不同比例甘草配伍對(duì)山豆根水煎劑中有毒生物堿含量的影響

李海燕，鐘 妤，鐘多敏

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系，廣東佛山528000）

山豆根收載于2015版中國(guó)藥典，為豆科植物越南槐（Sophora tonkinensis Gagnep.）的干燥根和根莖，其性苦、寒并有毒，具有清熱解毒、消腫利咽的功效，用量為3～6 g，苦參堿和氧化苦參堿是質(zhì)量控制的指標(biāo)成分[1]。

隨著山豆根在臨床上的廣泛使用，其所致肝毒性的不良反應(yīng)亦日益增多[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，山豆根水煎液會(huì)對(duì)大鼠造成肝損害[3-4]。山豆根中的苦參堿和氧化苦參堿是引起毒性反應(yīng)的主要成分，超劑量服用是中毒的主要原因[5]。在以山豆根治療急性咽喉炎、扁桃腺炎及扁桃體化膿等疾病有中毒反應(yīng)的病例中，用量10 g以上者，半數(shù)以上出現(xiàn)毒性反應(yīng)[6]?？鄥A和氧化苦參堿這兩種成分的毒性，又以氧化苦參堿的毒性較低[7]。中藥配伍是中醫(yī)臨床用藥的一大特色。傳統(tǒng)中藥方劑中，常以甘草配伍諸藥，水煎煮成湯劑后服用，以緩解藥物毒性。

近年來(lái)，有文獻(xiàn)報(bào)道，甘草能明顯減輕山豆根造成的肝損害，且以山豆根與等量或大于山豆根劑量的甘草的配伍比例減毒效果較好[6，8-9]。但鮮見(jiàn)關(guān)于甘草配伍山豆根對(duì)其水煎劑中有毒生物堿成分影響的研究。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，測(cè)定甘草與山豆根不同配伍比例（0∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1）水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿的含量，了解甘草配伍對(duì)山豆根水煎劑中毒性成分的影響，為降低山豆根毒性及其臨床安全用藥提供理論依據(jù)和指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

DZTW電熱套（北京市永光明醫(yī)療器械有限公司）；FA2004B分析天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；TDL-50B高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；PS-D30A超聲波清洗機(jī)（東莞潔康設(shè)備有限公司）；EYELAA1000S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（配有CA-1111密閉式冷卻水循環(huán)裝置，東京理化器械株式會(huì)社）；Sartorius賽多利斯CPA225D天平（北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；島津LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）。

1.2 材料

甘草藥材飲片（批號(hào)：171001，產(chǎn)地內(nèi)蒙古）；山豆根藥材飲片3批（批號(hào)：HX15F01，產(chǎn)地廣東；批號(hào)：20160402，產(chǎn)地云南；批號(hào)：20150701，產(chǎn)地廣西），均為市售藥材?？鄥A對(duì)照品（批號(hào)110805-200508，供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院），氧化苦參堿對(duì)照品（批號(hào)110780-200506，供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院）。其他試劑包括：水為超純水，乙腈、甲醇、無(wú)水乙醇（均為色譜純），均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取苦參堿對(duì)照品0.010 53 g，置于50 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.210 6 mg/mL的苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液；精密稱(chēng)取氧化苦參堿對(duì)照品0.015 05 g，置于20 mL容量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，得到質(zhì)量濃度為0.752 5 mg/mL的氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液，加甲醇配成質(zhì)量濃度為21.06 μg/mL苦參堿、150.5 μg/mL氧化苦參堿的混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

2.1.2.1 山豆根水煎劑溶液的制備

稱(chēng)取山豆根藥材25 g，加5倍量水浸泡60 min，加熱煮沸后，保持微沸煎煮30 min，過(guò)濾；藥渣再加入3倍量水，再煎煮30 min，過(guò)濾。合并兩次濾液，置離心機(jī)中，3 000 r/min離心20 min，倒出上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量1 g/mL，4℃冷藏，備用。

2.1.2.2 山豆根配伍甘草水煎劑溶液的制備

分別稱(chēng)取山豆根藥材 25 g，按甘草與山豆根的配伍比例（0.5∶1、1∶1、2∶1），分別加入甘草，按 2.1.2.1方法制備，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至生藥量1 g/mL，4℃冷藏，備用。

2.1.2.3 試品溶液的制備

精密量取上述水煎劑溶液0.5 mL，置具塞錐形瓶中，精密加入三氯甲烷-甲醇-濃氨（40∶10∶1）混合溶液50 mL，密塞，稱(chēng)定重量，放置30 min，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，再稱(chēng)定重量，用三氯甲烷-甲醇-濃氨混合溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液10 mL，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過(guò)濾，取出濾液，即得[1]。

2.2 色譜條件

采用Agilent（ZORBAX NH2）柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）為流動(dòng)相[10]，流速 0.80 mL/min，柱溫 35.0 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm，進(jìn)樣體積 5 μL。

2.3 線性關(guān)系考察

分別吸取苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、1、2、2.5、3 mL置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，各取5 μL，進(jìn)樣檢測(cè)。分別以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），生物堿濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程

分別吸取氧化苦參堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.6、0.8、1、2 mL置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，各取5 μL，進(jìn)樣檢測(cè)。分別以峰面積為縱坐標(biāo)（y），生物堿濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程

苦參堿在10.53～63.18 μg/ml、氧化苦參堿在15.05～150.5 μg/ml濃度范圍內(nèi)表明線性關(guān)系良好。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液5 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果苦參堿、氧化苦參堿峰面積的RSD分別為0.95%、1.03%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取同一批次山豆根藥材飲片6份，各25 g，按2.1.2.1、2.1.2.3方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液5 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果顯示苦參堿、氧化苦參堿的RSD分別為1.32%、1.97%，表明檢測(cè)方法重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱(chēng)取山豆根藥材飲片25 g，按2.1.2.1、2.1.2.3方法制備供試品溶液，精密吸取待測(cè)供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件，分別于配制0、1、4、8、12 h依次進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果顯示苦參堿、氧化苦參堿的RSD分別為1.83%、2.01%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批次山豆根水煎劑溶液6份，精密吸取0.25 mL，分別精密加入適量的苦參堿、氧化苦參堿對(duì)照品，按2.1.2.3方法制備加樣回收試驗(yàn)樣品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算結(jié)果顯示，加樣回收率符合方法學(xué)考察規(guī)定，苦參堿、氧化苦參堿平均回收率分別為98.95%、101.81%，RSD分別為2.16%、2.27%。

2.8 樣品測(cè)定

分別取3批山豆根藥材飲片，同一批甘草藥材飲片，分別按2.1.2.3方法制備供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各5 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定供試品中苦參堿、氧化苦參堿含量，結(jié)果詳如表1、圖1和2所示。

表1 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿的含量測(cè)定結(jié)果（，n=2）

表1 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿的含量測(cè)定結(jié)果（，n=2）

注：表1中，*表示甘草：山豆根（0∶1）組與各組之間在0.01水平存在顯著差異；[↑]表示各組與甘草、山豆根比例（0∶1）組比較含量升高；[↓]表示各組與甘草、山豆根比例（0∶1）組比較含量降低。

山豆根批號(hào) 產(chǎn)地甘草與山豆根比例 苦參堿/% 氧化苦參堿/% 苦參堿和氧化苦參堿總量/%HX15F01廣東0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.232 2 0.224 7*[↓3.23%]0.233 2[↑0.43%]0.234 7[↑1.08%]0.610 4 0.432 4*[↓29.16%]0.433 3*[↓29.01%]0.296 7*[↓51.39%]0.842 7 0.657 1*[↓22.02%]0.666 5*[↓20.91%]0.531 4*[↓29.16%]20160402云南0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.280 3 0.278 3[↓0.71%]0.314 3*[↑12.13%]0.297 4*[↑6.1%]0.379 7 0.281 3*[↓25.92%]0.306 2*[↓19.36%]0.204 7*[↓46.09%]0.660 0 0.559 5*[↓15.23%]0.620 5*[↓5.98%]0.502 1*[↓23.92%]20150701廣西0∶1 0.5∶1 1∶1 2∶1 0.293 9 0.339 1*[↑15.38%]0.530 8*[↑80.61%]0.280 5*[↓3.58%]1.066 6 1.113 1*[↑4.36%]1.046 2*[↓1.91%]0.404 4*[↓62.09%]1.360 5 1.452 3*[↑6.75%]1.577 0*[↑15.91%]0.685 0*[↓49.65%]

2.8.1 色譜峰歸屬

由圖1可知，苦參堿、氧化苦參堿均能得到良好分離，空白溶劑無(wú)干擾。產(chǎn)地云南、批號(hào)20160402的山豆根樣品溶液色譜，在氧化苦參堿成分旁邊出現(xiàn)1個(gè)肩峰，而另外兩批次和產(chǎn)地的山豆根樣品則無(wú)此肩峰出現(xiàn)。3批山豆根樣品溶液色譜中苦參堿、氧化苦參堿的峰高、峰面積均有差異。

圖1 供試品及混合對(duì)照品色譜

圖2 不同比例甘草配伍3批山豆根對(duì)水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿含量的影響

2.8.2 不同比例甘草配伍3批山豆根水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿的含量

表1中每份樣品均設(shè)2個(gè)平行，所得數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

由圖1、表1可知，3批山豆根藥材飲片水煎劑中均含有苦參堿、氧化苦參堿，總量均符合2015版中國(guó)藥典中對(duì)山豆根飲片含量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（不得少于0.60%）。但產(chǎn)地批次不同，其含量均存在差異。其中批號(hào)為20150701廣西產(chǎn)山豆根中苦參堿、氧化苦參堿的含量均最高，苦參堿和氧化苦參堿總量1.360 5%，超出2015版藥典要求的1.267 5倍；批號(hào)為20160402云南產(chǎn)山豆根中氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿總量均最低；批號(hào)為HX15F01廣東產(chǎn)山豆根中苦參堿的含量最低。

不同比例的甘草配伍山豆根（0.5∶1、1∶1、2∶1）后，廣東、云南產(chǎn)山豆根水煎劑溶液中，氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量與甘草、山豆根比例（0∶1）組比較，均顯著降低（p＜0.01），其中（2∶1）組中苦參堿和氧化苦參堿的總量已低于2015版中國(guó)藥典中對(duì)山豆根飲片含量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定（不得少于0.60%）；苦參堿的含量與甘草、山豆根比例（0∶1）組比較，（0.5∶1）組均降低，（1∶1）組和（2∶1）組均升高，其中廣東產(chǎn)山豆根（0.5∶1）組均顯著降低（p＜0.01），云南產(chǎn)山豆根（1∶1）組和（2:1）組顯著升高。而不同比例甘草配伍廣西產(chǎn)山豆根后，其水煎劑溶液中，苦參堿的含量、氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量與甘草、山豆根比例（0∶1）組比較，（0.5∶1）組均顯著升高（p＜0.01），（2∶1）組均顯著降低（p＜0.01）。

2.8.3 不同比例甘草配伍3批山豆根對(duì)水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿含量的影響

由圖2、表 1 可知，不同比例甘草配伍廣東、云南產(chǎn)山豆根（0∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1）對(duì)水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿含量的影響趨勢(shì)相近。加入甘草為山豆根的半量（0.5∶1）后，顯著降低氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量，廣東產(chǎn)山豆根水煎劑中苦參堿含量顯著下降，云南產(chǎn)山豆根水煎劑中苦參堿含量略有下降；加入甘草為山豆根的等量（1∶1）后，氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量較無(wú)甘草組（0∶1）顯著降低，而較（0.5∶1）組卻略有回升，苦參堿含量較無(wú)甘草組（0∶1）升高；當(dāng)加入甘草為山豆根的倍量（2∶1）后，苦參堿含量較無(wú)甘草組（0∶1）升高，氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量下降的幅度最大，其中苦參堿和氧化苦參堿的總量小于0.60%，低于2015版中國(guó)藥典對(duì)山豆根藥材飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最低要求。

廣西產(chǎn)山豆根水煎劑溶液中含有的苦參堿和氧化苦參堿總量較高，是2015版中國(guó)藥典對(duì)山豆根藥材飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最低要求（不低于 0.60%）的 2.267 5 倍，加入（0.5∶1、1∶1、2∶1）比例甘草配伍后，對(duì)其水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿含量的影響趨勢(shì)與廣東、云南產(chǎn)山豆根不同。加入甘草為山豆根的半量（0.5∶1）后，苦參堿含量、氧化苦參堿含量、苦參堿和氧化苦參堿總量均顯著升高；加入甘草為山豆根的等量（1∶1）后，氧化苦參堿含量顯著降低，但苦參堿含量、苦參堿和氧化苦參堿總量仍然顯著升高，且苦參堿的含量較（0∶1）組升高了80.61%；當(dāng)加入甘草為山豆根的倍量（2∶1）后，苦參堿含量、氧化苦參堿含量、苦參堿和氧化苦參堿總量均顯著降低，氧化苦參堿含量下降了62.09%，苦參堿和氧化苦參堿總量略高于2015版中國(guó)藥典對(duì)山豆根藥材飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的最低要求。

3 討論

山豆根中含有生物堿、槲皮素、多糖等多種活性成分[11]，其中苦參堿和氧化苦參堿既是有效成分[1，12-13]，又是毒性成分[14]。目前對(duì)于山豆根藥材的功效、毒性和物質(zhì)基礎(chǔ)3者之間的關(guān)聯(lián)性尚不完全明確。臨床用藥時(shí)，如何能夠有效達(dá)到增效減毒的安全用藥目的，具有極其重要的意義。

本次實(shí)驗(yàn)建立HPLC法測(cè)定山豆根飲片水煎液中苦參堿、氧化苦參堿的含量，以乙腈-無(wú)水乙醇-3%磷酸溶液（80∶10∶10）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，流速為0.8 mL/min，柱溫35.0℃為色譜條件，方法學(xué)考察結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。摸索色譜條件過(guò)程中，比較和調(diào)整了流動(dòng)相的流速，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，基線平穩(wěn)，成分分離效果好。

山豆根藥材中生物堿的含量與藥材的產(chǎn)地[15]、生長(zhǎng)年限[16]等因素相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定3批不同產(chǎn)地山豆根飲片水煎劑溶液中苦參堿和氧化苦參堿的含量，結(jié)果苦參堿和氧化苦參堿總量均符合藥典標(biāo)準(zhǔn)，其含量的由高到低順序?yàn)閺V西、廣東、云南。由于廣西產(chǎn)山豆根飲片水煎劑中苦參堿和氧化苦參堿總量是藥典標(biāo)準(zhǔn)最低限的2.267 5倍，提示即使在藥典3～6 g的規(guī)定安全用量范圍內(nèi)，仍存在較大的產(chǎn)生不良反應(yīng)及中毒風(fēng)險(xiǎn)。

在植物體內(nèi)或中藥復(fù)方中，由于加熱煎煮、藥物配伍、還原性物質(zhì)的存在等因素的影響，苦參堿和氧化苦參堿兩者之間存在氧化還原的動(dòng)態(tài)變化[17-19]。本研究比較不同比例甘草配伍對(duì)山豆根與水煎劑中苦參堿、氧化苦參堿含量的影響，結(jié)果顯示：1）廣西產(chǎn)的山豆根藥材，當(dāng)配伍等量甘草（1∶1）時(shí)，其水煎劑中含有的苦參堿含量升高了80.61%，其余2批山豆根藥材按此比例配伍后，苦參堿含量也略有升高，聶安政[20]認(rèn)為苦參堿是引起山豆根毒性反應(yīng)的主要化學(xué)物質(zhì)，張宏利等[21-22]、戴五好等[23]通過(guò)對(duì)小鼠的藥理活性實(shí)驗(yàn)得出苦參堿毒性大于氧化苦參堿的結(jié)論，提示在以苦參堿和氧化苦參堿的總量為檢測(cè)指標(biāo)的同時(shí)，應(yīng)該注意密切監(jiān)測(cè)苦參堿的含量變化。2）不同產(chǎn)地、藥效成分含量差異明顯的3批山豆根藥材飲片，當(dāng)加入倍量甘草配伍后（甘草與山豆根2∶1），其水煎劑溶液中氧化苦參堿的含量、苦參堿和氧化苦參堿的總量均能夠顯著降低，與潘雙鳳[6]等發(fā)現(xiàn)甘草與山豆根以2∶1比例配伍使用時(shí)降低山豆根致小鼠肝損傷程度效果更佳的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，為山豆根的臨床安全使用提供關(guān)于物質(zhì)基礎(chǔ)的有效實(shí)驗(yàn)參考依據(jù)。