陸地棉基因GhMYB52的克隆及特征分析

杜靜靜，田岳，馮昊，郭夢(mèng)蘭，楊琴莉，丁林云，李潔，胡艷,*，張?zhí)煺?

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210095；2.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院農(nóng)學(xué)系，杭州310058）

自然界中植物通過基因的激活、沉默以及時(shí)空特異性的表達(dá)來調(diào)控細(xì)胞的分化、組織器官的形成以及植株的生長(zhǎng)發(fā)育過程，這一系列的調(diào)控過程需要各種各樣的酶和調(diào)節(jié)蛋白共同協(xié)作完成。轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TFs）就是這樣1 類調(diào)節(jié)蛋白。MYB 轉(zhuǎn)錄因子是目前在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的數(shù)量最多、 種類最豐富的1 類轉(zhuǎn)錄因子，因其N 端高度保守的DNA 結(jié)合域——MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog，MYB）結(jié)構(gòu)域而得名，該結(jié)構(gòu)域由1 個(gè)或數(shù)個(gè)51～52 個(gè)氨基酸串聯(lián)而成的R 結(jié)構(gòu)域組成[1-3]。R 結(jié)構(gòu)域的主要作用是參與空間結(jié)構(gòu)中疏水核心的形成，其數(shù)量是區(qū)分不同種類MYB 基因的主要依據(jù)[4]。根據(jù) R 結(jié)構(gòu)域的數(shù)量，MYB 基因家族分為 4 大類：（1） 含有 1 個(gè) R 結(jié)構(gòu)域的為1R-MYB；（2）含 2 個(gè) R 結(jié)構(gòu)域的為 R2R3-MYB；（3）含有 3 個(gè) R 結(jié)構(gòu)域的為 3R-MYB；（4）含有 4個(gè)R 結(jié)構(gòu)域的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，稱為4R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子[5]。研究表明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物的次生壁（Secondary cell wall，SCW）發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用[6]。高等植物尤其是擬南芥次生壁的加厚過程受到基于NAC-MYB 轉(zhuǎn)錄因子形成的三級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控：NAC 類轉(zhuǎn)錄因子作為轉(zhuǎn)錄開關(guān)調(diào)控位于下游的第二級(jí)MYB 類轉(zhuǎn)錄因子，從而影響第三級(jí)的主要以MYB 轉(zhuǎn)錄因子為主的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控纖維素、半纖維素等的合成[7]。

棉花成熟纖維細(xì)胞壁含有90%以上的纖維素[8]。在棉花纖維細(xì)胞壁次生壁加厚期開花后16～40 d（Days post anthesis，DPA），纖維素大量合成和沉積[9]。目前，有關(guān)纖維素合成和代謝的主要調(diào)控因子纖維素合酶的研究已有不少報(bào)道[10]，其他糖代謝基因如蔗糖合酶、 幾丁質(zhì)酶、β-1, 3-內(nèi)葡聚糖酶等也與纖維次生壁加厚密切相關(guān)[11-15]。除此之外，一些轉(zhuǎn)錄因子也參與棉花纖維細(xì)胞次生壁加厚過程。棉纖維細(xì)胞次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的NAC 類轉(zhuǎn)錄因子 GhFSN1 在纖維SCW 加厚期起正向調(diào)控作用。轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)證明，在棉花中過表達(dá)GhFSN1 基因能夠促進(jìn)棉纖維SCW 厚度的增加，但纖維長(zhǎng)度變短。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明GhFSN1 能夠通過激活其下游SCW 相關(guān)基因來促進(jìn)棉纖維SCW 的生長(zhǎng)發(fā)育，其中MYB 在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要的作用。但是，GhFSN1 基因是通過調(diào)控哪些MYB基因參與棉纖維次生壁的發(fā)育過程尚不清楚[16]。

次生壁加厚期纖維素的合成影響纖維的強(qiáng)度與馬克隆值等，該時(shí)期是決定棉纖維品質(zhì)的關(guān)鍵時(shí)期。因此，挖掘參與棉纖維次生壁加厚期的基因，研究次生壁發(fā)育的分子機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有重要的意義。本研究從陸地棉中篩選到1 個(gè)在棉花纖維次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因GhMYB52，對(duì)其進(jìn)行組織表達(dá)、轉(zhuǎn)錄激活鑒定、亞細(xì)胞定位和酵母互作分析，初步探究該基因的表達(dá)模式和分子功能，為今后深入研究該基因的分子生物學(xué)特性及遺傳進(jìn)化等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理

用于棉花組織表達(dá)分析的陸地棉（Gossypium hirsutumL.） 材料 TM-1 和海島棉 （G.barbadenseL.） 材料海7124 均種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)當(dāng)涂試驗(yàn)基地（安徽省馬鞍山市當(dāng)涂縣），采用常規(guī)大田管理。

用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化的煙草材料為本氏煙，種植于浙江大學(xué)人工氣候室，溫室條件：溫度22 ℃；光照16 h、黑暗8 h；相對(duì)濕度75%～80%。

以上所用植物材料均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 載體與試劑

使用的轉(zhuǎn)基因載體 pBINGFP4、pGBKT7、pGADT7 載體以及Y2H 菌株保存于本實(shí)驗(yàn)室。大腸桿菌DH5α 感受態(tài)購(gòu)于Vazyme 公司、 農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株 GV3101 感受態(tài)購(gòu)于南京沃華生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、SmaⅠ、NdeⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ、NcoⅠ購(gòu)于NEB 公司。膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自 Axygene 公司。One Step Cloning Kit 重組酶、Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase 高保真酶、HiScript Reverse Transcriptase 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)買自 Vazyme 公司。YPDA、SD/-Trp、SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His 營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基、酵母雙雜試劑盒（Cat.No.630489）購(gòu)于 Takara 公司（中國(guó)，大連），X-Glu 試劑購(gòu)于南京梅林雪海公司。乙酰丁香酮購(gòu)于源葉生物。引物合成和測(cè)序由杭州擎科生物有限公司完成。RNA 快速提取試劑盒購(gòu)于鐘鼎生物（中國(guó)，南京）。本研究所用引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.3 RNA的提取及cDNA的合成

按照EASYspin Plus 植物RNA 快速提取試劑盒說明書，提取TM-1 和海7124 的花托、花瓣、雄蕊、 雌蕊、 花萼、－3 DPA、－1 DPA、1 DPA、3 DPA 的胚珠，以及 5 DPA、10 DPA、15 DPA、20 DPA、25 DPA、30 DPA 的棉花胚珠和纖維組織RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組織RNA 反轉(zhuǎn)錄，合成第一鏈cDNA。

1.4 GhMYB52基因的克隆

根據(jù)本課題組對(duì)MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族分析結(jié)果，從陸地棉 TM-1 基因組（V1.1）中獲得了 34 個(gè)位于A12 號(hào)染色體上的R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因。結(jié)合陸地棉TM-1 的35 個(gè)不同組織表達(dá)譜數(shù)據(jù)[10]，從中選出了1 個(gè)在棉花纖維發(fā)育次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)的基因Gh_A12G2460。因其與擬南芥中AtMYB52 基因的相似度最高，將其命名為GhMYB52。進(jìn)一步通過一步克隆法，設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)的重組引物（Gh-MYB52F 和 GhMYB52R），以 TM-1 20 DPA 纖維組織的cDNA 為模板擴(kuò)增目的基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳膠回收試劑盒純化后，與使用相同酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切后的pBinGFP4 載體進(jìn)行重組連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用pBinGFP4 載體通用引物GFP4F 和GFP4R 進(jìn)行陽(yáng)性鑒定，并送至杭州擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用 DNAMAN 軟件對(duì) GhMYB52 氨基酸序列進(jìn)行保守性分析。采用鄰近連接法（Neighbor-joining,NJ） 使用 MEGA 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[17]。通過 ExPASy（https://www.expasy.org/）在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)GhMYB52 蛋白序列的理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)模型。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR （Real-time quantitative PCR，RT-PCR）反應(yīng)體系和反應(yīng)程序按照AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix 試劑盒說明書進(jìn)行。定量 PCR 儀型號(hào)為 Roche LightCycler 96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR，操作方法參考分析儀說明書。定量引物為 GhMYB52-qF 和 GhMYB52-qR。棉花組成型表達(dá)的Histone3 基因（Gh_D03G0370）為內(nèi)參基因?；虻南鄬?duì)表達(dá)量采用2－ΔΔCt方法分析，試驗(yàn)進(jìn)行3 次技術(shù)重復(fù)。熒光定量的數(shù)據(jù)利用Excel 軟件，通過最小顯著差數(shù)法（Least significant difference，LSD）進(jìn)行差異顯著性分析。

1.7 酵母轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)帶有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)的PCR引物：GhMYB52-YF 和 GhMYB52-YR，GhFSN1-YF 和 GhFSN1-YR，分別擴(kuò)增GhMYB52 和GhFSN1 基因的編碼序列（ Coding sequence，CDS）。按照一步克隆法，構(gòu)建 GhMYB52-pGBKT7 和GhFSN1-pGADT7 載體。按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2 試劑盒說明書操作方法，將 GhMYB52-pGBKT7 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 Y2H 菌株，涂布于含有 50 μg·L－1AbA（Aureobasidin A，金擔(dān)子素）抑制劑的SD/-Trp 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活/ 抑制功能的驗(yàn)證。另外，將Gh-MYB52-pGBKT7 和 GhFSN1-pGADT7 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 Y2H 菌株，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 （pGBKT7-53＋pGADT7-T）、 陰 性 對(duì) 照 （pGBK-Lamin c ＋pGADT7-T），涂布于含有 450 μg·L－1AbA 抑制劑的三缺SD/-Trp/-Leu/-His 營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上，進(jìn)行酵母互作分析。將培養(yǎng)基置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)2 d 左右，觀察菌斑的生長(zhǎng)情況。

1.8 亞細(xì)胞定位鑒定

采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，將構(gòu)建好的過表達(dá)載體35S::GhMYB52::GFP 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株 GV3101。按照煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，選取培養(yǎng)25 d 的煙草，將準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌菌液，注射進(jìn)完整且厚的煙草葉片中。注射后對(duì)侵染的煙草葉片進(jìn)行避光處理，48 h 后在Zeiss 熒光共聚焦顯微鏡下觀察注射過的煙草葉片中的GFP 信號(hào)[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GhMYB52基因的克隆及序列特征分析

以陸地棉 TM-1 的 20 DPA 纖維 cDNA 為模板，用一步克隆法獲得GhMYB52 基因的CDS。GhMYB52 基因全長(zhǎng)為 672 bp，編碼 223 個(gè)氨基酸殘基。ExPASy 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)GhMYB52 基因編碼產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量約為26.06 kDa，等電點(diǎn)為9.83，R2R3 結(jié)構(gòu)域位于第 1～55 個(gè)氨基酸序列 （圖1)。通過 BlastP 比對(duì)，在 TAIR 網(wǎng)站（https://www.arabidopsis.org/） 中篩選出 5 個(gè)與GhMYB52 蛋白序列相似度大于50%的擬南芥R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子。氨基酸序列分析結(jié)果（圖 2） 表明，GhMYB52 蛋白的 N 端含有 1 個(gè)高度保守的 R2R3 結(jié)構(gòu)域。根據(jù) R2R3 類 MYB 轉(zhuǎn)錄因子C 端的保守性的差異，進(jìn)一步將其分成25 個(gè)亞族。我們提取了擬南芥中R2R3 類不同亞族的58 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，系統(tǒng)進(jìn)化樹的分析結(jié)果（圖3）表明，GhMYB52 屬于 R2R3 類 MYB 轉(zhuǎn)錄因子家族第21 亞族。

圖1 GhMYB52 蛋白結(jié)構(gòu)域分析示意圖Fig.1 Structure analysis of GhMYB52 protein

2.2 GhMYB52基因的表達(dá)模式分析

陸地棉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，GhMYB52 基因在棉纖維次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，尤其是在15 DPA、20 DPA、25 DPA 的纖維中表達(dá)量很高。利用 qRT-PCR 方法分析了 TM-1 中GhMYB52 基因和海 7124 中同源基因GbMYB52 （GB_A12G3024）在花瓣、雌蕊、雄蕊、花托、－3～3 DPA 的胚珠、5～30 DPA 的胚珠以及纖維等不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明：在所檢測(cè)的組織中，GhMYB52 與GbMYB52 的表達(dá)情況基本一致，均在 15 DPA 的胚珠、15～25 DPA 的纖維中優(yōu)勢(shì)表達(dá)（圖4），與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的表達(dá)情況基本一致，推測(cè)GhMYB52 基因可能在棉花纖維發(fā)育次生壁加厚期發(fā)揮功能。

圖2 GhMYB52 與擬南芥中MYB 轉(zhuǎn)錄因子保守域氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 The sequence alignment of MYB domain of GhMYB52 and related protein from A.thaliana

圖3 棉花GhMYB52 蛋白與擬南芥中R2R3 類MYB 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the GhMYB52 protein and R2R3 MYB protein in A.thaliana

2.3 GhMYB52蛋白亞細(xì)胞定位

蛋白序列分析顯示GhMYB52 蛋白包含核定位信號(hào)。為了驗(yàn)證GhMYB52 蛋白是否具有核定位特性，在本氏煙葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)Gh-MYB52，結(jié)果（圖5）顯示，綠色熒光信號(hào)聚集在細(xì)胞核區(qū)域，說明GhMYB52 蛋白是1 個(gè)核定位蛋白。

2.4 GhMYB52轉(zhuǎn)錄激活活性分析

將轉(zhuǎn)化得到的含GhMYB52 基因的陽(yáng)性單菌落涂在含有 50 μg·L－1AbA 抑制劑的 SD/-Trp培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，結(jié)果（圖6）表明，菌落能夠正常生長(zhǎng)，證明了GhMYB52 具有轉(zhuǎn)錄激活活性，是1 個(gè)轉(zhuǎn)錄激活子。

2.5 GhMYB52能與NAC類轉(zhuǎn)錄因子GhFSN1發(fā)生互作

圖4 GhMYB52 基因在棉花不同組織中的表達(dá)模式Fig.4 Expression profile of GhMYB52 gene in different tissues and different developmental stages

圖5 GhMYB52 在本氏煙中的亞細(xì)胞定位Fig.5 Localization of GhMYB52 in leaf cells of N.benthamiana

圖6 GhMYB52 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活驗(yàn)證Fig.6 Assay of GhMYB52 transcriptional activation activity

對(duì)過表達(dá)GhFSN1 基因植株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)GhMYB52 基因的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)的上調(diào)趨勢(shì)[16]。為了進(jìn)一步研究GhMYB52 參與棉花纖維次生壁加厚過程的機(jī)制，通過酵母雙雜交試驗(yàn)的方法研究GhMYB52 蛋白與GhFSN1 蛋白之間的互作關(guān)系。酵母雙雜交的結(jié)果（圖7）顯示，GhMYB52 與GhFSN1 之間能夠發(fā)生較強(qiáng)的相互作用。

圖7 酵母雙雜交驗(yàn)證GhMYB52 與NAC 類轉(zhuǎn)錄因子GhFSN1 互作Fig.7 Interactions of GhMYB52 with the NAC transcription factor GhFSN by yeast-two hybridization assay

3 討論

MYB 轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于植物各類組織器官中。目前，關(guān)于MYB 類轉(zhuǎn)錄因子的研究，主要集中在擬南芥、棉花、水稻等作物中[19-24]。大量的MYB 轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、 細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要的作用[25-29]。其中，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥的木質(zhì)部導(dǎo)管細(xì)胞以及木質(zhì)部、厚壁細(xì)胞的纖維細(xì)胞發(fā)育過程中的作用已經(jīng)比較清楚：以NAC 和MYB 類轉(zhuǎn)錄因子為核心成員的一系列轉(zhuǎn)錄因子形成分級(jí)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，調(diào)節(jié)下游的一系列MYB 或者其他類轉(zhuǎn)錄因子參與次生壁中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的合成過程[30-34]。

擬南芥中NAC 類轉(zhuǎn)錄因子基因SND1，主要在擬南芥的維管束間纖維及木質(zhì)部纖維細(xì)胞中特異性表達(dá)，過表達(dá)SND1 能激活植物非厚壁組織細(xì)胞的次生壁合成，顯性抑制SND1 則能夠引起維管束間纖維和木質(zhì)部纖維次生壁的厚度顯著下降。同時(shí)，SND1 能夠調(diào)控下游的一些MYB類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 ，如MYB52、MYB54、MYB85、MYB103 等。在擬南芥中，抑制AtMYB52、At-MYB54 基因的表達(dá)使得擬南芥束間纖維細(xì)胞壁的厚度明顯下降[35-36]。不同物種的同一亞族成員可能具有類似的功能。本研究從陸地棉TM-1 中得到了1 個(gè)R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子 GhMYB52，氨基酸序列和進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)GhMYB52 含有1個(gè)R2R3 保守區(qū)和1 個(gè)核定位區(qū)，與AtMYB52進(jìn)化關(guān)系最近，同屬第21 亞族。在TM-1、海7124中，GhMYB52 和其同源基因GbMYB52 均在棉纖維次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)，因此我們推測(cè)Gh-MYB52 基因可能參與棉纖維次生壁加厚期的發(fā)育過程。

目前已經(jīng)基本掌握了雙子葉植物中次生壁的發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，但是棉纖維次生壁的發(fā)育過程是否存在同樣的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，目前尚不清楚。2017年，李學(xué)寶團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)棉花中的NAC 類轉(zhuǎn)錄因子基因GhFSN1 能夠正向調(diào)控棉纖維次生壁厚度，過表達(dá)棉花植株的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，大量的MYB 類轉(zhuǎn)錄因子受到調(diào)控，其中GhMYB52 基因的表達(dá)受到GhFSN1 的正向調(diào)控[18]。我們通過酵母雙雜交試驗(yàn)，在蛋白水平上驗(yàn)證了Gh-MYB52 與GhFSN1 之間能夠發(fā)生較強(qiáng)的相互作用。這一結(jié)果進(jìn)一步表明GhMYB52 基因在棉纖維次生壁發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要的作用，為進(jìn)一步研究棉花纖維次生壁加厚調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在本實(shí)驗(yàn)室已有的研究基礎(chǔ)上，通過一步克隆法，從陸地棉中克隆了1 個(gè)R2R3 類MYB 轉(zhuǎn)錄因子基因。氨基酸序列保守性分析顯示，該基因編碼產(chǎn)物N 端含有1 個(gè)高度保守的R2R3 結(jié)構(gòu)域，且與擬南芥的AtMYB52 基因具有較高的相似性，因此，將其命名為GhMYB52。GhMYB52 基因的 cDNA 序列全長(zhǎng) 672 bp，共編碼223 個(gè)氨基酸殘基，蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量為26.06 kDa，等電點(diǎn)為9.83。瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草結(jié)果表明，GhMYB52 定位于細(xì)胞核，且具有轉(zhuǎn)錄激活活性。TM-1 中的表達(dá)分析結(jié)果顯示，GhMYB52 基因在棉纖維次生壁加厚期優(yōu)勢(shì)表達(dá)。酵母雙雜交的結(jié)果顯示GhMYB52 與正向調(diào)控棉纖維次生壁發(fā)育的NAC 類轉(zhuǎn)錄因子GhFSN1 發(fā)生較強(qiáng)的互作，表明GhMYB52 可能參與棉纖維細(xì)胞次生壁的形成，但它在棉纖維次生壁發(fā)育過程中的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。