IgA腎病患者腎組織中鞘氨醇激酶1及α-平滑肌肌動蛋白表達觀察

劉佳麗，李沁蕓，楊琨，劉曉惠

(1川北醫(yī)學(xué)院，四川南充637000；2川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

IgA腎病(IgAN)是我國常見的原發(fā)性腎小球疾病，30%～40%的IgAN患者表現(xiàn)為慢性進展病程，15%～20%的IgAN患者在發(fā)病10～20年后逐漸發(fā)展為終末期腎病(ESRD)[1，2]。IgAN發(fā)病機制尚不完全清楚，有研究表明系膜區(qū)IgA及其免疫復(fù)合物的沉積與異常糖基化、氧化應(yīng)激、先天免疫等有關(guān)，并且IgA沉積伴隨系膜細胞增生，與腎小球的病理變化相一致[3～6]。因此，多種原因引起的腎小球系膜細胞增殖是IgAN的一個重要病理標(biāo)志。近年來，鞘氨醇激酶1(SphK1)在腎病中的作用備受關(guān)注，其與系膜細胞增殖有關(guān)。SphK是一種高度保守的脂類激酶，有SphKl和SphK2兩種細胞亞型。SphK1催化鞘氨醇(Sp)生成1-磷酸鞘氨醇(S1P)。S1P與受體結(jié)合后激活下游信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞增殖活性、細胞運動活性等作用。研究發(fā)現(xiàn)，IgAN小鼠模型腎皮質(zhì)中SphK1、S1P高表達，并且與α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)表達呈正相關(guān)[7]。α-SMA是系膜細胞被激活、由靜止表型向增殖表型轉(zhuǎn)化的重要標(biāo)志蛋白之一[8]。因此，SphK1與α-SMA的相關(guān)性提示SphK1可能在IgAN系膜細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。本研究觀察了IgAN患者腎組織中SphK1、α-SMA的表達變化，并分析SphK1與α-SMA及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性，探討SphK1在IgAN發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 組織來源 選取2014年10月～2016年6月在川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腎內(nèi)科住院、行腎穿刺病理檢查確診為IgAN的患者18例，其中男10例、女8例，年齡18～53歲，中位年齡32.5歲，取病腎組織納入實驗組。實驗組血肌酐(77.35±27.24)μmol/L，尿素氮(6.35±0.86)mmol/L，24 h尿蛋白(2 094.37±1 893.55)mg/L。同期行手術(shù)治療的腎癌患者5例，男3例、女2例，年齡37～43歲，中位年齡38歲，取病理證實的癌旁正常腎組織納入對照組。排除糖尿病腎病、紫癜性腎炎等繼發(fā)性腎小球疾病患者，干燥綜合征、硬皮病等其他自身免疫性疾病患者，近6個月內(nèi)使用免疫抑制劑、腎毒性藥物及激素者。本研究符合醫(yī)院倫理委員會要求，所有入選患者均簽署知情同意書。兩組患者的性別、年齡資料具有可比性。兩組腎組織通過固定、漂洗、脫水、浸蠟、包埋后制成4 μm厚切片，所有切片中腎小球數(shù)目不少于5個。將石蠟切片放置于4 ℃冰箱保存。

1.2 腎組織中SphK1、α-SMA檢測 采用免疫組化法。取兩組組織標(biāo)本，37 ℃下二甲苯脫蠟10 min×2次。100%、95%、85%、75%梯度乙醇水化，再用蒸餾水沖洗3 min。將切片放置3%H2O2中，室溫25 min，以封閉內(nèi)源性過氧化氫酶，蒸餾水沖洗約3 min。將切片置于枸櫞酸鈉修復(fù)液(pH 6.0)中，高溫高壓抗原修復(fù)3 min(在高壓鍋中水煮沸后再放切片至修復(fù)液中)，壓力鍋離開熱源，放置10 min后用自來水沖洗使之冷卻，去閥開蓋，室溫放置20 min自然冷卻。PBS沖洗3次，每次3 min。去PBS液，每張切片滴加適當(dāng)稀釋的一抗(SphK1 1∶200，α-SMA 1∶300)1滴(約50 μL)，4 ℃過夜(16～18 h)。4 ℃過夜后無需沖洗，直接置入37 ℃恒溫箱復(fù)溫30～40 min，PBS沖洗3次，每次5 min。除去多余的PBS液，每張切片滴加非生物素標(biāo)記的二抗1滴(約50 μL)，37 ℃下孵育15 min。PBS沖洗3次，每次5 min。每張切片滴加新鮮配置的DAB 1～2滴，室溫下顯色5 min。蘇木素復(fù)染約1 min，自來水沖洗，用1%鹽酸分化，氨水返藍，再以梯度乙醇75%、85%、95%脫水，放置通風(fēng)處晾干。中性快貼樹膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作陰性對照。SphK1、α-SMA陽性表達以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕紅色顆粒為標(biāo)志，不著色為陰性。用Image Pro Plus圖像分析軟件進行分析，用HIS模式將陽性目標(biāo)從背景中分離出來，用平均光密度值(IOD值)代表目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 兩組腎組織中SphK1、α-SMA表達比較 實驗組腎組織中SphK1、α-SMA相對表達量分別為34.73±7.37、44.47±8.51，對照組分別為18.65±2.30、19.85±2.96，實驗組SphK1、α-SMA相對表達量均高于對照組(P均<0.05)。見圖1。

注：A、B分別為實驗組、對照組腎組織中SphK1表達情況；C、D分別為實驗組、對照組腎組織中α-SMA表達情況。

圖1兩組腎組織中SphK1、α-SMA表達情況(IHC染色，200×)

2.2 實驗組SphK1表達與α-SMA及腎功能指標(biāo)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，實驗組SphK1表達與α-SMA表達、24 h尿蛋白、血肌酐水平呈正相關(guān)(r分別為0.61、0.70、0.51，P分別為0.007、0.001、0.029)；SphK1表達與尿素氮水平無直線相關(guān)關(guān)系(r=0.13，P=0.600)。見圖2～5。

圖2 IgAN患者腎組織SphK1表達與α-SMA表達的相關(guān)性

圖3 IgAN患者腎組織SphK1表達與24 h尿蛋白水平的相關(guān)性

圖4 IgAN患者腎組織SphK1表達與血肌酐水平的相關(guān)性

3 討論

多種原因引起的腎小球系膜細胞增殖是IgAN的一個重要病理標(biāo)志。近年來，多項研究對SphK1在腎病中的作用進行了探索，認為其與系膜細胞增殖有關(guān)。Obinata于1998年首次從大鼠腎臟純化提取出SphK[9]，其在人體中存在兩種細胞亞型，即SphKl、SphK2。SphK1促進細胞存活并抑制細胞凋亡，SphK2的作用則相反。研究發(fā)現(xiàn)，SphK1/S1P可刺激腎小球系膜細胞增殖[10]。Katsuma等[11]在IgA小鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)SphK1及S1P高表達，S1P與表面受體S1PR2結(jié)合后通過高敏G蛋白途徑刺激系膜細胞增生。結(jié)合既往研究結(jié)果，我們推測SphK1可能在IgAN系膜細胞增殖過程中發(fā)揮著重要作用。

圖5 IgAN患者腎組織SphK1表達與尿素氮水平的相關(guān)性

本研究通過免疫組化法檢測了IgAN患者腎組織中的SphK1，結(jié)果顯示，實驗組腎組織中SphK1表達水平高于對照組。這提示IgAN發(fā)病過程中可能有SphK1的參與，與IgAN小鼠相關(guān)研究結(jié)果一致。除此之外，本研究結(jié)果還顯示，IgAN患者腎組織中α-SMA表達升高，SphK1與α-SMA表達呈正相關(guān)。α-SMA是肌成纖維細胞的標(biāo)志性蛋白，在腎臟纖維化進展中發(fā)揮重要作用。近年來，有學(xué)者在IgAN小鼠腎組織中發(fā)現(xiàn)，系膜細胞增殖活躍時，大量分泌系膜基質(zhì)，表現(xiàn)為增殖-分泌型，α-SMA表達陽性；而且，隨著系膜細胞增殖，細胞內(nèi)SphK1表達增加，與α-SMA呈正相關(guān)[12]。本研究結(jié)果與上述研究相一致，提示SphK1、α-SMA均與系膜細胞增殖密切相關(guān)，SphK1可能在IgAN腎小球系膜細胞表型改變的過程中有一定作用。

為進一步探索SphK1與IgAN的關(guān)系，我們對IgAN患者腎組織中SphK1表達與24 h尿蛋白、血肌酐、尿素氮水平的相關(guān)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SphK1與24 h尿蛋白、血肌酐呈正相關(guān)，與尿素氮無直線相關(guān)關(guān)系。24 h蛋白尿及血肌酐是預(yù)測及評估腎功能損害嚴(yán)重程度的重要指標(biāo)[13，14]。本研究結(jié)果提示，SphK1表達水平在一定程度上可反映腎臟損害程度。本研究中SphK1表達與尿素氮水平無直線相關(guān)關(guān)系，其原因可能與尿素氮本身性質(zhì)有關(guān)。尿素氮是體內(nèi)蛋白質(zhì)的分解產(chǎn)物，其血清水平受高蛋白飲食、高分解代謝狀態(tài)等多種因素影響，波動性較大。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，IgAN患者腎組織中SphK1、α-SMA高表達，且SphK1表達與α-SMA表達、24 h尿蛋白、血肌酐水平存在相關(guān)性。SphK1可能參與了IgAN的發(fā)病，并與腎臟損害程度有關(guān)。然而本研究樣本量較少，今后還需加大樣本量進一步證實SphK1與IgAN發(fā)病的關(guān)系，并進行相關(guān)機制探討。