GhACT1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Lc基因在棉花幼胚纖維中特異表達(dá)

范小平，范博紅，馬冬菊，衛(wèi)武宵

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

彩色棉因擁有天然彩色纖維的環(huán)保優(yōu)勢(shì)一直以來(lái)受到廣大消費(fèi)者的喜愛，因而多年來(lái)彩色棉選育是棉花研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前運(yùn)用生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行棉花遺傳分析[1]以及彩棉纖維發(fā)育規(guī)律[2]等研究的報(bào)道層出不窮，而利用轉(zhuǎn)基因把色素基因?qū)朊藁ㄒ彩敲藁ɡw維顏色改良研究的重要手段之一。最早的色素基因研究是對(duì)玉米色素合成通路基因的遺傳分析[3]，在此基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)20 多年的探索與研究，陸續(xù)從玉米中發(fā)現(xiàn)了花青素合成所必需的2 組基因：一組是編碼參與花青素合成及生化反應(yīng)酶的結(jié)構(gòu)基因，另一組編碼調(diào)控色素沉積時(shí)空分布的蛋白。這些基因的編碼產(chǎn)物分別屬于MYB 類的C1 家族和MYC 類的R 家族[4]。Lc基因則屬于花青素合成必需的MYC 類的R 家族基因，編碼1 個(gè)基本的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄活性因子，在花青素生物合成通路中起作用，具有調(diào)控植物體中花青素的時(shí)空分布功能[5]。近年來(lái)，Lc基因被成功導(dǎo)入多種植物中，并且成功整合與表達(dá)，例如矮牽牛[6-7]、煙草[8]、番茄[9-10]、蘋果[11]等。在棉花中，2016 年 Fan 等[12]將35S 驅(qū)動(dòng)的Lc基因轉(zhuǎn)入棉花，轉(zhuǎn)基因棉花的莖、葉等營(yíng)養(yǎng)器官、花及纖維中均呈現(xiàn)紅色；然而由于營(yíng)養(yǎng)體、 生殖體中花青素的過(guò)量合成與積累，嚴(yán)重影響了轉(zhuǎn)基因棉花再生苗的生長(zhǎng)與發(fā)育，最終僅獲得2 個(gè)可育株系。GhACT1 是2005 年Li等[13]通過(guò)篩選cDNA 文庫(kù)得到的15 個(gè)肌動(dòng)蛋白cDNA 序列中，在棉花纖維中特異表達(dá)最強(qiáng)的1個(gè)序列。因此，本研究以纖維特異表達(dá)的GhACT1 啟動(dòng)子替換35S，構(gòu)建植物表達(dá)載體GhACT1-Lc-pBI121 轉(zhuǎn)化棉花，減少不利于轉(zhuǎn)基因棉苗正常生長(zhǎng)發(fā)育的因素，為纖維中花青素合成機(jī)理研究及彩色纖維育種研究提供品系資源。

1 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建

將PBI121 中的GUS 酶切替換為L(zhǎng)c基因；將35S 啟動(dòng)子經(jīng)酶切替換為GhACT1 啟動(dòng)子，構(gòu)建 GhACT1-Lc-pBI121 載體（GhACT1-Lc）。

1.2 植物材料

珂字棉312（C312）無(wú)菌苗的下胚軸作為外植體，無(wú)菌苗的處理與操作方法同參考文獻(xiàn)[10]所敘。

1.3 農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化

將構(gòu)建好的載體通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌AGL1。隨機(jī)選擇3 個(gè)獨(dú)立的單菌落作為模板，以非轉(zhuǎn)化的菌落為陰性對(duì)照，以質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，進(jìn)行nptⅡ、Lc和GhACT1 的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)，驗(yàn)證載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化成功與否。經(jīng)PCR 擴(kuò)增檢測(cè)單菌落為陽(yáng)性的克隆，接入含有利福平和羧芐青霉素的 LB 液體培養(yǎng)基中，在 28 ℃、250 r·min－1的搖床上過(guò)夜，OD600為0.8 左右，即可保留菌種或用于轉(zhuǎn)化棉花。

1.4 轉(zhuǎn)化植物

將培養(yǎng)的菌液離心，倒掉上清液，重懸于Murashige&Skoog（MS）培養(yǎng)基中[14]，加入乙酰丁香酮 （Acetosyringone，AS）。浸染無(wú)菌苗下胚軸10 min。然后將其放入無(wú)篩選劑的MS 培養(yǎng)基，共培養(yǎng)2 d 后，在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 個(gè)月，每月繼代1 次。挑取篩選到的陽(yáng)性愈傷進(jìn)行組織培養(yǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)胚胎發(fā)生，獲得再生棉苗方法同參考文獻(xiàn)[12]所述。所獲得的轉(zhuǎn)基因再生棉幼苗在三角瓶中長(zhǎng)至5～7 葉，根系健壯時(shí)，經(jīng)過(guò)溫室煉苗，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，緩苗后移到網(wǎng)室，即在正常的日光條件下生長(zhǎng)。

1.5 轉(zhuǎn)基因再生苗的DNA提取及PCR檢測(cè)

在試管苗移栽前，采集棉花再生苗的1 片嫩葉粗提DNA，以Lc片段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 檢測(cè)。

Lc引物：Lc-L：5'-GGGGGATCCATGGCGCTTTCAGCTTCCCCGAG-3'，Lc-R：5'-GGGGATATCACCGCTTCCCTATAGCTTTGC-3'。片段長(zhǎng)度為 1.4 kbp。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 4 min，94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 mim，然后4 ℃保存。

GhACT1 引物：GhACT1-L：5'-GGTCGACGGCCCGGGCTGGT-3'，GhACT1-R：5'-CTTTTACAATACTGAAAATAAGAT-3'。片段長(zhǎng)度為 0.8 kbp。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 5 min，94 ℃ 45 s，58℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35 個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min，最后4 ℃保存。

1.6 轉(zhuǎn)基因再生苗的Southern blot雜交

移栽后的棉株長(zhǎng)到5 片展開葉時(shí)，摘取頂端2 片葉，采用 CTAB 法提取棉花總 DNA[15]，進(jìn)行分子生物學(xué)檢測(cè)Southern blot 雜交。吸取10 μg DNA，經(jīng) 20 個(gè)酶活力單位（U，active unit）的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ37 ℃過(guò)夜酶切后，于10 g·L－1的瓊脂糖凝膠中電泳過(guò)夜，分離酶切后的DNA片段，在堿性條件下通過(guò)毛細(xì)管吸附作用將片段DNA 轉(zhuǎn)移到尼龍膜上用于雜交。根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明制作地高辛標(biāo)記的Lc探針，然后在42 ℃雜交箱中雜交過(guò)夜。雜交后的雜交膜在檸檬酸鈉（Saline sodium citrate，SSC） 與十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS）的混合緩沖液中沖洗，最后按照地高辛發(fā)光檢測(cè)試劑盒（ROCHE 公司）的說(shuō)明，加入標(biāo)記抗地高辛抗體（Anti-digoxigenin AP-conjungate，AP）使抗體與地高辛結(jié)合，清洗后加入顯色液顯色。

1.7 RNA的抽提與表達(dá)量檢測(cè)

采用改良的熱酚法抽提不同發(fā)育階段纖維的RNA，方法同Li 等[13]所述。首先在熱酚中加入等體積的酚- 氯仿，置于65 ℃的水浴鍋里溫浴15 min；再取棉花幼胚置于液氮中研磨至粉末，并及時(shí)將其轉(zhuǎn)入提取緩沖液中，劇烈震蕩混勻；然后在 4 ℃離心機(jī)上 12 000 r·min－1離心 20 min，吸取上清，再加入等體積酚- 氯仿重復(fù)處理數(shù)次，最終用 4 mol·L－1氯化鋰沉淀，溶于無(wú)菌的焦碳酸二乙酯 （Diethy-pyrocarbonate，DEPC）水中備用。表達(dá)量檢測(cè)采用逆轉(zhuǎn)錄 （Reverse transcription，RT）PCR 檢測(cè)法，同 2016 年 Fan 等[12]的報(bào)道。

1.8 未成熟胚的離體培養(yǎng)

取開花后2 d 的幼鈴，在體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精溶液中浸泡1 min 后，在超凈工作臺(tái)上切開，挑出已經(jīng)長(zhǎng)出短絨凸起的幼胚放入改良的液體培養(yǎng)基[16]。其中每一幼鈴中的幼胚對(duì)半分為2 個(gè)部分，一部分進(jìn)行正常的光照培養(yǎng)（光周期為16 h/8 h，光照強(qiáng)度為3 000 lx）；另一部分完全暗培養(yǎng)；剝?nèi)?0 個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系的幼胚重復(fù)3 次，同時(shí)取未轉(zhuǎn)化的C312 棉鈴未成熟胚作為對(duì)照，同樣分2 個(gè)部分分別培養(yǎng)。具體方法同2016 年Fan 等[12]的報(bào)道。

2 結(jié)果與分析

2.1 載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌單菌落的PCR驗(yàn)證結(jié)果

從圖1 的PCR 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，篩選獲得的質(zhì)粒與單菌落都攜帶有標(biāo)記基因nptⅡ、 目的基因Lc和GhACT1 啟動(dòng)子，而非轉(zhuǎn)化菌落N 未出現(xiàn)條帶（圖1），說(shuō)明植物表達(dá)載體構(gòu)建正確并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，這些單菌落將繼續(xù)用于外植體轉(zhuǎn)化及此后的試驗(yàn)工作。

圖1 質(zhì)粒及單菌落PCR 驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 PCR test result of single colony and plasmid

2.2 轉(zhuǎn)基因再生株系的PCR檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得轉(zhuǎn)基因棉花再生苗 （圖2）。移栽前，對(duì)瓶中36 株再生株系進(jìn)行PCR 檢測(cè)，結(jié)果有25 個(gè)株系為PCR 陽(yáng)性，其中部分轉(zhuǎn)Lc基因的棉花株系PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖3。

2.3 Southern blot雜交檢測(cè)結(jié)果

Southern blot 雜交檢測(cè)結(jié)果確認(rèn)25 個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系均為陽(yáng)性。圖4 顯示了其中10 個(gè)株系的Southern blot 雜交結(jié)果，10 個(gè)泳道均出現(xiàn)明顯雜交條帶。其中：株系 La89、La83 和 La105 為多拷貝插入； 其余7 個(gè)株系均顯示為1 條雜交帶，這7 個(gè)株系是否為單拷貝遺傳，還要對(duì)其T1植株基因分離情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析才能確定。通過(guò)觀察發(fā)現(xiàn)，這些再生苗在成長(zhǎng)過(guò)程中沒(méi)有明顯顏色變化，植株的生長(zhǎng)發(fā)育及后代育性也基本正常。

2.4 轉(zhuǎn)基因株系中Lc基因的表達(dá)檢測(cè)（RTPCR）結(jié)果

在GhACT1-Lc 轉(zhuǎn)基因再生株系的生長(zhǎng)過(guò)程中，莖葉以及花果均沒(méi)有明顯的顏色變化。RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因棉花株系的營(yíng)養(yǎng)組織如葉、 葉柄和莖中均沒(méi)有看到Lc基因的表達(dá)信號(hào)，如圖5。

圖2 轉(zhuǎn)基因棉花再生苗Fig.2 Transgenic regenerants of cotton

圖3 部分轉(zhuǎn)基因棉花再生株系的PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.3 PCR test results of part of transgenic lines

RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因棉花幼胚及新生纖維，即棉花纖維發(fā)育初期如起始期及伸長(zhǎng)期早期有較明顯轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)（圖6），并且表達(dá)水平基本一致，而在幼胚發(fā)育12 d 時(shí)表達(dá)信號(hào)明顯減弱，而在后來(lái)的伸長(zhǎng)期及增厚期沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)信號(hào)（圖片未顯示）。

圖4 10 個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花株系的Southern 雜交結(jié)果Fig.4 The test result of southern blot of 10 transgenic lines

圖5 轉(zhuǎn)基因株系營(yíng)養(yǎng)體中Lc 基因表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果（RT-PCR）Fig.5 Test of Lc expression in vegetative tissues of transgenic cotton plants by RT-PCR

圖6 轉(zhuǎn)基因株系不同生長(zhǎng)期（開花后1、2、3、5、7、9、12 d）幼胚和纖維中Lc 基因的表達(dá)情況Fig.6 The Lc gene expression levels in ovules and fibers at the indicated stages (at 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12 days post anthesis)

2.5 幼胚離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Fan 等[12]的報(bào)道，在35S-Lc 轉(zhuǎn)基因株系中，需要光照條件下才可以看到纖維顏色的變化，因此進(jìn)行了棉花幼胚的離體培養(yǎng)試驗(yàn)。結(jié)果表明，同35S-Lc 轉(zhuǎn)基因棉花一樣[12]，在光照條件下培養(yǎng)1 周后10 個(gè)GhACT1-Lc 轉(zhuǎn)基因株系的幼胚表皮毛均呈現(xiàn)紅色，3 次重復(fù)表型一致；而另外一組在完全黑暗培養(yǎng)條件下，GhACT1-Lc 轉(zhuǎn)基因株系幼胚的表皮與纖維都保持全白色 （圖7）。在同樣培養(yǎng)條件下，2 組非轉(zhuǎn)基因棉花幼胚均未出現(xiàn)紅色纖維。在10 倍顯微鏡下觀察紅色纖維發(fā)現(xiàn)，與35S-Lc 轉(zhuǎn)基因再生株一樣花青素紅色油狀物積累在幼嫩纖維細(xì)胞的中央大液泡中[12]。GhACT1-Lc 轉(zhuǎn)基因株系后代 T1、T2的幼胚離體光照培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果顯示，幼胚纖維同樣出現(xiàn)紅色，說(shuō)明整合在這些轉(zhuǎn)基因株系中的Lc基因是可遺傳并持續(xù)表達(dá)的。

圖7 轉(zhuǎn)基因株系幼胚在離體培養(yǎng)條件下光照和暗培養(yǎng)的對(duì)照試驗(yàn)結(jié)果Fig.7 Comparison of test results of transgenic immature ovules cultured under light or in dark for 1 week

3 討論

本研究轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，通過(guò)卡那霉素篩選獲得36 個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花再生株系，以Lc為引物經(jīng)PCR、Southern blot 檢測(cè)有 25 個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，其他11 個(gè)株系通過(guò)了卡那霉素的篩選卻不含有Lc基因。因而推測(cè)，在外源目的基因整合棉花時(shí)，產(chǎn)生報(bào)告基因nptⅡ整合入棉花體內(nèi)，而目的基因Lc缺失的現(xiàn)象。這一現(xiàn)象在以往的轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)中也時(shí)有發(fā)生，這可能是轉(zhuǎn)基因過(guò)程中常常產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因。而這一現(xiàn)象的分子生物學(xué)原理及理論解釋，還有待深入研究。

據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道，35S-Lc 轉(zhuǎn)基因棉花再生株系中最終僅獲得2 個(gè)可遺傳后代，原因是過(guò)量的花青素在棉花植株的營(yíng)養(yǎng)體與生殖體細(xì)胞中合成與積累，具有毒害細(xì)胞作用，導(dǎo)致細(xì)胞停滯生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17-18]。在35S-Lc轉(zhuǎn)基因過(guò)程中，組織培養(yǎng)時(shí)棉花愈傷組織呈現(xiàn)紅色甚至紫色，會(huì)影響愈傷細(xì)胞的繁殖與分化；體細(xì)胞胚呈現(xiàn)紅色或紫色，會(huì)影響胚的正常萌發(fā)，導(dǎo)致僅有少數(shù)胚可以長(zhǎng)成試管苗。此外，試管再生苗的幼葉、莖稈及幼根呈現(xiàn)紅色，使得再生苗移栽成活率較低；再生苗的花藥、柱頭變紅色，花粉量少，明顯影響了轉(zhuǎn)基因棉花再生苗的獲得。而GhACT1-Lc 的轉(zhuǎn)基因棉花試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因棉花再生株系在整個(gè)轉(zhuǎn)基因過(guò)程中均沒(méi)有出現(xiàn)明顯的顏色變化，最終獲得較多轉(zhuǎn)基因棉花再生株系。另外，GhACT1-Lc 的轉(zhuǎn)基因棉花再生苗的生長(zhǎng)發(fā)育與外源基因?qū)氲目截悢?shù)也沒(méi)有明顯關(guān)系。無(wú)論是單拷貝或多拷貝插入，都沒(méi)有顏色變化，沒(méi)有影響到棉花的正常生長(zhǎng)與發(fā)育。結(jié)果證明，用特異表達(dá)的GhACT1 啟動(dòng)子替換組成型35S 啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化Lc基因，是獲得彩色棉材料的有效途徑。

RT-PCR 表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，Lc基因僅在轉(zhuǎn)基因棉花幼胚纖維中表達(dá)，在營(yíng)養(yǎng)體各器官組織中沒(méi)有表達(dá)，這與轉(zhuǎn)基因棉花的外在顏色變化相一致。從而可以推測(cè)Lc基因的存在，決定了轉(zhuǎn)基因株系的顏色變化。由于棉花種皮中沒(méi)有色素腺體[19]，在自然生長(zhǎng)情況下，由種皮細(xì)胞伸長(zhǎng)形成的纖維沒(méi)有顏色的變化。而Lc基因在轉(zhuǎn)基因株系幼胚纖維中有較強(qiáng)的表達(dá)，在光照條件下可催化花青素合成出現(xiàn)紅色纖維。本研究中光照與黑暗對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。幼胚的光照與黑暗離體培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因棉花幼胚表皮毛的初始及伸長(zhǎng)期早期，纖維細(xì)胞中出現(xiàn)紅色液體，經(jīng)顯微鏡觀察，同35S-Lc 轉(zhuǎn)基因棉花纖維一樣，花青素紅色油狀物積累在幼嫩纖維細(xì)胞的中央大液泡中。這是因?yàn)樯卦诩?xì)胞質(zhì)中合成后，經(jīng)ATP 連接的H+泵作用，被壓入液泡中[20]。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，變紅的棉纖維繼續(xù)培養(yǎng)1 周后，新伸長(zhǎng)纖維不再繼續(xù)變紅，而是變?yōu)榉凵踔镣噬珵榘咨?。這一現(xiàn)象表明在后來(lái)的生長(zhǎng)過(guò)程中，纖維沒(méi)有產(chǎn)生新的花青素，而已經(jīng)產(chǎn)生的花青素也因?yàn)闂l件的變化而褪色，推測(cè)是由于GhACT1 啟動(dòng)子在棉纖維伸長(zhǎng)期及次生壁增厚期不再具有功能，不能夠驅(qū)動(dòng)目的基因Lc表達(dá)而調(diào)控花青素的合成與積累。這一現(xiàn)象驗(yàn)證了2008 年范小平等的GhACT1 反義功能研究結(jié)果，即GhACT1 僅在棉花纖維發(fā)育初始階段表達(dá)，在伸長(zhǎng)期及次生壁增厚期表達(dá)微弱甚至沒(méi)有[21]。而 2005 年，Li 等的報(bào)道也說(shuō)明GhACT1 在幼胚纖維伸長(zhǎng)期開花后10 d 之前有較強(qiáng)表達(dá)，而在營(yíng)養(yǎng)體組織如葉、 根等及生殖體組織如花藥、花瓣、苞片里沒(méi)有或僅有很弱的表達(dá)，在纖維成熟期幾乎沒(méi)有表達(dá)[13]。因而這也是今后改良棉花纖維顏色研究需要改進(jìn)的地方。

4 結(jié)論

通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將GhACT1-Lc 轉(zhuǎn)入棉花，獲得25 個(gè)轉(zhuǎn)基因棉花再生株系。通過(guò)試驗(yàn)證明GhACT1-Lc 成功整合到棉花基因組，并且在幼胚纖維中具有一定的功能，促進(jìn)了花青素在棉花纖維中的合成積累，使轉(zhuǎn)基因棉花幼胚纖維在離體光照條件下呈現(xiàn)紅色，為今后改良棉花纖維顏色研究奠定了基礎(chǔ)。