類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-21表達(dá)變化及其意義

董小敏，張瑞，郭粉玲，馬亞萍

(咸陽市中心醫(yī)院，陜西咸陽712000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種常見炎癥性自身免疫疾病，臨床主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)功能障礙，致殘率較高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。RA發(fā)病原因較為復(fù)雜，主要是機(jī)體獲得性免疫應(yīng)答失調(diào)，引起免疫功能異常[2]。目前治療RA的目標(biāo)是緩解臨床癥狀、降低疾病活動(dòng)度，其中超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、類風(fēng)濕因子(RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(CCP)、紅細(xì)胞沉降率(ESR)等是臨床診斷及評(píng)價(jià)RA活動(dòng)度的常用指標(biāo)。miRNA在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等方面具有重要作用[3]。研究表明，miR-146a在RA患者中表達(dá)異常，促進(jìn)RA活動(dòng)期的發(fā)展[4]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在RA患者中的表達(dá)與Th17/Treg失衡有關(guān)，但針對(duì)miR-21與RA疾病活動(dòng)度關(guān)系的研究較少。因此，本研究觀察了RA患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中miR-21的表達(dá)變化，并分析其與疾病活動(dòng)度的關(guān)系，以期為RA的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年12月～2018年12月在我院接受治療的RA患者102例納入研究[5，6]。其中男45例，女57例；年齡18～75歲，中位年齡55.07歲；RA活動(dòng)期60例(活動(dòng)期組，活動(dòng)期初發(fā)的RA患者DAS評(píng)分>3.2)、緩解期42例(緩解期組)。排除合并其他自身免疫系統(tǒng)疾病者，合并肝、腎、心臟功能障礙等嚴(yán)重疾病者，合并腫瘤、感染性疾病者，不配合醫(yī)生治療者。選擇同期在本院健康體檢的志愿者50例作為對(duì)照組，男21例、女29例，年齡20～76歲、中位年齡54.59歲。各組受試者性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),受試者均自愿簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本獲取與處理 采集所有受試對(duì)象入院24 h內(nèi)清晨空腹靜脈血6 mL分為2個(gè)管，一管室溫靜置1 h，4 000 r/min離心10 min，吸取上層血清分裝于無菌EP管中，置于-20 ℃冰箱中保存待測；一管分離外周血PBMC。

1.3 外周血PBMC中miR-21檢測 采集血液經(jīng)肝素抗凝，加入等體積PBS混勻;Ficoll淋巴細(xì)胞分離液離心分層，吸取外周血PBMC于離心管中;PBS洗滌3次，收集貼壁細(xì)胞置于含10%～20%胎牛血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)。提取總RNA，檢測其濃度和純度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。以U6為內(nèi)參。miR-21上游引物序列為5′-AGCTGGGTAGCTTATCAGACTGAT-3′，下游引物序列為5′-ACTGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6上游引物序列為5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性60 s,94 ℃ 45 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt表示miR-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 疾病活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo)檢測 采用免疫比濁法檢測血清hs-CRP、RF。采用ELISA法測定血清抗CCP。采用血細(xì)胞自動(dòng)分析儀以魏氏法檢測ESR。按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作，每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取平均值。進(jìn)行疾病病情評(píng)分(DAS28)，DAS28分值范圍為0～10分，分值越高表明疾病活動(dòng)度越高。

1.5 指關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)指標(biāo)檢測 采用彩色多普勒超聲檢查，以血成像和能量圖觀察血供情況?；颊哐雠P位，雙手分開置于檢測臺(tái)上，檢測雙手掌指關(guān)節(jié)、近端指間關(guān)節(jié)，每個(gè)側(cè)面均進(jìn)行縱切面和橫切面掃查，在垂直骨面最厚的地方測量滑膜組織厚度?；ず穸?2 mm為正常，2～5 mm為輕度增生，5～9 mm為中度增生，>9 mm為重度增生?；そM織無血流信號(hào)為0級(jí)，1～2個(gè)點(diǎn)狀血流信號(hào)為1級(jí)，有1～3條小血管為2級(jí)，4條以上且呈網(wǎng)狀分布的血管為3級(jí)。同時(shí)隨機(jī)選取滑膜內(nèi)的動(dòng)脈采用彩色血流進(jìn)行脈沖多普勒取樣，當(dāng)滑膜內(nèi)動(dòng)脈的血流頻譜顯示清楚后測量血流的收縮期峰值流速(Vmax)，舒張末期流速(Vmin)，記錄并自動(dòng)計(jì)算滑膜動(dòng)脈RI值。RI=(Vmax-Vmin)/Vmax，可多次取樣，均測量2次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 三組外周血PBMC中miR-21表達(dá)比較 活動(dòng)期組、緩解期組、對(duì)照組外周血PBMC中miR-21相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.03、0.52±0.06、1.31±0.22，活動(dòng)期組低于緩解期組，緩解期組低于對(duì)照組，兩兩相比，P均<0.05。

2.2 三組疾病活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo)及指關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)指標(biāo)比較 活動(dòng)期組血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28評(píng)分、滑膜厚度、滑膜血流分級(jí)、滑膜動(dòng)脈RI高于緩解期組(P均<0.05)，且緩解期組各指標(biāo)均高于對(duì)照組(P均<0.05)。見表1。

表1 三組疾病活動(dòng)度相關(guān)指標(biāo)及指關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)指標(biāo)比較

注：與對(duì)照組相比，*P<0.05；與緩解期組相比，△P<0.05。

2.3 miR-21表達(dá)與RA活動(dòng)期患者疾病活動(dòng)度指標(biāo)、指關(guān)節(jié)炎癥指標(biāo)的相關(guān)性 RA活動(dòng)期患者外周血PBMC中miR-21與血清hs-CRP、RF、ESR水平及DAS28評(píng)分、滑膜厚度呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.621、-0.639、-0.657、-0.515、-0.559，P均<0.05)，與抗CCP水平、滑膜血流分級(jí)、滑膜動(dòng)脈RI無顯著相關(guān)性(r分別為-0.251、0.137、0.125，P均>0.05)。

2.4 miR-21對(duì)RA活動(dòng)期的診斷價(jià)值 miR-21截?cái)嘀禐?.93，診斷RA活動(dòng)期的ROC曲線下面積(AUC)為0.907，敏感度為91.94%，特異度為88.10%，約登指數(shù)為0.800。

3 討論

RA病變關(guān)節(jié)腔聚集大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，引起關(guān)節(jié)滑膜、周圍結(jié)締組織異常增生，大量新生血管和炎細(xì)胞浸潤[6]。RA以慢性、侵蝕性關(guān)節(jié)滑膜炎為特征，進(jìn)而侵犯關(guān)節(jié)軟骨，韌帶、肌腱、軟骨下骨等，導(dǎo)致骨、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)囊破壞，造成關(guān)節(jié)畸形及功能喪失，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[7]。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，多種細(xì)胞因子參與RA的發(fā)生發(fā)展[8]。

miRNA是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控多種細(xì)胞因子表達(dá)，參與多種炎癥性疾病[9]。近年來研究表明miRNA調(diào)控人類約1/3的基因，在維持免疫功能、調(diào)控免疫系統(tǒng)等方面發(fā)揮重要作用[10]。異常表達(dá)的miRNA可能與腫瘤、慢性炎癥、自身免疫性疾病的發(fā)病相關(guān)。miR-21的編碼基因位于液泡膜蛋白基因的編碼區(qū)，具有抑制多種細(xì)胞凋亡的作用[11]。在結(jié)直腸癌中，miR-21通過抑制PDCD4的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞浸潤，抑制細(xì)胞凋亡[12]。在哮喘中，miR-21調(diào)控炎癥因子的表達(dá)，在氣道重塑中發(fā)揮重要作用[13]。Dong等[14]報(bào)道，RA患者miR-21表達(dá)異常降低與Th17/Treg失衡相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，RA活動(dòng)期患者外周血PBMC中miR-21表達(dá)降低，且低于緩解期患者，提示miR-21與RA發(fā)病及疾病活動(dòng)度存在密切聯(lián)系。

hs-CRP在機(jī)體發(fā)生炎癥或組織損傷時(shí)水平顯著升高，可反映炎癥嚴(yán)重程度[15]。RF為RA敏感性標(biāo)志物，但特異性稍差[16]?？笴CP特異性高于RF，因此抗CCP與RF聯(lián)合診斷RA有助于降低誤診率。研究報(bào)道，抗CCP陽性患者發(fā)生侵蝕性關(guān)節(jié)炎的風(fēng)險(xiǎn)高于陰性患者，其不僅可作為RA早期臨床診斷指標(biāo)，還可作為RA患者骨關(guān)節(jié)破壞的預(yù)測指標(biāo)[17]。ESR是評(píng)價(jià)RA活動(dòng)期的重要指標(biāo)之一。炎癥活動(dòng)期時(shí)炎癥因子水平增加，紅細(xì)胞易發(fā)生聚集，ESR水平因此升高[18]。RA活動(dòng)期超聲檢查表現(xiàn)為低回聲，這與患病關(guān)節(jié)滑膜異常增生有關(guān)[19]?；ぴ錾鹧鞴嘧⒃龆嗉把苓^度增生，而滑膜內(nèi)血流信號(hào)異常是RA的特征性變化[20]。RI是反映舒張期血流的指標(biāo)，可作為評(píng)估RA病情的重要指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，RA活動(dòng)期患者血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR及DAS28評(píng)分、滑膜厚度、滑膜血流分級(jí)、滑膜動(dòng)脈RI顯著高于緩解期患者，且緩解期患者各指標(biāo)均顯著高于對(duì)照組，表明血清hs-CRP、RF、抗CCP、ESR、DAS28評(píng)分可用于RA的早期診斷和活動(dòng)度評(píng)估，且超聲檢查對(duì)臨床診斷RA及疾病活動(dòng)度評(píng)估也有一定價(jià)值。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-21與RA活動(dòng)期患者h(yuǎn)s-CRP、RF、ESR、DAS28評(píng)分、滑膜厚度呈負(fù)相關(guān)，表明外周血PBMC中miR-21水平有助于反映RA疾病活動(dòng)度。ROC曲線分析顯示，miR-21截?cái)嘀禐?.93時(shí)診斷RA活動(dòng)期的敏感度和特異度均較高，提示檢測外周血PBMC中的miR-21有助于RA的早期診斷及活動(dòng)度評(píng)估。

綜上所述，RA患者外周血PBMC中miR-21表達(dá)顯著降低，且與多種疾病活動(dòng)度指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)，miR-21檢測有助于RA的診斷及疾病活動(dòng)度評(píng)估。