雷蒙德氏棉MAPKKK基因家族全基因組篩選及其同源基因在陸地棉中表達分析

許好標，李黎貝，張馳，馮震，喻樹迅，*

（1.浙江農(nóng)林大學(xué)/ 省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室，杭州311300；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點實驗室，河南安陽455000）

MAPK 級聯(lián)途徑由絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）、 絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶（MAPK kinase，MAPKK）和絲裂原活化蛋白質(zhì)激酶激酶激酶（MAPKK kinase，MAPKKK）三級激酶級聯(lián)組成，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)廣泛存在于真核生物包括酵母、哺乳動物、人類及植物中[1-2]。在真核生物（酵母、動物和植物）典型的MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)途徑中，上游激活的MAPKKK 磷酸化MAPKK 將其激活，再由MAPKK 磷酸化 MAPK 將其激活，激活的 MAPK 與轉(zhuǎn)錄因子或其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件相互作用，調(diào)控下游基因的表達[3-4]。在植物中，MAPK 級聯(lián)途徑與生物及非生物脅迫反應(yīng)、激素反應(yīng)、細胞分化和發(fā)育過程相關(guān)[5-8]。目前通過對基因組數(shù)據(jù)的分析，在擬南芥（Arabidopsis thalianaL.）中已鑒定出2 個MAPK、10 個MAPKK和 80 個MAPKKK基因； 水稻 （Oryza sativaL.） 中鑒定出 17 個MAPK、8 個MAPKK和 75 個MAPKKK基因[9-10]；雷蒙德氏棉 （Gossypium raimondiiL.） 中鑒定出78 個MAPKKK基因[11]。研究表明，MAPKKK基因較多，在植物中通過序列比對和進化分析可以把MAPKKK基因分為 3 類，包括Raf亞家族、ZIK亞家族和MEKK亞家族[9,12]。許多研究表明，MAPKKK基因在植物信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起很重要的調(diào)控作用，例如擬南芥Raf亞家族的組成型三重反應(yīng)因子-1 基因（Constitutive-triple response1 gene，CTR1） 在乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要的負調(diào)控作用[13]，而棉花纖維的伸長與乙烯有緊密的聯(lián)系[14]。Yin 等[11]對雷蒙德氏棉MAPKKK基因在纖維起始期和成熟葉片中的表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)在不同組織中表達量存在明顯的差異，其中雷蒙德氏棉3 個CTR1 的同源基因在開花后 3 d（3 days post anthesis，3 DPA）的胚珠中的表達量明顯高于0 DPA 的胚珠，表明這3 個基因可能涉及棉花纖維細胞伸長機制。與CTR1 相似的抗病性增強基因1 （Enhanced disease resistance1 gene，EDR1） 可以負調(diào)控水楊酸誘導(dǎo)的防御反應(yīng)[15-16]。在水稻中Raf亞家族的干旱超敏基因1（Drought-hypersensitive mutant 1 gene,DSM1）可以通過清除活性氧來調(diào)節(jié)水稻的耐旱性[17]。在玉米（Zea maysL.）中過表達煙草蛋白激酶1 基因（Nicotiana protein kinase1 gene，NPK1）可以增強植株的耐旱性[18]。通過病毒誘導(dǎo)基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS） 技術(shù)，獲得轉(zhuǎn)GhRaf19 基因棉花植株，發(fā)現(xiàn)其對干旱和鹽脅迫的耐受性增強[19]。在擬南芥中，Ichimura 等[20]和Hadiarto 等[21]證明AtMEKK1 基因的產(chǎn)物能夠傳遞干旱和機械損傷信號。在干旱脅迫下，葡萄（Vitis viniferaL.）VvMEKK基因均上調(diào)表達，表明葡萄VvMEKK基因積極響應(yīng)干旱脅迫[22]。大豆（Glycine max（Linn.） Merr.） 根 中GmMEKK基因受低磷和干旱脅迫后上調(diào)表達[23]。ZIK 也被稱作WNK（With no lysine），在進化關(guān)系上與其他2個亞家族較遠。擬南芥WNK1 基因參與晝夜節(jié)律的調(diào)控，WNK2/8 基因可以調(diào)控開花時間[24]。水稻OsWNK1 基因在應(yīng)對非生物脅迫中有重要作用，而且和晝夜節(jié)律有關(guān)[25]。目前這些MAPKKK基因功能的研究大多局限于擬南芥、水稻、玉米等植物。

陸地棉（G.hirsutumL.，AADD)是種植面積及經(jīng)濟價值最大的棉花栽培種。雷蒙德氏棉被認為是陸地棉D(zhuǎn) 染色體組的供體種，其基因組序列已公布[26-27]?；蚪M序列的公布，使得利用生物信息學(xué)手段大規(guī)模分析棉花基因功能成為可能，目前僅有幾個有關(guān)棉花MAPK和MAPKK基因的報道[9,28-32]，而全基因組水平上研究棉花MAPKKK基因報道較少。Yin 等[11]利用 Wang 等[26]發(fā)表的雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘了78 個MAPKKK家族基因。本研究在此基礎(chǔ)上，利用Paterson 等[27]發(fā)表的雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，分析鑒定MAPKKK基因家族的全部成員，從基因組水平上分析這些MAPKKK基因的進化關(guān)系、 結(jié)構(gòu)特征、染色體分布以及表達模式；并對2 個數(shù)據(jù)庫所獲得發(fā)掘基因序列的結(jié)果進行比較，以期更準確地篩選出MAPKKK基因，并相互佐證2 個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫所獲得的一些研究結(jié)果，為棉花MAPKKK家族基因及其功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載

雷蒙德氏棉（G.raimondiiL.）全基因組數(shù)據(jù)下載自http://www.phytozome.net/，擬南芥與水稻MAPKKK 氨基酸序列下載自 TAIR（http://arabidopsis.org/）、RGAP （http://rice.plantbiology.msu.edu）和 GeneBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）。陸地棉基因芯片數(shù)據(jù)源于 NCBI Gene Expression Omnibus （GEO） 平臺 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），登錄號為 GSE50770 和GSE36228。陸地棉芯片探針來自Affymetrix 基因芯片（http://www.affymetrix.com/）。

1.2 雷蒙德氏棉MAPKKK基因家族成員的鑒定

首先利用雷蒙德氏棉全基因組序列，構(gòu)建本地BLAST 數(shù)據(jù)庫，以擬南芥和水稻MAPKKK氨基酸序列為種子序列運行本地BLAST 搜索；所得結(jié)果利用SMART （http://smart.embl-heidelberg.de/）及 Pfam（http://pfam.sanger.ac.uk/search）工具進行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測[32-33]，確認得到雷蒙德氏棉中 MAPKKK 蛋白家族。利用 ExPASy Proteomics Server （http://web.expasy.org/protparam）預(yù)測雷蒙德氏棉MAPKKK 蛋白氨基酸序列的基本信息，包括蛋白質(zhì)的長度、相對分子質(zhì)量以及等電點[34]。通過在線軟件 WoLFPSORT（http://wolfpsort.org）進行亞細胞定位分析。

1.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建與蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域序列比對分析

通過ClustalW[35]程序?qū)M南芥、水稻和雷蒙德氏棉MAPKKK 蛋白進行多序列聯(lián)配比對分析，序列聯(lián)配比對結(jié)果使用MEGA5（https://www.megasoftware.net）[36]程序采用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ） 生成 MAPKKK 蛋白的系統(tǒng)進化樹，校驗參數(shù)Bootstrap 重復(fù)1 000 次。采用DNAMAN生物學(xué)軟件進行保守結(jié)構(gòu)域序列比對。

1.4 MAPKKK基因結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

MAPKKK基因結(jié)構(gòu)圖利用在線工具GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）[37]繪制。利用 Mapchart2.2軟件進行染色體定位作圖。

1.5 MAPKKK基因表達特征分析

以雷蒙德氏棉MAPKKK基因?qū)﹃懙孛尢结樞蛄羞M行BLAST 比對，選取匹配E-value 值最高的探針代表MAPKKK家族基因，利用 NCBI Gene Expression Omnibus database 基因芯片平臺的GSE50770 和GSE36228 芯片數(shù)據(jù)搜索匹配探針代表MAPKKK基因的表達量，進行基因表達量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷蒙德氏棉MAPKKK基因家族成員鑒定

從雷蒙德氏棉全基因組中鑒定到114 個MAPKKK基因家族成員（表 1）。通過 SMART 及PFam 工具進行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析，114 個雷蒙德氏棉MAPKKK 蛋白均含有保守的蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。通過ExPASy 工具，對雷蒙德氏棉MAPKKK基因進行了相對分子質(zhì)量、等電點及亞細胞定位等生化屬性分析，最長的雷蒙德氏棉MAPKKK蛋白GrRaf44 包含1 403 個氨基酸殘基，最短的GrZIK1 蛋白僅有296 個氨基酸殘基，它們的相對分子質(zhì)量在33.82 kDa（GrZIK7）到 151.51 kDa（GrRaf44）之間，等電點分布在 4.65（GrMEKK2）到 9.43（GrRaf48）之間（表 1）。根據(jù) WoLFPSORT預(yù)測的亞細胞定位結(jié)果 （表1），61 個MAPKKK蛋白定位到細胞核中（占到總數(shù)的53.51%），有可能參與某些基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控；定位在細胞質(zhì)和葉綠體的分別有25 和21 個，分別占總數(shù)的21.93%和18.42%；定位在線粒體、細胞膜、細胞骨架、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的總共有7 個，占總數(shù)的6.14%。

2.2 雷蒙德氏棉和擬南芥MAPKKK家族的進化分析、保守結(jié)構(gòu)域和基因結(jié)構(gòu)分析

將上述獲得的114 個雷蒙德氏棉MAPKKK蛋白序列與80 個擬南芥MAPKKK 蛋白序列進行多重序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。參照擬南芥研究結(jié)果[9]，MAPKKK 蛋白可分成 3 個亞家族，命名為 Raf、ZIK 和 MEKK。Raf 亞家族包含 113 個成員，其中雷蒙德氏棉、擬南芥分別有65 個和48個（圖1A）；MEKK 亞家族有 58 個成員，其中雷蒙德氏棉、擬南芥分別有37 個和21 個（圖2A）；ZIK 亞家族有23 個成員，其中雷蒙德氏棉、擬南芥分別有 12 個、11 個（圖3A）。對雷蒙德氏棉中這3 個亞家族的MAPKKK 氨基酸序列比對分析發(fā)現(xiàn)，Raf 亞家族含有保守的 GTxx（W/Y）MAPE基序（圖1C），組成了進化樹中最大的一個分支；MEKK 亞家族含有保守的 G（T/S）Px（W/F）MAPEV基序（圖2C）；ZIK 亞家族含有保守的GTPEFMAPE（L/V）Y 基序（圖3C），是 MAPKKK 家族中最小的亞家族。分析預(yù)測這些MAPKKK基因全長序列和編碼區(qū)序列的基因結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)3 個亞家族內(nèi)成員的基因結(jié)構(gòu)存在一定的差異性，但與系統(tǒng)進化樹的遠近關(guān)系一致。Raf亞家族的成員最多，基因結(jié)構(gòu)也最為復(fù)雜，外顯子數(shù)目為2～18 個（圖1B）；MEKK亞家族大部分基因含有 8～19 個外顯子，且 8 個無內(nèi)含子（圖 2B）；ZIK亞家族的基因結(jié)構(gòu)相對簡單，有3 個基因含有2 個外顯子，其余有6～8 個外顯子（圖3B）。

表1 雷蒙德氏棉中MAPKKK 基因家族信息Table 1 Characteristics of MAPKKK in Gossypium raimondii

表1 （續(xù)）Table 1 (Continued)

表1 （續(xù)）Table 1 (Continued)

表1 （續(xù)）Table 1 (Continued)

2.3 雷蒙德氏棉中MAPKKK基因的染色體定位和基因加倍分析

獲取鑒定出的雷蒙德氏棉MAPKKK家族基因的染色體位置信息，繪制了染色體定位圖（圖4）。發(fā)現(xiàn)這 114 個MAPKKK家族基因分布于雷蒙德氏棉13 條染色體上。其中：9 號染色體上包含的MAPKKK基因數(shù)量最多，有16 個成員；其次是5 號染色體分布有14 個MAPKKK基因，10號染色體上MAPKKK家族基因數(shù)目最少，僅有4 個；12、13 號染色體各有 5 個MAPKKK基因；3、4 號染色體各有 7 個MAPKKK基因；1、2、11、8、7、6 號染色體分別有 6、6、9、10、12、13 個MAPKKK基因?；蚣颖妒录蚣易宄蓡T的擴增起重要作用，通常判斷發(fā)生基因復(fù)制事件的標準有2 點：（1） 長度的覆蓋率在 80%以上；（2）蛋白序列比對相似度在 70%以上[38-40]。分析了這些雷蒙德氏棉MAPKKK基因的基因加倍關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)114 個MAPKKK基因形成了26 對（GrZIK1/11、GrRaf1/47、GrRaf57/58、GrRaf4/33、GrRaf20/21、GrRaf16/30、GrMEKK1/14、GrRaf10/35、GrRaf22/51、GrMEKK21/35、GrMEKK10/27、GrRaf50/54、GrZIK3/9、GrRaf12/38、GrMEKK8/28、GrRaf44/55、GrRaf27/32、GrMEKK3/33、GrZIK2/10、GrMEKK25/30、GrMEKK11/23、GrRaf48/59、GrRaf15/37、GrMEKK12/36、GrRaf26/42、GrRaf8/53）及 1 組（GrRaf2/56/46）同源基因?qū)? 組（圖1A、圖 2A、圖3A）。其中除GrRaf20/21 外的 25 對和GrRaf2/56/46 定位在不同的染色體上，形成片段加倍，而GrRaf20/21 分布在雷蒙德氏棉5 號染色體上，形成串聯(lián)重復(fù)，并且這些基因?qū)哂邢嗨频耐怙@子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，這些結(jié)果暗示加倍事件對于雷蒙德氏棉MAPKKK成員的擴增起到關(guān)鍵作用。

2.4 雷蒙德氏棉MAPKKK基因在棉纖維發(fā)育各時期及響應(yīng)脅迫誘導(dǎo)的表達分析

圖1 雷蒙德氏棉Raf 亞家族進化樹、氨基酸序列比對及其編碼基因結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Phylogenetic tree, phylogenetic relationship and gene structure of Raf subfamily genes from G.raimondii

圖2 雷蒙德氏棉MEKK 家族進化樹、氨基酸序列比對及其編碼基因結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Phylogenetic tree, phylogenetic relationship and gene structure of MEKK subfamily genes from G.raimondii

利用 NCBI Gene Expression Omnibus（GEO）database 公布的陸地棉芯片數(shù)據(jù)，在棉花纖維發(fā)育起始期、 伸長期和次生壁加厚期不同時期（0、6、9、12、19 和 25 DPA），分析了這些MAPKKK基因的表達量（圖 5A），GrZIK1、GrRaf1、GrRaf37和GrRaf62 這4 個MAPKKK基因在纖維發(fā)育過程中表達量最高，其中GrRaf1 在0 和6 DPA 表達要高于其他時期，說明其可能在纖維的起始和伸長的前期發(fā)揮某種作用，相反的是GrZIK1 在12、19 和 25 DPA 相對高表達，說明其可能在纖維伸長的后期及次生壁增厚期發(fā)揮重要作用；GrZIK3 等15 個基因表達值最弱，說明它們可能在纖維發(fā)育過程中發(fā)揮的作用較小； 其余MAPKKK基因在纖維中表達適中，并且部分具有相似的表達模式（GrZIK2、GrRaf14 和GrMEKK27），說明它們可能具有功能冗余，需要進一步研究。已有較多的研究表明MAPKKK可以響應(yīng)非生物環(huán)境刺激。本研究也分析了這些雷蒙德氏棉MAPKKK基因響應(yīng)不同脅迫處理的表達模式，包括堿（Alkalinity）、鹽（Salinity）、干旱（Drought）及脫落酸（Abscisic acid，ABA）處理，結(jié)果顯示：在堿、干旱和ABA 脅迫下，約一半的MAPKKK基因表達發(fā)生上調(diào)，其中MEKK30 和MEKK16相比于對照上調(diào)表達最顯著，其余MAPKKK基因表達較低程度下調(diào)或不變，說明MAPKKK基因可以較好響應(yīng)堿、 干旱和ABA 這3 種非生物脅迫，并且在調(diào)控途徑中可能具有某些交集；在鹽脅迫和冷脅迫下，大多數(shù)MAPKKK基因表達較低程度下調(diào)或者不變，只有少數(shù)MEKK基因（MEKK30 和MEKK7）表達較高程度上調(diào)，說明棉花MAPKKK基因響應(yīng)鹽脅迫和冷脅迫的程度較差。值得一提的是，MEKK30 在這5 種非生物脅迫下表達都上調(diào)，說明其可能在響應(yīng)非生物環(huán)境刺激中發(fā)揮重要作用；MEKK7 在鹽和冷脅迫下表達上調(diào)，堿、干旱和ABA 脅迫下表達不變，而MEKK16 和MEKK26 卻恰恰相反，說明不同MAPKKK基因在響應(yīng)不同非生物脅迫時有的具有相似的作用，有的具有不同的功能（圖5B）。

圖4 雷蒙德氏棉MAPKKK 基因在染色體上的位置Fig.4 Chromosomal distributions of MAPKKK genes in G.raimondii genome

圖5 雷蒙德氏棉中MAPKKK 基因在纖維發(fā)育過程（A）和不同脅迫處理（B）的表達圖譜Fig.5 Expression profiles of the G.raimondii MAPKKK genes at different stages (A)and under various abiotic stresses (B)

2.5 2個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫中MAPKKK基因的比較分析

Yin 等[11]利用 Wang 等[26]發(fā)表的雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘了78 個MAPKKK家族基因（圖6 中的Ⅰ＋Ⅱ）；本研究利用 Paterson 等[27]發(fā)布的雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，發(fā)掘了114 個MAPKKK家族基因（圖6 中的Ⅱ＋Ⅲ）。利用本地Blastp 對2 個數(shù)據(jù)庫新發(fā)掘的MAPKKK基因序列進行比對，其中47 個基因序列 （圖6 中的ⅠⅠ）相似度達到了100%，說明在2 個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫共同發(fā)掘到了47 個序列完全相同的MAPKKK基因，另外 98 個MAPKKK基因序列（圖6 中的Ⅰ＋Ⅲ）之間存在差異。這47 個共有MAPKKK基因分布在Raf（24 個）、ZIK（10個）和MEKK（13 個）3 個類群中（表2）。

圖6 2 個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫中MAPKKK基因分布Fig.6 The distribution of MAPKKK genes in different databases of G.raimondii

表2 2 個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫中共有的MAPKKK 基因Table 2 The common MAPKKK genes in different databases of G.raimondii

3 討論與結(jié)論

本研究通過對雷蒙德氏棉進行全基因組生物信息學(xué)分析，共鑒定出雷蒙德氏棉MAPKKK基因的3 個亞家族114 個成員。現(xiàn)有結(jié)果顯示棉花MAPKKK家族基因數(shù)量遠多于擬南芥和水稻中MAPKKK基因的數(shù)量[9,33]，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能是雷蒙德氏棉基因組（750 Mbp）比水稻（389 Mbp）和擬南芥（125 Mbp）基因組龐大。MAPKKK家族基因在棉屬植物中得到了擴增，而這種基因家族成員數(shù)的擴增可能使MAPKKK基因發(fā)揮更廣泛的功能，同時表明雷蒙德氏棉這個家族在進化過程中存在很高的非保守性。已有研究表明，基因復(fù)制和基因分化是物種進化過程中最大的動力[41-42]。在真核生物中，基因復(fù)制會導(dǎo)致基因家族數(shù)目的增多，復(fù)制產(chǎn)生的新基因為生命體功能的分化提供基礎(chǔ)； 復(fù)制的方式包括片段復(fù)制、串聯(lián)復(fù)制和全基因組復(fù)制。且在真核生物中植物產(chǎn)生復(fù)制的概率是最高的[43]。片段和串聯(lián)重復(fù)在MAPKKK 蛋白的多樣性上起不可或缺的作用[44]。本研究發(fā)現(xiàn)1 對雷蒙德氏棉旁系同源基因位于同一條染色體上，起源于串聯(lián)重復(fù)事件；25 對及1 組旁系同源基因位于不同染色體上，基因復(fù)制的產(chǎn)生可能起源于片段復(fù)制事件，說明片段復(fù)制是MAPKKK基因家族成員擴增的主要原因之一。MAPKKK基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，同一亞族的家族成員也存在結(jié)構(gòu)的差異性，例如MEKK亞族中8 個成員（GrMEKK2/7/24/30/32/34/36/37）只有 1 個外顯子（無內(nèi)含子），而GrMEKK29 卻含有19 個外顯子，說明MAPKKK家族基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，復(fù)制時可能發(fā)生了多種可變剪切。

基因的親緣關(guān)系越近表明它們具有相似生物學(xué)功能的可能性越大。因此，雷蒙德氏棉MAPKKK家族中的基因成員可能與進化關(guān)系最近的擬南芥或水稻的MAPKKK基因具有相似功能。Raf亞族中的CTR1 參與乙烯生物合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，是乙烯反應(yīng)負調(diào)控因子基因[13]。因此，進化樹中與CTR1 屬同一組的GrRaf28 可能參與乙烯在雷蒙德氏棉中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。Raf亞族中除了CTR1 外，EDR1 也已被證明在擬南芥受到病害和干旱脅迫時起負調(diào)節(jié)作用[15-16]，而GrRaf15與GrRaf37 在進化樹中與EDR1 存在最高的同源性，推測其可能在病害和干旱脅迫下發(fā)揮重要作用。本研究還通過陸地棉芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，GrMEKK16 在干旱和高堿環(huán)境下高表達，而GrMEKK7 和GrMEKK30 在低溫條件下高表達，推測這些基因與陸地棉抗逆相關(guān)。同樣發(fā)現(xiàn)GrZIK1（MAPKKK2）在陸地棉 12、19 和 25 DPA高表達，顯著高于 0、6 和 9 DPA 的表達量，推測該基因與棉纖維后期發(fā)育相關(guān)；而Yin 等[11]研究認為GrZIK1 （MAPKKK2） 在雷蒙德氏棉中 3 DPA 的表達量要低于0 DPA，推測同一基因在陸地棉和雷蒙德氏棉之間的調(diào)控作用不同?？傊?，MAPKKK基因家族在纖維發(fā)育時期均有不同程度的表達，但是一些基因呈現(xiàn)出相似的表達模式，表明MAPKKK基因在調(diào)控棉花纖維發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用且可能存在功能冗余。此外，部分MAPKKK基因家族在不同非生物環(huán)境脅迫下上調(diào)表達，說明棉花MAPKKK基因可能在響應(yīng)環(huán)境刺激信號途徑中發(fā)揮作用，但其具體功能有待于今后進一步研究。

越來越多的研究表明MAPK 級聯(lián)反應(yīng)在植物發(fā)育和響應(yīng)脅迫的過程中發(fā)揮重要作用[45]。本研究在雷蒙德氏棉中鑒定到114 個MAPKKK家族基因，通過對雷蒙德氏棉、擬南芥、水稻MAPKKK家族基因的進化分析，將其劃分為3 個亞家族，并對每個亞家族的基因結(jié)構(gòu)進行分析，發(fā)現(xiàn)它們編碼保守的蛋白基序，并具有外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，推測該3 個亞家族可能有共同的進化起源。將鑒定到的114 個MAPKKK家族基因與Yin 等[11]鑒定的 78 個MAPKKK家族基因進行序列比對，獲得序列完全相同基因47 個?；蛐酒瑪?shù)據(jù)分析表明，一些MAPKKK基因在棉花纖維發(fā)育時期差異表達，并且在響應(yīng)非生物脅迫中發(fā)揮不同的功能。本研究結(jié)合現(xiàn)有的2 個雷蒙德氏棉基因組數(shù)據(jù)庫，挖掘出了共有的47 個MAPKKK家族基因；芯片分析預(yù)測發(fā)現(xiàn)，其中的部分基因在棉花纖維發(fā)育或響應(yīng)非生物脅迫方面具有重要調(diào)控作用，但尚有待于進一步研究。