不同鹽堿脅迫對棉花離子組穩(wěn)態(tài)及Na+相關(guān)基因表達影響

李雙男，郭慧娟，侯振安*

（1.石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院資環(huán)系/ 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)重點實驗室，新疆石河子832003；2.中國石油大學(xué)勝利學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，山東東營257097）

目前，土壤鹽堿化是威脅生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要因素[1]。棉花（Gossypium hirsutumL.）是開發(fā)鹽堿地的“先鋒作物”，但鹽堿脅迫依然會對棉花生長產(chǎn)生極大的影響[2]。隨著全球氣候變化的日益加劇，土壤鹽漬化情況進一步惡化，提高植物耐鹽堿能力迫在眉睫[3]。土壤鹽堿化類型多樣，包括鹽脅迫、堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫。鹽脅迫指的是中性鹽（NaCl 和 Na2SO4），對植物的影響主要為滲透脅迫和離子毒害[4]；堿脅迫是與堿性鹽有關(guān)（NaHCO3和 Na2CO3）[5]，主要為高pH 值影響植物生長，破壞離子平衡[6]；而復(fù)合鹽堿脅迫可能會導(dǎo)致比鹽脅迫和堿脅迫更嚴重的傷害[7]。

在鹽堿脅迫下，最能直觀體現(xiàn)棉花受脅迫狀況的包括形態(tài)學(xué)指標和根系發(fā)育狀況等。研究表明，受鹽堿脅迫后棉花生長顯著受到抑制，苗期干物質(zhì)質(zhì)量顯著降低[8]，根系發(fā)育受到抑制[9]。其次，鹽堿脅迫導(dǎo)致離子毒害會造成植物離子穩(wěn)態(tài)失衡。研究表明，鹽堿脅迫下離子穩(wěn)態(tài)機制的重建是植物提高耐鹽堿性的重要手段之一[10]。離子組學(xué)是近年來在植物應(yīng)對鹽堿脅迫中新的研究領(lǐng)域[11]。礦質(zhì)元素是作物成長過程中的基本保障[12]。鹽堿脅迫會導(dǎo)致礦質(zhì)元素的吸收與轉(zhuǎn)運受到明顯影響，主要是因為土壤中鹽分離子過多使離子產(chǎn)生競爭關(guān)系，影響棉花對其他離子的吸收，從而造成礦質(zhì)養(yǎng)分脅迫，進而導(dǎo)致作物離子穩(wěn)態(tài)的失衡[13]。目前對作物耐鹽堿機制的研究僅對K、Ca、Mg 等元素開展[14]，關(guān)于耐鹽堿機制與離子組間關(guān)系的認識尚存在不足。棉花離子穩(wěn)態(tài)變化中，Na＋是鹽堿脅迫影響棉花耐鹽（堿）機制的關(guān)鍵離子，從Na＋入手研究其分子機理對進一步認識離子穩(wěn)態(tài)的變化有直接幫助。科研工作者在探索離子平衡調(diào)節(jié)基因過程中已取得了顯著成果，如陸許可等[15]分別針對NaCl 和Na2CO3脅迫下棉花基因組甲基化進行分析，為揭示耐鹽機理提供依據(jù)。但對耐鹽分子機制的認知仍有限，因此針對不同鹽堿脅迫下離子穩(wěn)態(tài)重建的關(guān)鍵基因進行研究十分重要。前人已篩選出部分與Na＋轉(zhuǎn)運機制密切相關(guān)的基因，如Gong 等通過基因定位分離技術(shù)發(fā)現(xiàn)Na＋過量的植物體內(nèi)基因AtHKT1 發(fā)生突變[16]，AKT1 基因主要參與 Na＋吸收和維持 K＋平衡[17-18]，SOS1 基因參與 Na＋運輸及外排，降低胞質(zhì) Na＋含量[19]。GhNHX1 參與Na＋運輸和區(qū)域化，保持滲透平衡，降低組織中Na＋含量[20]。因此，通過對這 3 個基因表達量的變化研究Na＋轉(zhuǎn)運機制，對全面闡釋鹽堿脅迫下基因型不同的棉花體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)變化，從而深入揭示鹽（堿）脅迫下棉花的耐鹽（堿）機制具有科學(xué)意義。

綜上所述，目前對不同鹽堿脅迫下棉花耐鹽機制的研究仍存在不足，不同鹽堿脅迫下棉花離子組的響應(yīng)特征仍未明晰。因此，本研究通過對鹽脅迫、堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫下棉花離子組響應(yīng)進行分析，認識和理解不同鹽堿脅迫下棉花離子組特征，闡明不同鹽堿脅迫下棉花Na＋轉(zhuǎn)運分子調(diào)控差異，為深入理解棉花耐鹽堿機制，并通過離子（養(yǎng)分）調(diào)控提高棉花耐鹽性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤取自石河子大學(xué)農(nóng)學(xué)院試驗站農(nóng)田 （44°18′N，86°02′E），取土深度為耕層 0～30 cm。土壤類型為灌耕灰漠土，質(zhì)地為壤土。供試土壤養(yǎng)分含量： 堿解氮 41.2 mg·kg－1，速效磷 10.6 mg·kg－1，速效鉀 244.8 mg·kg－1，有機質(zhì) 14.9 g·kg－1。土壤自然風(fēng)干后，碾碎后過孔徑 2 mm 的篩備用。供試棉花品種為魯棉研24 號。

1.2 試驗設(shè)計

研究采用盆栽試驗，設(shè)置3 種鹽堿脅迫類型（鹽脅迫、堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫），共7 個土壤鹽堿處理，分別為清水對照 （CK）、 低鹽脅迫（S1）、高鹽脅迫（S2）、低堿脅迫（A1）、高堿脅迫（A2）、低復(fù)合鹽堿脅迫（SA1）、高復(fù)合鹽堿脅迫（SA2）。每個處理重復(fù) 5 次，共 35 盆。試驗中，鹽脅迫處理 （S1、S2） 是向供試土壤添加中性鹽Na2SO4和 NaCl（摩爾質(zhì)量比 1∶2）；堿脅迫處理（A1、A2）添加堿性鹽 Na2CO3和 NaHCO3（摩爾質(zhì)量比1∶2）； 復(fù)合鹽堿脅迫處理添加中性鹽和堿性鹽（Na2SO4、NaCl、Na2CO3、NaHCO3摩爾質(zhì)量比1∶2∶2∶4）。各鹽堿處理將中性鹽和堿性鹽配成溶液后加入供試土壤，對照處理加入等量去離子水?；旌暇鶆蚝蠖逊? 個月使土壤鹽分達到平衡。處理后的土壤晾干過孔徑2 mm 的篩后備用；同時，取樣測定不同處理土壤鹽度（飽和電導(dǎo)率ECe）和 pH，結(jié)果見表 1。

表1 不同處理土壤鹽堿度Table 1 Salinity and alkalinity of soil under different treatments

2018 年4 月1 日進行播種，選飽滿一致的種子播種在鹽分與土壤均勻混合的塑料盆（直徑15 cm，高 20 cm）中，播種量為每盆 20 粒，3 片真葉時定苗，每盆留3 株，定期稱量補水，使土壤含水量保持在田間持水量的60%～80%。2018 年7 月3 日上午8：30 取樣，每個處理取主莖功能葉（主莖倒3 完全展開葉）放入冰盒，帶回實驗室洗凈后置于超低溫冰箱儲存，用于測定離子含量。剩余植株樣品，將地上部自莖稈基部剪下，根系采用沖洗法收集（將盆（土壤＋根系）置于尼龍網(wǎng)中，浸泡在流水中沖洗干凈，將完整根系取出裝入自封袋，放入超低溫冰箱進行保存），測定根系形態(tài)與生物量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1生長指標測定。棉花干物質(zhì)質(zhì)量測定，取各處理代表性棉花3 株，室內(nèi)進行分樣（根、莖、葉），在 105 ℃殺青，30 min 后在 70 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量恒定，稱其干物質(zhì)質(zhì)量。根系掃描方法：使用Epson Expression 1600 掃描儀的灰階模式進行掃描，用WinRhizo 系統(tǒng)處理TIF 圖像文件，測定指標為根長、根表面積、根體積，掃描后將根系烘干稱量。

1.3.2離子含量測定。N 含量：采用凱氏定氮法測定[21]。P、Na、K、Ca、Mg、Al、Mn、Zn、Fe、Mo、Sr、Ti 含量：采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（Thermo iCAP 6300，美國賽默飛世爾科技公司）測定。烘干樣用球磨儀研磨，稱取0.200 0 g 樣品，置于四氯乙烯微波消解罐中，沿壁加入8 mL HNO3和 2 mL H2O2，搖勻后靜置 12 h，放入微波消解儀。消解儀設(shè)置如表2。容器冷卻后，取出在通風(fēng)櫥內(nèi)開蓋，在200 ℃進行趕酸后定容。配制待測元素標準曲線采用國家有色金屬及電子材料測試中心的ICP 分析用標準溶液，樣品編號GNM-M221636-2018（100 mg·L－1）。

表2 微波消解儀溫度設(shè)置Table 2 Temperature setting of microwave digestion instrument

1.3.3棉花葉片RNA 提取及耐鹽相關(guān)基因表達分析。采用比較Ct法對棉花基因表達量進行相對定量分析[22]。使用 Takara RNA 提取試劑盒（型號9767，Takara 寶生物工程（大連）有限公司）提取RNA，以 Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （型號 D6110A，Takara 寶生物工程 （大連） 有限公司） 取得cDNA，以GAPDH作為內(nèi)參基因，根據(jù)棉花各基因的非保守區(qū)設(shè)計特異性引物（表3），進行熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng) （Real time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）擴增，檢測每份樣品目的基因和內(nèi)參基因的Ct值（循環(huán)閾值），每份樣品3 次重復(fù)，并且進行3 次獨立的試驗。具體做法如下：棉花待測葉片，經(jīng)檢測合格并定量的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入反應(yīng)混合物進行測定，擴增條件參照趙小潔等[23]。

表3 目的基因熒光定量分析所用引物信息Table 3 Primers used for gene detection by qRT-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理中誤差線與平均值采用MS Excel 2003 軟件分析，使用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計分析，差異顯著性檢驗采用Duncan's 法。層序聚類分析和Na＋相關(guān)性分析采用http://www.metaboanalyst.ca/ 在線分析軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花干物質(zhì)質(zhì)量與生長抑制率

堿脅迫、 鹽脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫3 種脅迫下，棉花地上部干物質(zhì)質(zhì)量隨脅迫程度增加均顯著降低；對于地下部，僅低堿處理對棉花根系無明顯影響，其余處理棉花根系干物質(zhì)質(zhì)量均顯著下降（表4）。棉花受不同類型脅迫后地上部和根系的生長表現(xiàn)并不一致，鹽脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫均顯著影響棉花地上部和根系生長，但堿脅迫主要影響棉花地上部生長。從生長抑制率來看，復(fù)合鹽堿脅迫對棉花地上部的影響最嚴重，低、高脅迫下生長抑制率分別為47.8%和57.9%，其次為堿脅迫和鹽脅迫。對棉花根系的影響為高鹽脅迫和高復(fù)合鹽堿脅迫抑制程度最大，其次為低復(fù)合鹽堿脅迫，低堿脅迫抑制程度最低。從總抑制率來看，高復(fù)合鹽堿脅迫顯著大于鹽脅迫或堿脅迫。

2.2 棉花根系發(fā)育

根系的生長狀況對棉花耐鹽能力起重要影響，試驗過程中可以明顯發(fā)現(xiàn)受脅迫后主根變短，但須根明顯增加。鹽脅迫（S）顯著降低棉花總根長、根總表面積和根總體積，且隨著脅迫程度增加降幅顯著加大，S2 處理各指標較CK 分別降低了48.1%、50.0%和57.1%（表5）。堿脅迫下，A1處理棉花總根長與CK 無顯著差異，A2 處理總根長、 根總表面積和根總體積較CK 分別降低了9.0%、26.6%和36.9%，進一步說明堿脅迫對棉花根系影響相對較小。復(fù)合鹽堿脅迫對根系形態(tài)發(fā)育影響最大，SA1 和SA2 處理總根長分別較CK降低了49.0%和60.3%； 根總表面積和根總體積也顯著降低。

表4 不同鹽堿脅迫下棉花各器官干物質(zhì)質(zhì)量與生長抑制率Table 4 Dry matter weight and growth inhibition rate of cotton under different saline-alkali stresses

表5 不同鹽堿脅迫下棉花根系形態(tài)學(xué)參數(shù)Table 5 Morphological parameters of cotton root under different saline-alkali stresses

2.3 鹽脅迫下棉花離子組變化

由圖1 離子相對含量和離子組變化的層次聚類分析可知，按照元素含量的變化特征，將各器官中13 種元素（離子）分成2 類。在葉片中，第一類：N，其含量隨脅迫程度增加顯著降低；第二類 ：Na、Mo、Zn、Fe、Ti、Mg、Al、P、Ca、Mn、K 和 Sr，其含量較 CK 均顯著增加（圖1A）；S1 和 S2 處理Na 含量較 CK 分別增加 2.3 倍和 4.0 倍（圖1a）。在莖中，第一類：Na、Fe、Al、Sr、Ca、K、Mn、Ti，其含量總體上隨脅迫程度增加而顯著增加； 第二類：Mg、Zn、P、N、Mo，其含量變化趨勢為先增加后降低（圖1B）。在根中，第一類：P、Na、Mo，其含量隨脅迫程度增加總體呈增加趨勢，但P 含量變化不顯著； 第二類：N、Zn、Mg、Mn、Ca、Sr、K、Ti、Al、Fe，除K 先升高后降低外，其他元素含量均隨脅迫程度增加顯著降低（圖1C）。

由圖2 可知，葉片中N 含量顯著降低且與Na 離子呈顯著負相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），其余離子均與 Na 離子呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。莖中Na 含量與 Mg 和 Zn 無顯著相關(guān)性（P＞0.05），與其他元素含量均呈顯著正相關(guān)。根系中Na 含量與 Zn、N、Sr、Al、Mg、Ti、Ca、Mn 和 Fe 顯著負相關(guān)，與 Mo 顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖2 鹽脅迫下棉花葉(a)、莖(b)和根(c)中Na 含量與其他元素含量的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation between the concentration of Na and other elements in leaf (a), stem (b), and root (c) of cotton under salt stress

2.4 堿脅迫下棉花離子組變化

堿脅迫下，棉花各器官Na 離子含量均顯著升高（圖3a、b、c）。A1 和 A2 處理棉花葉片 Na 含量較CK 分別增加1.0 倍和1.8 倍。從離子組變化層次聚類分析來看，葉片中N 含量呈降低趨勢。其余離子分成 2 類： 第一類 P、Ti、Zn、Al 和Fe，其含量變化為先增加后降低； 第二類Mn、Mg、K、Ca、Mo、Na 和 Sr，其含量隨土壤堿性（pH）增加顯著升高（圖3A）。莖稈中，Ti、K 和 Fe 含量呈先增加后降低趨勢，但均高于CK；Mg 離子較CK 顯著降低，Ca、Mo、Al、Mn、Na、Sr、N、P 和 Zn含量隨土壤堿性增加而持續(xù)升高（圖3B）。棉花根系 Na 含量 A1 處理較 CK 降低 12.9%，A2 處理較 CK 增加 16.2%；K、Mo 含量變化與 Na 一致，高堿脅迫處理（A2）較CK 顯著升高；其他元素含量均較 CK 顯著降低，其中 Al、Ti、Mg、N 和Sr 含量隨 pH 增加而呈下降趨勢，Zn、P 和 Mn 含量A1 和 A2 處理間差異不大，Ca 和 Fe 含量 A1處理顯著低于A2 處理（圖3C）。

葉片中，A1 和 A2 處理 N 含量與 Na 呈顯著負相關(guān)（P＜0.05）。莖稈中，Na 含量與 Mg 不顯著負相關(guān)（P＞0.05），與其他元素均呈正相關(guān)，其中Mn、Al、Zn、Ca、Mo、Sr、P 和 N 為顯著正相關(guān)（P＜0.05）。根系 Na 含量與 Mo、K、Fe 和 Ca 呈正相關(guān)，其中Mo、K 為顯著正相關(guān)；與其他元素負相關(guān)，但均未達到顯著水平（圖4）。

2.5 復(fù)合鹽堿脅迫下棉花離子組變化

復(fù)合鹽堿脅迫下，棉花Na 含量也隨脅迫程度增加而明顯升高，SA1 和SA2 處理棉花葉片Na 含量較 CK 分別增加 1.9 倍和 9.1 倍； 但其他離子含量的變化與鹽脅迫和堿脅迫差異明顯（圖5a～c）。葉片中，13 種元素按照其含量的變化特征可分為 2 類：第一類為 Ca、Mg、P、K、Zn，其含量先增加后降低； 第二類為 N、Sr、Al、Fe、Mo、Mn、Na、Ti，除 N 含量在 SA1 處理降低，SA2 處理與CK 無差異外，其他元素含量均隨脅迫程度升高而明顯增加（圖 5A）。莖稈中，第一類 K、Ti、Mn、Mo、Sr、Fe、Na、Al 含量表現(xiàn)為增加趨勢；第二類 P、Ca、Zn、N、Mg 含量先增加后降低，其中 N和Mg 含量在SA2 處理下降幅度較大 （圖5B）。根系中13 種元素也分為兩大類，第一類Ca、Sr、Mg、Al、Mn、Fe、Ti 含量隨脅迫程度升高先增加后降低；第二類為 Na、K、Mo、Zn、N、P，Na 含量隨脅迫程度增加而顯著增加，N、P、K 和Mo 含量均為先降后增，其中K、Mo 含量SA2 處理較CK 分別增加24.3%和67.9%，Zn 含量變化與Na 相反，為隨脅迫程度增加而顯著降低（圖5C）。

圖4 堿脅迫下棉花葉(a)、莖(b)和根(c) Na 含量與其他元素含量的相關(guān)性分析Fig.4 Correlation between the concentration of Na and other elements in leaf (a), stem (b), and root (c) of cotton under alkali stress

葉片 中，Ca、Mg 與 Na 含量相關(guān)性不顯著（P＞0.05），其他離子含量均與 Na 呈正相關(guān)關(guān)系，其中 Sr、Mn、Mo、Fe、Al、Ti 與 Na 含量顯著正相關(guān)（P＜0.05，圖6）。莖稈中，K、Ti、Mn、Mo、Sr、Fe、Al 與 Na 含量顯著正相關(guān) （P＜0.05），Mg、N與 Na 含量呈負相關(guān)關(guān)系（P＞0.05）。根系中，K、Mo 與Na 含量顯著正相關(guān)，P 與 Na 含量不顯著正相關(guān)，Ca、Sr、Mg、Al、Mn、Fe、Ti、Zn 與 Na 含量顯著負相關(guān)（P＜0.05），N 與 Na 含量負相關(guān)，但相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

2.6 基因表達分析

鹽堿條件下，植物受滲透脅迫影響，導(dǎo)致根系缺水產(chǎn)生生理干旱。GhDFR1 基因是與植物干旱脅迫密切相關(guān)的基因[24]?？傮w上，3 種鹽堿脅迫處理GhDFR1 基因相對表達量均較CK 顯著降低；其中，鹽脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫下均為隨脅迫程度增加GhDFR1 基因相對表達量降低，堿脅迫下 A2 處理顯著高于 A1 處理（圖 7 a）。GhSOS1基因相對表達量的提高可以顯著降低植物對Na離子的吸收。如圖7 b 所示，在鹽脅迫（S）下，棉花GhSOS1 基因相對表達量表現(xiàn)為隨脅迫程度升高而顯著增加。在堿脅迫（A）和復(fù)合鹽堿脅迫（SA）下，棉花GhSOS1 基因的相對表達量均表現(xiàn)為隨脅迫程度升高先增加后降低，且SA2 處理與CK無顯著差異。

GhNHX1 基因功能為將過多的Na 離子區(qū)域化在液泡中，降低過多Na 離子對細胞質(zhì)毒害。從圖 7 c 可看出，在 3 種鹽堿脅迫下，GhNHX1 基因相對表達量均顯著提高，但隨脅迫程度增加顯著降低，其中高復(fù)合鹽堿脅迫處理（SA2）的降幅最大，較SA1 降低了49.70%。GhNHX1 基因相對表達量變化表現(xiàn)為鹽脅迫＞堿脅迫＞復(fù)合鹽堿脅迫。GhAKT1 基因相對表達量在鹽脅迫和堿脅迫下均顯著增加 （圖 7 d），其中 S2 較 S1 增加24.40%，A1 與A2 處理差異不顯著； 在復(fù)合鹽堿脅迫下，GhAKT1 基因相對表達量變化為先增加后降低，且SA2 處理較 CK 下降了7.22%，但差異不顯著（P＞0.05）。

3 討論

許多研究表明，鹽堿脅迫對植物各方面均有影響，如生長形態(tài)、生理響應(yīng)和離子含量等[25]。然而目前針對棉花在鹽脅迫、堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫下耐鹽機制差異的研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫、堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫對棉花生長影響并不一致（表1），復(fù)合鹽堿脅迫對棉花干物質(zhì)質(zhì)量的影響顯著大于鹽脅迫或堿脅迫。同時，不同鹽堿脅迫對棉花地上部和根系生長的影響也不一致，鹽脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫對棉花地上部和根系生長均表現(xiàn)出強烈的抑制作用，而堿脅迫對棉花地上部生長的抑制作用大于根系。對3 種鹽堿脅迫下棉花根系形態(tài)變化分析發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下棉花總根長、根總表面積和根總體積均顯著降低，且高鹽脅迫處理（S2）各指標均顯著低于低鹽脅迫處理（S1）。Chachar 等[9]也發(fā)現(xiàn)鹽脅迫會抑制棉花主根的伸長與側(cè)根的發(fā)生。堿脅迫下，低堿處理（A1） 總根長與對照無顯著差異且與干物質(zhì)質(zhì)量變化情況一致，進一步說明低堿脅迫對棉花根系影響較弱[26]。復(fù)合鹽堿脅迫下，棉花根系各指標均顯著低于對照，且復(fù)合鹽堿脅迫對根系形態(tài)的影響顯著大于鹽脅迫或堿脅迫，說明pH 和鹽度的疊加影響會加重脅迫程度。

圖6 復(fù)合鹽堿脅迫下棉花葉(a)、莖(b)和根(c) Na 含量與其他元素含量的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between the concentration of Na and other elements in leaf (a), stem (b), and root (c) of cotton under mixed salt-alkali stress

圖7 不同鹽堿脅迫下棉花 GhDFR1（a）、GhSOS1（b）、GhNHX1（c）和 GhAKT1（d）基因相對表達量Fig.7 Relative expression of cotton GhDFR1 (a), GhSOS1 (b), GhNHX1 (c) and GhAKT1 (d) genes under different saline-alkali stresses

通過在細胞中積累和吸收 Na＋、K＋、Ca2＋等無機離子進行滲透調(diào)節(jié)是植物的一種重要耐鹽機制，但此舉易破壞細胞內(nèi)離子平衡，引起離子毒害[7]。離子毒害的產(chǎn)生是否會引起其他離子的變化已成為研究關(guān)注的熱點。Munns 等[27-28]研究表明，鹽脅迫不僅抑制作物對大量元素（N、P、K、Ca、Mg 和S）的攝取，而且還限制作物對微量元素（Fe、Cu、Zn、Mn、B 等）的吸收，因此導(dǎo)致養(yǎng)分缺失和細胞代謝紊亂。本試驗對3 種不同鹽堿脅迫下棉花體內(nèi)離子組的變化進行相關(guān)研究，共篩選出13 個相關(guān)離子。研究發(fā)現(xiàn)，3 種鹽堿脅迫下棉花植株體內(nèi)Na＋含量尤其是葉片Na＋含量隨土壤鹽堿度的增加顯著增加；其中復(fù)合鹽堿脅迫下葉片Na＋含量的增幅高于鹽脅迫和堿脅迫。杜遠鵬等[29]研究也表明堿性鹽（NaHCO3）和中性鹽（NaCl）處理顯著增加植物體內(nèi)Na 含量，這與本研究結(jié)果基本一致。微量元素Mo 是硝酸還原酶的主要成分，直接影響氮代謝。本研究中，不同鹽堿脅迫下棉花體內(nèi)Mo 含量均顯著增加，與Na＋含量呈顯著正相關(guān)。湯菊香等[30]研究發(fā)現(xiàn)施用Mo 會提高棉花耐鹽性，且隨著土壤pH 升高，Mo的有效性增強，因此Mo 對棉花耐鹽堿性有一定影響。3 種鹽堿脅迫的棉花離子組對比分析表明，鹽脅迫和堿脅迫下Ca 和Mg 離子向地上部轉(zhuǎn)運，而復(fù)合鹽堿脅迫下Ca 和Mg 主要在根系積累；鹽脅迫和堿脅迫下棉花對Zn、Mn 和Fe 的轉(zhuǎn)運能力也強于復(fù)合鹽堿脅迫。這說明pH 和鹽度的疊加效應(yīng)會抑制這些離子向地上部運輸。肖鑫輝等[31]研究也發(fā)現(xiàn)高鹽脅迫下大豆葉片中Ca 和Mg 含量增加。本研究中，3 種鹽堿脅迫下，棉花根和葉片N 含量顯著降低，說明N 素吸收和轉(zhuǎn)運均受到抑制。從P 含量的變化看，鹽脅迫下，根系P 含量無明顯變化，莖、葉P 含量增加，且低鹽和高鹽脅迫處理間無差異；堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫下，根系P 含量降低，莖、葉P 含量增加，但高脅迫處理顯著低于低脅迫處理。這表明高pH 環(huán)境會抑制棉花P 素吸收和轉(zhuǎn)運。田志杰[32]研究也表明堿脅迫抑制了水稻P 素吸收和轉(zhuǎn)運。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同鹽堿脅迫下棉花植株K 含量尤其是葉片K 含量顯著增加，3 種鹽堿脅迫下K 含量的增幅表現(xiàn)為堿脅迫＞鹽脅迫＞復(fù)合鹽堿脅迫。王寧等[8]研究表明，鹽脅迫顯著降低棉花地上部和根系K 含量。本研究結(jié)果與前人的研究存在差異，可能與供試棉花品種有關(guān)。前期研究表明，魯棉研24 號對不同鹽堿脅迫均具有較好的耐受性[33]。此外，對調(diào)控 K＋轉(zhuǎn)運的GhAKT1 基因相對表達量的測定結(jié)果也表明，不同鹽堿脅迫下，GhAKT1 基因相對表達量顯著增加（除高復(fù)合鹽堿脅迫處理與對照無差異外）。說明魯棉研24 號具有較強的耐鹽性，在一定的鹽堿脅迫下能夠促進體內(nèi)K 離子的轉(zhuǎn)運來抵消Na 離子積累所帶來的負面影響。韓浩章等[34]研究也發(fā)現(xiàn)，高鹽堿脅迫下樟樹幼苗增加對K 和Na 的吸收，但降低對P 的吸收。Al、Sr 和 Ti 是有益元素，其含量變化是由于其他離子變化引起，屬于伴隨離子，與植物耐鹽堿性無關(guān)。

本研究進一步對不同鹽堿脅迫下棉花體內(nèi)離子變化的原因進行探討。有研究發(fā)現(xiàn)在冷害和干旱等脅迫下，植物DFR1 基因過量表達顯著提高植物抗逆性[35]。但本研究表明，不同鹽堿脅迫下棉花GhDFR1 基因相對表達量均顯著降低，可能由于脅迫類型不同導(dǎo)致。GhSOS1 基因相對表達量的提高可以顯著促進Na＋外排，減少Na＋在細胞中的積累。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫下棉花GhSOS1基因相對表達量呈增加趨勢，而在堿脅迫和復(fù)合鹽堿脅迫下均為先增后降，說明適當(dāng)?shù)膒H 值會促進GhSOS1 基因表達，但當(dāng)pH 過高則產(chǎn)生抑制作用。GhNHX1 基因功能為將過多的Na＋進行區(qū)隔化，降低過多Na＋對細胞質(zhì)毒害，調(diào)節(jié)棉花體內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，3 種鹽堿脅迫下GhNHX1 基因相對表達量均先顯著提高，但隨脅迫程度增加又顯著降低；其中，高復(fù)合鹽堿脅迫處理（SA2）的降幅最大。董祿祿等[36]報道 NaCl 脅迫下長葉紅砂 （Reaumuria trigyna）RtNHX1 基因表達量也表現(xiàn)出相同的變化趨勢。推測可能當(dāng)鹽堿脅迫達到一定程度后，其他耐鹽方式被激活，無須大量轉(zhuǎn)錄GhNHX1 基因，導(dǎo)致其表達量下降；也可能是由于鹽堿脅迫超過植物耐鹽臨界濃度，破壞了其耐鹽機制，導(dǎo)致GhNHX1 表達量下降。鹽堿脅迫下植物維持體內(nèi)Na/K 穩(wěn)態(tài)是抵御脅迫的主要方式之一，AKT1 基因是K 離子通過根系向地上部運輸?shù)闹饕ǖ阑騕37]。在本研究中，鹽脅迫下，GhAKT1 基因相對表達量隨土壤鹽度升高而顯著增加； 堿脅迫下，GhAKT1 基因相對表達量顯著增加，低堿脅迫和高堿脅迫無明顯差異。這表明鹽脅迫和堿脅迫均會促進棉花體內(nèi)K＋轉(zhuǎn)運。但在復(fù)合鹽堿脅迫下，GhAKT1 基因相對表達量隨鹽堿度增加呈先增后降趨勢，且高復(fù)合鹽堿脅迫處理顯著降低，可能是由pH 和鹽度二者疊加效應(yīng)導(dǎo)致。本研究未對其他K＋調(diào)控途徑進行研究[38]，所以還要進一步對棉花體內(nèi)K＋變化做深入分析和解釋。

4 結(jié)論

復(fù)合鹽堿脅迫對棉花生長的抑制作用大于鹽脅迫或堿脅迫。3 種鹽堿脅迫下，棉花Na、K、Mo 含量增加，N 含量降低； 其中復(fù)合鹽堿脅迫Na 含量增加最多，K 含量增幅最小。同時，復(fù)合鹽堿脅迫下，高鹽度和pH 疊加效應(yīng)顯著抑制Ca、Mg、Zn、Mn、Fe 的轉(zhuǎn)運；此外，高 pH 環(huán)境還會抑制P 的吸收和轉(zhuǎn)運。不同鹽堿脅迫下，Gh-SOS1、GhNHX1 和GhAKT1 基因過量表達調(diào)控K、Na 吸收和轉(zhuǎn)運是棉花重要的耐鹽堿機制之一。復(fù)合鹽堿脅迫下棉花調(diào)控K、Na 吸收和轉(zhuǎn)運的能力顯著低于鹽脅迫或堿脅迫下。