內(nèi)生和根際細(xì)菌對(duì)棉花防御酶活性誘導(dǎo)和黃萎病防治作用

李雪艷，黨文芳，楊紅梅,3，楚敏,3，高雁，曾軍，霍向東，張濤，林青，歐提庫爾，李玉國，婁愷，史應(yīng)武,3*

（1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/ 新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊830052；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西北綠洲農(nóng)業(yè)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊830091）

棉花黃萎病嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)，是限制棉花生產(chǎn)最主要病害之一[1-2]。拮抗細(xì)菌誘導(dǎo)抗性防治棉花黃萎病的研究尚處于初級(jí)階段[3]，探索拮抗菌對(duì)棉花誘導(dǎo)抗性對(duì)該土傳病害防治具有重要指導(dǎo)價(jià)值和理論意義。

在我國，棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的土傳病害，目前還未攻克其防治技術(shù)的原因主要是大麗輪枝菌無明顯的寄主?；?、致病機(jī)理復(fù)雜、傳播途徑多、高抗品種抗性喪失快、微菌核能長期存活等[4]。棉花黃萎病防治一直是棉花種植業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)問題，目前常見的防治方法包括農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)藥劑防治和生物防治。生物防治由于綠色、安全等特點(diǎn)已成為學(xué)者優(yōu)先選擇的研究對(duì)象。植物誘導(dǎo)抗性是生物防治黃萎病的途徑之一。植物誘導(dǎo)抗性又稱植物免疫或系統(tǒng)獲得抗性，是指植物受到外界刺激后，既快又強(qiáng)地提高自身免疫防御酶[包括過氧化氫酶（Catalase）、過氧化物酶（Peroxidase）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase）、 多酚氧化酶 （Polyphenol oxidase）]活性和抗菌性植保素、酚類、丙二醛等含量，形成自我保護(hù)的天然屏障，阻礙病原菌的侵染。在眾多的生防菌中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）憑借分布范圍廣、易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)、廣譜抑菌等優(yōu)點(diǎn)而受到青睞[5-6]。有很多報(bào)道表明，芽孢桿菌能激發(fā)植株誘導(dǎo)抗性達(dá)到抑制病原菌生長、繁殖、侵染的目的，例如：Akram 等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌菌株在分根系統(tǒng)和田間條件下能誘導(dǎo)番茄對(duì)枯萎病的抗性[7]；喬俊卿等發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌PTS-394 能誘導(dǎo)番茄對(duì)灰霉病產(chǎn)生抗性[8]；趙玉華等報(bào)道枯草芽孢桿菌EBS05 產(chǎn)生的surfactin誘導(dǎo)煙草對(duì)花葉病毒（Tobacco mosaic virus）產(chǎn)生抗性[9]，張亮等也發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌對(duì)番茄誘導(dǎo)抗性是其防治番茄枯萎病的機(jī)理[10]，張濤等發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌防治棉花黃萎病機(jī)理與誘導(dǎo)抗性有關(guān)[11]，周京龍等也發(fā)現(xiàn)棉花內(nèi)生蠟狀芽孢桿菌YUPP-10能誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)來抵抗病原菌的侵染和擴(kuò)展[12]。綜上，利用拮抗菌對(duì)植株的誘導(dǎo)抗性是防治棉花黃萎病的有效途徑之一。

本實(shí)驗(yàn)室從新疆棉花植株根際及體內(nèi)分離篩選出4 株芽孢桿菌屬拮抗菌，但其防治棉花黃萎病的機(jī)理與棉花誘導(dǎo)抗性相關(guān)的防御酶是否相關(guān)還不清楚。因此，本研究通過平板培養(yǎng)檢測(cè)4株芽孢桿菌的拮抗性，通過溫室盆栽試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)其對(duì)棉花黃萎病的防治效果，并檢測(cè)棉花葉片中防御酶活性變化，為生物防治棉花黃萎病提供新途徑及科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

供試棉花品種：新陸早36 號(hào)。

供試菌株：由本實(shí)驗(yàn)室從新疆棉花植株根際及體內(nèi)分離篩選，鑒定為Bacillus vanilleaSMT-24（根際），B.velezensisBHZ-29（內(nèi)生），B.subtilisSHT-15（根際），B.atrophaeusSHZ-24（內(nèi)生 ），GenBank 登錄號(hào)分別為：MG470750、MG470759、MG470679、MG470659。大麗輪枝菌由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所劉海洋提供。

盆栽土壤：新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)基地提供。

培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯（Nutrient broth，NB）培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂（Nutrient agar，NA）培養(yǎng)基，查比克（Czapek）培養(yǎng)基，馬鈴薯葡萄糖瓊脂（Potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1供試細(xì)菌及大麗輪枝菌發(fā)酵液制備。采用劃線法分離拮抗菌單菌落，用竹簽挑取單菌落接種至NB 液體培養(yǎng)基，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL，30 ℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng) 2 d 后作為發(fā)酵液，將發(fā)酵液按照3%體積量接入NB 培養(yǎng)基，NB 培養(yǎng)基每500 mL 三角瓶裝液量為200 mL，30 ℃、180 r·min－1振蕩培養(yǎng) 6 d 即為拮抗菌發(fā)酵液（活菌含量 108mL－1）。將 4 ℃保存的大麗輪枝菌竹簽挑取少許菌塊倒貼接種到PDA 固體平板培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)15 d 后，用打孔法制備直徑6 mm 的小菌餅。查比克培養(yǎng)基每個(gè)500 mL 三角瓶裝液量為200 mL，每瓶接種15個(gè)菌餅，28 ℃、150 r·min－1振蕩培養(yǎng) 7 d 即為大麗輪枝菌培養(yǎng)液。

1.2.2供試菌株拮抗性檢測(cè)。將大麗輪枝菌發(fā)酵原液（孢子含量 107mL－1）稀釋至 10－2，震蕩均勻，用移液器取 100 μL 于 PDA 平板培養(yǎng)基，混勻涂布，用直徑6.00 mm 的打孔器打孔，挑去孔內(nèi)PDA，將100 μL 拮抗菌發(fā)酵液加入孔內(nèi)，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d，拍照記錄結(jié)果。

1.2.3棉苗盆栽種植。將180 ℃滅菌3 h 的無菌土裝至種植棉花卡槽的2/3 處放置托盤中，灌水至托盤，表層土壤濕潤后將顆粒飽滿的棉種每槽種植2 粒，覆土3 cm，撫平輕壓表層土壤，放置于智能培養(yǎng)箱出苗，播種后常規(guī)溫室管理，晝/ 夜光照時(shí)間與溫度分別為13 h/11 h、26 ℃/24 ℃，相對(duì)濕度60%，光照強(qiáng)度6 萬lx。

1.2.4大麗輪枝菌傷根法接種。打開種植棉花的塑料卡槽，將長至兩葉一心的棉苗距根底部2～3 cm 處用剪刀人工傷根，每卡槽棉株傷根處灌溉大麗輪枝菌培養(yǎng)液 （孢子含量 105mL－1）10 mL，合緊卡槽放置托盤，全部標(biāo)記為VD，在智能培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5接種拮抗菌。接種大麗輪枝菌6 d 后，將SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24 菌 株 發(fā) 酵 液（活菌含量 108mL－1） 均以每槽 10 mL 均勻灌溉棉苗根部表層土壤，每種拮抗菌各灌溉3 盆作為3 個(gè)平行試驗(yàn)（每盆 4 列 7 行，共計(jì) 28 個(gè)卡槽）。標(biāo)記處理組編號(hào)為（VD＋SMT-24，VD＋BHZ-29，VD＋SHT-15，VD＋SHZ-24），對(duì)照 VD 接種同體積滅菌NB 培養(yǎng)基，繼續(xù)放置于智能培養(yǎng)箱培養(yǎng)，拮抗菌發(fā)酵液分3 次灌溉，每次間隔6 d。

1.2.6拮抗菌在根部土壤中的定植量。第3 次接種拮抗菌2 d 后，每處理每個(gè)平行試驗(yàn)取1 行卡槽中棉苗，取苗后將根部土壤抖落收集，混勻，自然風(fēng)干，稱量5 g 于250 mL 三角瓶，加入滅菌生理鹽水 45 mL，25 ℃、180 r·min－1振蕩 2 h，取10－4、10－5稀釋梯度在 NA 固體培養(yǎng)基上涂布，放置在30 ℃恒溫箱培養(yǎng)2 d，根據(jù)4 株拮抗菌的菌落形態(tài)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，菌落數(shù)在30～300 之間的平板作為菌落計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，5 d 取樣1 次，共計(jì)數(shù)5 次。

1.2.7棉株生物量測(cè)量。將1.2.6 步驟中的棉苗根部沖洗干凈，隨機(jī)選擇每處理組及對(duì)照組4～7株棉苗，統(tǒng)計(jì)棉苗的株高、根毛數(shù)、葉片數(shù)、根長。

1.2.8葉片保護(hù)酶活性的測(cè)定。參照Mahunu等[13]的方法處理1.2.5 得到的棉苗葉片，提取粗酶液，用于檢測(cè) POD、PPO、CAT、SOD 活性，其中用硼酸鹽緩沖液（pH 8.8）代替磷酸鈉緩沖液，其余操作不變，上清液用于檢測(cè)PAL 活性。以O(shè)D值變化 0.01 為 1 個(gè)酶活力單位（U），POD、PPO、CAT 的OD值 10 s 記錄 1 次，共計(jì) 1 min，PAL記錄30 min 內(nèi)OD值變化，活性以每克新鮮組織質(zhì)量（U·g－1）表示。

POD 活性測(cè)定：參照文獻(xiàn)[14]的方法配制溶液及測(cè)定，加入試劑依次為0.1 mL 粗酶液，0.03 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的愈創(chuàng)木酚、2.84 mL 磷酸緩沖液（50 mmol·L－1，pH 6.4），混勻后于 30 ℃水浴中保溫 5 min，加入 0.03 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.3%的H2O2（50 mmol·L－1，pH 6.4 磷酸鈉制備），以加入0.03 mL 蒸餾水作對(duì)照，調(diào)零后立即在470 nm 波長處測(cè)量吸光度值。

PPO 活性測(cè)定： 依次加入1.9 mL 磷酸緩沖液 （0.05 mol·L－1，pH 6.8） 和 1 mL 0.02 mol·L－1鄰苯二苯酚溶液，混勻后于30 ℃水浴中保溫5 min 后加入0.1 mL 粗酶液，以蒸餾水代替粗酶液作對(duì)照調(diào)零，立即在398 nm 波長處測(cè)定。

CAT 活性測(cè)定：反應(yīng)混合物由2.87 mL 磷酸鈉 緩 沖 液 （50 mmol·L－1，pH 7.0），0.1 mL 40 mmol·L－1H2O2和 0.03 mL 粗酶液組成，以蒸餾水代替酶液作對(duì)照調(diào)零，記錄240 nm 波長處吸光度下降值。

PAL 活性測(cè)定： 反應(yīng)混合物由2.7 mL 硼酸緩沖液 （0.1 mol·L－1，pH 8.8），0.2 mL 的 L- 苯丙氨酸（0.02 mol·L－1，用硼酸緩沖液配制），0.1 mL粗酶液組成，混勻后在290 nm 處立即測(cè)定初始值，放置30 ℃下反應(yīng)30 min 后立即取出，在290 nm 波長下測(cè)定吸光值。

SOD 活性測(cè)定：參照 Wang 等[15]的測(cè)定方法微修改為光照強(qiáng)度60 萬lx，光照時(shí)間為2 min。

1.2.9病情調(diào)查和統(tǒng)計(jì)[16]。第3 次接種拮抗菌株后2 d 時(shí)，調(diào)查病情指數(shù)，統(tǒng)計(jì)每盆后3 行棉苗。以株為單位，統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)與每株總?cè)~片數(shù)，發(fā)病等級(jí)＝（患病葉片數(shù)/每株總?cè)~片數(shù)）×4。分級(jí)按照 5 級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)：0 級(jí)，無病植株；1 級(jí)，（0，25%]葉片發(fā)病的植株；2 級(jí)，（25%，50%]葉片發(fā)病的植株；3 級(jí)，（50%，75%]葉片發(fā)病的植株；4級(jí)，75%以上葉片發(fā)病的植株。按照下列公式計(jì)算病情指數(shù)： 病情指數(shù)＝（∑各級(jí)病株數(shù)×相應(yīng)病級(jí)）/（總株數(shù)×最高病級(jí)）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株在平皿中對(duì)大麗輪枝菌的抑菌作用

由圖1 可知，4 株拮抗菌均表現(xiàn)出良好的抑制大麗輪枝菌的作用。從抑菌現(xiàn)象看，SMT-24 菌株抑菌效果最好，其次為BHZ-29 菌株，SHT-15與SHZ-24 效果較差。從拮抗結(jié)果看，4 株菌株均可作為潛在的黃萎病生防菌。

圖1 平皿檢測(cè)4 株菌對(duì)大麗輪枝菌的抑菌作用Fig.1 Plate detection of four strains of bacteria against Verticillium dahliae

2.2 棉苗根部拮抗菌定植數(shù)量

棉苗根部拮抗菌定植數(shù)量結(jié)果（圖2）顯示，菌株BHZ-29 和 SHZ-24 在土壤中的適應(yīng)性良好，定植量較高，菌株SMT-24 次之，菌株SHT-15定植量較低。菌株 SMT-24、BHZ-29、SHZ-24 在接種后2～7 d 內(nèi)定植量均下降，接種后7～22 d，菌株 SMT-24、SHZ-24 定植數(shù)量逐漸增加，而BHZ-29 菌株在接菌后7～17 d 逐漸增加，17～22 d 又下降。菌株 SHT-15 在接菌后 2～7 d 數(shù)量減少較快，7～22 d 數(shù)量變化小。在接菌后 2～22 d，SMT-24、BHZ-29、SHZ-24 的定植數(shù)量與 SHT-15差異顯著。

2.3 拮抗菌對(duì)棉株的促生作用

圖2 4 株拮抗菌在棉苗根部的定植數(shù)量隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of colonization of four strains of antagonistic bacteria in cotton seedling roots with time

由圖3 趨勢(shì)可知，拮抗菌接種后2～22 d，處理組株高、葉片數(shù)和根毛數(shù)與對(duì)照組相比均有一定程度的升高，但根長處理組與對(duì)照組相比無明顯的升高。VD＋SMT-24、VD＋BHZ-29 處理組中平均株高在2～17 d 時(shí)間段呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，VD＋SMT-24、VD＋SHT-15 處理組平均葉片數(shù)及平均根毛數(shù)在2～17 d 時(shí)間段也呈現(xiàn)增長趨勢(shì)，其他處理組無明顯規(guī)律。由多重比較結(jié)果可知，株高除 VD＋SHT-15 接種后 7 d、VD＋SMT-24 接種后 2 d，VD＋BHZ-29 接種后 2 d、7 d 和 VD＋SHZ-24 接種后 2 d、12 d 外，其他時(shí)間點(diǎn)處理組均顯著高于對(duì)照組；根毛數(shù)除VD＋SMT-24 接種后2 d 和VD＋SHZ-24 接種后17 d 外，其余時(shí)間點(diǎn)處理組均和對(duì)照差異顯著； 根長除VD＋SMT-24 接種后 22 d、VD＋SHZ-15 接種后 12 d和VD＋BHZ-29 接種后17 d 外，其他時(shí)間點(diǎn)處理組與對(duì)照組差異均不顯著；4 株拮抗菌處理組的葉片數(shù)均顯著高于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，4 株拮抗菌處理提高了棉株株高、 葉片數(shù)和根毛數(shù)，能促進(jìn)棉株生長。

圖3 拮抗細(xì)菌接種后對(duì)棉株株高、根長、葉片數(shù)和根毛數(shù)的影響Fig.3 Effect of antagonistic bacteria on plant height, root length, number of leaves and number of root hairs of cotton plants after inoculation

2.4 防御酶活性測(cè)定

由圖4 可知，接種后 SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24 菌株在一定時(shí)間內(nèi)可提高棉葉CAT、SOD、POD、PAL 活性。CAT 活性除 VD＋SMT-24接種后 17 d 和 22 d、VD＋BHZ-29 接種后 17 d和 22 d、VD＋SHT-15 接種后 7 d 和 22 d、VD＋SHZ-24 接種后 2 d、17 d 外，其余時(shí)間點(diǎn)處理組與對(duì)照組 （VD） 差異均顯著； 除接種后7 d 外，VD＋SMT-24、VD＋BHZ-29、VD＋SHT-15 處理組其余時(shí)間點(diǎn)SOD 活性均高于對(duì)照組，VD＋SHZ-24 處理組在接種后12～22 d 內(nèi) SOD 活性高于對(duì)照組； 在接種后 17～22 d，VD＋SMT-24、VD＋BHZ-29 和 VD＋SHZ-24 的處理組 PAL 活性均高于對(duì)照組； 菌株處理組棉葉POD 活性在接種后12～22 d，均高于對(duì)照組；而PPO 活性在接種后2 d 時(shí)，處理組和對(duì)照組差異顯著，其中僅VD＋BHZ-29 高于對(duì)照組，7～17 d 之間處理組與對(duì)照組無明顯差異，在接種后22 d 時(shí)，僅VD＋BHZ-29、VD＋SHT-15 與對(duì)照組差異顯著，且高于對(duì)照組。

圖4 拮抗菌對(duì)系統(tǒng)誘導(dǎo)酶活性的影響Fig.4 Effect of antagonistic bacteria on system-induced enzyme activity

2.5 拮抗菌對(duì)棉花黃萎病的防治效果測(cè)定

測(cè)定4 株菌株對(duì)棉花黃萎病的防治效果，結(jié)果如圖5A 所示，對(duì)照組與處理組棉苗已經(jīng)出現(xiàn)感病癥狀，子葉部分感病。由圖5B 病情統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，對(duì)照組棉苗病情指數(shù)達(dá)15.08，與處理組差異顯著。處理組中，SMT-24、SHT-15 菌株病情指數(shù)較低，分別為 3.88 和 3.44；BHZ-29 菌株病情指數(shù)較高，SHZ-24 菌株病情指數(shù)最高，分別為4.17、5.49。從病情指數(shù)結(jié)果得出，4 株拮抗菌均能在一定程度上控制棉花黃萎病，其中SHT-15防治效果最好，SMT-24、BHZ-29 次之，SHZ-24較差。

圖5 棉花黃萎病發(fā)病程度與病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)分析Fig.5 The degree and statistical analysis of disease index of cotton Verticillium wilt of each treatment

3 討論

3.1 拮抗菌株SMT-24、BHZ-29、SHT-15、SHZ-24對(duì)棉花防御酶系的誘導(dǎo)作用

本研究選用新疆本土芽孢桿菌菌株研究其對(duì)棉花防御酶系的誘導(dǎo)作用，為更科學(xué)防治當(dāng)?shù)孛藁S萎病提供理論支撐，并為棉花黃萎病的防治提供物質(zhì)儲(chǔ)備。平皿試驗(yàn)結(jié)果說明，4 株拮抗菌均可以抑制大麗輪枝菌的生長繁殖。接種后，SMT-24、BHZ-29、SHZ-24 在根系土壤中的活菌數(shù)出現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，SHT-15 菌株定植數(shù)量隨著時(shí)間減少，說明4 株拮抗菌均可在根系土壤定植，占領(lǐng)根系生態(tài)位，并且 SMT-24、BHZ-29、SHZ-24 菌株比 SHT-15 更加適應(yīng)土壤的環(huán)境。加入4 株拮抗菌一定程度上提高了棉苗的株高、根毛數(shù)、葉片數(shù)，說明4 株拮抗菌能不同程度促進(jìn)棉苗的生長。劉玉濤等也報(bào)道了相似研究結(jié)果：2 株鏈霉菌D74 和Act12 提高防御酶活性的同時(shí)促進(jìn)植株的生長[17]。

防御酶 CAT、SOD、PAL、PPO、POD 是植物體內(nèi)抵制病原侵染的有關(guān)物質(zhì)，其活性的變化通常作為衡量植物體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)的重要指標(biāo)[5]。CAT 在植物細(xì)胞內(nèi)清除H2O2和維持其在正常水平，減輕活性氧所造成的損傷[18]；POD 能夠防止活性氧引起傷害，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)自由基水平[19]；SOD是植物體內(nèi)的抗氧化劑，將O2－轉(zhuǎn)化成誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的起始激發(fā)分子H2O2；PAL 調(diào)控酚類物質(zhì)、木質(zhì)素合成[20]。本研究中，接種拮抗菌在一定時(shí)間范圍內(nèi)能提高棉花CAT、SOD、PAL、POD活性，說明接種4 株拮抗菌能刺激棉花體內(nèi)部分防御酶活性在一段時(shí)間內(nèi)提高，并不是持續(xù)誘導(dǎo)提高防御酶活性。

3.2 防治效果及不足

溫室盆栽試驗(yàn)表明，4 株拮抗菌均可顯著降低棉花黃萎病的病情指數(shù)，并表現(xiàn)出良好的土壤環(huán)境適應(yīng)能力，但拮抗菌還是會(huì)受大田地域、氣候條件、土壤理化性質(zhì)等影響，應(yīng)用大田后是否能達(dá)到預(yù)期防治效果，是否能穩(wěn)定持久，還需長時(shí)間、多地域的田間試驗(yàn)驗(yàn)證[21-22]。

4 結(jié)論

在溫室中，4 株芽孢桿菌屬細(xì)菌均可抑制大麗輪枝菌生長，定植于棉花根系土壤中，提高棉株株高、葉片數(shù)、根毛數(shù)，并顯著降低棉花黃萎病病情指數(shù)，通過在一定時(shí)間內(nèi)提高棉花防御酶CAT、SOD、PAL、POD 活性，增強(qiáng)棉花抗病性。