以上的妊娠失敗定義為RSA[11]，英國皇家婦產(chǎn)科醫(yī)師協(xié)會的標準則為同一性伴侶連續(xù)3次或3次以上24周前的胎兒丟失[12]。美國生殖醫(yī)學(xué)會的指南同時指出，生育年齡女性2次或2次以上自然流產(chǎn)率約5%，3次或3次以上自然流產(chǎn)率約1%[11]。RSA給患者身心健康、家庭穩(wěn)定、社會醫(yī)療支出等造成了嚴重影響。RSA病因復(fù)雜，主要包括遺傳、內(nèi)分泌、感染、解剖、自身免疫性疾病、血栓前狀態(tài)、全身性疾病及環(huán)境影響等，但仍有半數(shù)的RSA病因不明，被稱為URSA，又稱同種免疫型RSA。目前認為，URSA與封閉抗體缺乏、NK細胞數(shù)量和活性異常及Th1/Th2細胞因子異常密切相關(guān)[1]。

表1 引物序列及擴增條件

表2 IL-2Rα（rs2104286）Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

表3 IL-2Rα（rs2104286）等位基因和基因型頻率分布

Th1和Th2型細胞是CD4+T細胞的兩個功能亞群，根據(jù)分泌不同的細胞因子區(qū)分。Th1型細胞主要分泌IL-2、干擾素（IFN）和腫瘤壞死因子（TNF），促進炎性反應(yīng)和細胞免疫、直接或間接地損傷胎盤，對胚胎起免疫損傷作用；Th2型細胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-10，介導(dǎo)B細胞增殖、抑制巨噬細胞分泌炎性因子、維持同種免疫耐受狀態(tài)，對胚胎起免疫保護作用。正常母胎界面以Th2型細胞因子占優(yōu)勢，若Th1/Th2型細胞因子平衡向Th1偏移可導(dǎo)致不良妊娠[13-14]。細胞因子的合成受遺傳因素影響，細胞因子基因多態(tài)性主要為微衛(wèi)星基因多態(tài)性和SNPs。其中SNPs是指基因組DNA由于單個核苷酸（A、T、C、G）的改變引起的DNA序列變化，從而造成不同物種間或人體內(nèi)基因的多樣性。SNPs具有遺傳高穩(wěn)定性、高信息量和檢測方法多樣性的優(yōu)點，在病例對照相關(guān)分析中被廣泛應(yīng)用。Aslebahar等[15]的Meta分析納入了29個病例對照研究，結(jié)果顯示TNF-α-308 SNP位點GG基因型RSA的發(fā)病風(fēng)險是AA基因型的1.76倍（OR=1.76，95%CI：1.21～2.43，P=0.002）。進一步分層分析顯示，亞洲人種攜帶GG基因型RSA發(fā)病風(fēng)險更高（OR=2.19，95%CI：1.47～3.27，P＜0.001）。Ma等[16]對中國漢族人群的研究顯示IFN-γ-874 SNP位點A/T等位基因及基因型與URSA無相關(guān)性。IL-2是Th1型細胞分泌的另一重要細胞因子，同時IL-2又能誘導(dǎo)Th1型細胞分化增殖，從而相互促進。IL-2通過與細胞膜上的IL-2R結(jié)合發(fā)揮作用，IL-2R有3個亞單位，分別為IL-2Rα鏈（CD25）、IL-2Rβ 鏈（CDl22）和IL-2Rγ鏈（CDl32）[17]。研究顯示，IL-2（rs6822844）、IL-2Rα（rs2104286）與多種Th1/Th2失衡性疾病相關(guān)[6-10]。然而，上述位點與URSA的相關(guān)性研究目前未見報道。

本研究以浙江地區(qū)145例URSA患者為病例組，220例正常分娩人群為對照組。結(jié)果顯示，2組研究對象IL-2（rs6822844）等位基因均為G，未發(fā)現(xiàn)SNP分布，究其原因可能與人種及地域相關(guān)。Louahchi等[6]的研究顯示IL-2（rs6822844）A等位基因與阿爾及利亞馬格里布地區(qū)摩洛哥人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病密切相關(guān)（OR=2.57，95%CI：1.74～3.83，P=0.001）。但鄭緒陽等[8]在分析IL-2基因多態(tài)性與浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘的關(guān)聯(lián)時發(fā)現(xiàn)，IL-2（rs6822844）等位基因也均為G，未發(fā)現(xiàn)SNP分布。本研究顯示，URSA組IL-2Rα（rs2104286）A等位基因和AA基因型頻率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。且A等位基因攜帶者URSA患病風(fēng)險是G等位基因攜帶者的2倍，AA基因型較AG+GG基因型URSA患病風(fēng)險增加約1倍。提示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地區(qū)URSA的遺傳易感基因。人IL-2R位于第10號染色體短臂上（10p14.15），由8個外顯子和7個內(nèi)含子構(gòu)成，IL-2Rα（rs2104286）位于該基因第一個內(nèi)含子內(nèi)，提示rs2104286可能是一個功能性位點[17]。Wang等[18]的Meta分析顯示，IL-2Rα（s2104286）A等位基因分別與白種人（OR=1.19，95%CI：1.13～1.25，P＜0.001）和亞洲人（OR=1.25，95%CI：1.01～1.55，P=0.041）多發(fā)性硬化癥風(fēng)險增加有關(guān)。Tang等[19]的Meta分析共納入了19項獨立研究、23 528個樣本，結(jié)果顯示IL-2Rα（rs2104286）A等位基因與1型糖尿病的發(fā)病相關(guān)（OR=1.24，95%CI：1.17～1.30，P＜0.001）。鄭緒陽等[8]的研究也顯示，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因與浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘發(fā)病相關(guān)（OR=1.708，95%CI：1.11～2.63，P=0.01）。因此，我們認為IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是多種免疫性疾病共同的易患基因。

URSA的治療方案包括子宮內(nèi)膜干細胞樣細胞治療、免疫細胞和免疫球蛋白灌注治療、粒細胞集落刺激因子治療、環(huán)孢素、糖皮質(zhì)激素、TNF-α和維生素D等，目前研究主要集中在淋巴細胞免疫治療和靜脈注射丙種球蛋白，但對其療效目前仍有爭議[12,20-21]。Chen等[20]的研究顯示，與常規(guī)黃體酮保胎的URSA患者相比，淋巴細胞主動免疫治療組流產(chǎn)率明顯降低，妊娠成功率明顯升高（2組妊娠率分別為89.7%和32.2%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但英國皇家婦產(chǎn)科協(xié)會的指南指出，淋巴細胞主動免疫治療及靜脈注射丙種球蛋白等免疫療法并不顯著提高RSA患者的活產(chǎn)率[12]。因此，新的、有效的URSA免疫治療方案仍待探索。鄭緒陽等[8]的研究同時顯示，IL-2Rα（rs2104286）AA基因型個體外周血IL-2Rα mRNA相對表達量以及血漿IL-2Rα水平均高于AG基因型（Z分別為－2.029和－2.361，P=0.043和0.018），提示IL-2Rα（rs2104286）AA基因型同時影響了其轉(zhuǎn)錄和表達，從而升高了浙江地區(qū)漢族兒童支氣管哮喘的發(fā)病率。研究顯示，IL-2Rα（CD25）單克隆抗體在多種免疫性疾病的治療中發(fā)揮作用。陶濤等[22]研究CD25單抗治療異基因造血干細胞移植后合并糖皮質(zhì)激素耐藥型急性移植物抗宿主病的效果，結(jié)果顯示治療總有效率達75.0%，其中完全緩解率達52.5%。Tang等[23]的研究顯示，CD25單抗可以通過抑制CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞增強日本血吸蟲疫苗的保護作用。CD25單抗的作用機制主要包括促進T細胞有絲分裂、增強T細胞和NK細胞的殺傷功能及輔助抗體生成[22-24]。目前未見CD25單抗用于URSA治療的報道，結(jié)合上述研究，我們認為CD25單抗可以作為治療URSA的一個潛在方案進一步研究。

綜上所述，IL-2Rα（rs2104286）A等位基因可能是浙江地區(qū)URSA 的遺傳易感基因，IL -2（rs6822844）基因多態(tài)性與浙江地區(qū)URSA無相關(guān)性。今后有必要進一步擴大樣本含量，開展多中心臨床研究，綜合分析IL-2Rα、IL-2Rβ 和IL-2Rγ SNPs、單倍型及單倍型組合與URSA發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性，進而進行基因功能研究和免疫治療安全性、有效性研究，探討URSA發(fā)病的遺傳因素和分子機制，為臨床診斷、預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。