豬PLA2G4A 基因單核苷酸多態(tài)性及其與飼料報(bào)酬性狀的關(guān)聯(lián)分析

汪楷庭，周榆淞，黃上真，蔣 堯，付 璐，孟慶利，馬小軍，丁向東*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家畜禽工程實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.北京中育種豬有限責(zé)任公司，北京 102200）

豬肉是世界第一大肉類(lèi)消費(fèi)品，中國(guó)是全世界生豬生產(chǎn)量及消費(fèi)量最大的國(guó)家。當(dāng)前我國(guó)生豬生產(chǎn)中飼料成本占總成本的60% 以上[1]，豬對(duì)飼料的利用情況與生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)效益密不可分。當(dāng)前飼料價(jià)格不斷上漲，飼料原料資源日趨緊張，通過(guò)提高豬的飼料報(bào)酬對(duì)降低成本十分重要，同時(shí)可減少我國(guó)的飼料用糧，緩解人畜爭(zhēng)地、爭(zhēng)糧的困境。飼料報(bào)酬評(píng)定經(jīng)歷了2 個(gè)發(fā)展階段：20 世紀(jì)后期常用飼料轉(zhuǎn)化率（Feed Conversion Ratio，F(xiàn)CR）、平均日增重（Average Daily Gain，ADG）、平均日采食量（Average Daily Feed Intake，ADFI）等作為衡量飼料報(bào)酬性狀的指標(biāo)，2000 年以后因電子飼喂設(shè)備的更新和采食量測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，1963 年Koch 等[2]提出的剩余采食量（Residual Feed Intake，RFI）指標(biāo)逐漸被廣泛采用。多項(xiàng)研究表明飼料報(bào)酬性狀具有遺傳性，大白豬和杜洛克豬的FCR 的遺傳力為0.15～0.41，而RFI 的遺傳力為0.14～0.38[3]。遺傳學(xué)家和育種工作者逐步發(fā)現(xiàn)了與飼料報(bào)酬有關(guān)的基因，如黑素皮質(zhì)素受體4[4]、瘦素基因[5]、增食欲素基因[6]、脂肪和肥胖相關(guān)基因[7]等。

PLA2G4A（PhospholipaseA2，Group IVA）又 叫cPLA2、PLA2G4、cPLA2-alpha，屬于胞漿型的磷脂酶A2，是由至少10 組亞型組成的一族膜磷脂選擇性水解酶，是磷脂生成花生四烯酸的關(guān)鍵酶。近年來(lái)，作為介導(dǎo)花生四烯酸生成的關(guān)鍵酶基因PLA2G4A，因其在生長(zhǎng)性狀方面的重要表現(xiàn)和在早期脂肪細(xì)胞分化和肥胖中發(fā)揮重要作用而得到較多學(xué)者關(guān)注。Qiu 等[8]在研究黃姑魚(yú)的遺傳連鎖圖譜時(shí)，發(fā)現(xiàn)PLA2G4A是生長(zhǎng)相關(guān)QTL 區(qū)域的重要生長(zhǎng)基因。Harris 等[9]在對(duì)獼猴抗肥胖研究中，發(fā)現(xiàn)磷脂酶A2（PLA2G4A）與體重的持續(xù)穩(wěn)定和胰島素敏感性顯著相關(guān)。Hartiala 等[10]在研究PLA2G4A 與心機(jī)梗死的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，PLA2G4A 通過(guò)飲食中攝入的脂肪酸來(lái)影響疾病發(fā)生。Vogel 等[11]在研究肥胖相關(guān)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)，磷脂酶PLA2G4A 在肥胖受試者的脂肪組織中高表達(dá)。鑒于PLA2G4A 在生長(zhǎng)性狀方面的重要表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)小組前期使用豬80K SNP 芯片進(jìn)行的全基因組關(guān)聯(lián)分析（未發(fā)表），發(fā)現(xiàn)豬PLA2G4A基因與飼料報(bào)酬性狀存在相關(guān)，為此本研究選擇豬PLA2G4A基因作為豬飼料報(bào)酬性狀的候選基因進(jìn)行深入分析。

本實(shí)驗(yàn)以166 頭來(lái)自北京中育種豬有限責(zé)任公司的大白豬作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)PCR 擴(kuò)增PLA2G4A的部分片段，并且使用雙脫氧核苷酸對(duì)目的片段進(jìn)行測(cè)序和分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列比對(duì)的方法尋找SNPs，最后分析其與飼料報(bào)酬性狀的關(guān)系，旨在為豬飼料報(bào)酬性狀的遺傳改良工作提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 本實(shí)驗(yàn)以2016 年出生于北京中育種豬有限責(zé)任公司的166 頭大白豬為材料?；蚪M提取所采用材料均為豬耳組織，耳組織樣保存于70% 乙醇中，-20℃凍存。飼料報(bào)酬性狀為ADFI、FCR、RFI、ADG，由奧斯本自動(dòng)飼喂系統(tǒng)110 kg 左右結(jié)束測(cè)定后處理獲得。

1.2 方法

1.2.1 豬基因組DNA 的提取及質(zhì)量檢測(cè) 豬基因組DNA 通過(guò)血液/組織/細(xì)胞基因組DNA 提取試劑盒（離心柱型）進(jìn)行提取，由北京天根生物科技公司提供試劑盒。根據(jù)核酸分子中的堿基具有共軛雙鍵，能夠吸收紫外光的原理，用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定OD260nm、OD280nm值。用Nanodrop2000 儀器檢測(cè)。根據(jù)測(cè)定出的DNA 樣品濃度，取1～2 μL 基因組DNA 于配置好的1% 瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測(cè)DNA 質(zhì)量，用滅菌水將DNA 濃度統(tǒng)一稀釋至100 ng/μL。最后在70% 乙醇中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 登陸Ensembl 網(wǎng)站（http://asia.ensembl.org/index.html）Gene 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得豬的PLA2G4A基因序列，序列號(hào)為ENSSSCG00000023351。利用軟件Primer 5.0 進(jìn)行自動(dòng)搜索并用軟件Oligo 7.0 進(jìn)行分析，共使用24 對(duì)引物（表1）。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系和條件 15 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（用于酶切反應(yīng)之前的PCR 擴(kuò)增）：DNA 1 μL，10×Buffer 1.5 μL，25 mmol/L MgCL21.5 mL，10 mmol/L DNTP 0.3 μL，10 μmol/L 上、下游引物分別0.15 μL/條，5 U/μL Taq 酶0.2 μL，H2O 補(bǔ) 至15 μL。20 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系（混池測(cè)序擴(kuò)增體系）：去離子水1 μL，Taq 酶10 μL，上、下游引物各1 μL，模板DNA 1 μL。

1.2.4 混池測(cè)序 將所提DNA 混合進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，本實(shí)驗(yàn)采用20 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系。PLA2G4A基因引物順序號(hào)為1、2、3、10、12、17、19、23 的擴(kuò)增反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，57.2℃退火15 s，72℃延伸10 s，34 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存。PLA2G4A基因引物順序號(hào)為4、5、6、7、8、9、11、13、14、15、16、18、20、21、22、24 的擴(kuò)增的反應(yīng)條件：96℃預(yù)變性3 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸10 s，34 個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存。PCR 產(chǎn)物均用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并送交上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 基因型分型 在進(jìn)行酶切之前首先進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，采用15 μL 的PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系。PLA2G4A基因 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，35 個(gè)循環(huán)；72℃延伸3 min，最后4℃保存。PCR 產(chǎn)物取3 μL 用ExoI和FastAP 純化，主要是用ExoI 去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP 去除反應(yīng)中剩余的DNTP。37℃ 15 min，80℃ 15min，純化好后進(jìn)行延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物。延伸反應(yīng)條件為96℃預(yù)變性1 min；96℃變性10 s，52℃退火5 s，60℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；后取1 μL延伸產(chǎn)物，加9 μL 上樣HIDI，95℃變性3 min，立即冰水浴，上測(cè)序儀。7 μL PCR 酶切反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物3 μL，20 U/μL ExoI 0.2 μL，1 U/μL FastAP 0.8 μL，ExoI Buffer 0.7 μL，H2O 補(bǔ)至7 μL。6 μL 延伸反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn) 物2 μL，Snapshot Mix 試 劑1 μL，延 伸 引 物（10 μmol）0.1 μL，水補(bǔ)至6 μL。

1.2.6 飼料利用相關(guān)性狀測(cè)定 利用奧斯本自動(dòng)飼喂系統(tǒng)獲得北京中育種豬有限責(zé)任公司166 頭大白公豬采食量和增重及飼料利用信息。初測(cè)體重范圍為29.3～35 kg，初測(cè)時(shí)間在2016 年4 月26 日—2017 年2 月4 日，結(jié)測(cè)平均體重為96.98 kg，平均測(cè)定飼養(yǎng)天數(shù)為68 d，共計(jì)4 個(gè)批次。計(jì)算ADFI、FCR、RFI 和ADG（表2）。

其中，RFI 為實(shí)際采食量與預(yù)測(cè)采食量之差[12]。預(yù)測(cè)采食量通過(guò)多元線性回歸的方法得到：在飼養(yǎng)期間準(zhǔn)確記錄每只豬的干物質(zhì)采食量（DMI）和ADG，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后利用得到的DMI、試驗(yàn)期中間階段的代謝體重和ADG 結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算出豬的預(yù)期采食量。根據(jù)預(yù)期采食量模型，若模型方程的截距顯著，則可根據(jù)此模型計(jì)算出預(yù)期采食量[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

1.3.1 基因頻率（Gene Frequency）和基因型頻率（Genotype Frequency）根據(jù)基因型判定結(jié)果，計(jì)算第i 個(gè)基因頻率：

其中，Di為第i 個(gè)基因的純合子頻率，Hij為第i 個(gè)基因與第j 個(gè)基因組成的雜合子頻率。

檢驗(yàn)位點(diǎn)是否處于Hardy-Weinberg 平衡，采用卡方適合性檢驗(yàn)：

其中，Oi是第i 種基因型的實(shí)際觀察數(shù)，Ei為第i 種基因型的理論頻數(shù)。

表1 PLA2G4A 基因擴(kuò)增的引物序列

1.3.2 關(guān)聯(lián)分析 使用Rstudio 程序?qū)LA2G4A基因外顯子和內(nèi)含子的多態(tài)性與豬的飼料報(bào)酬性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。模型：表型=批次+基因型+殘差。

由于166 頭豬都在北京中育種豬有限責(zé)任公司采用奧斯本自動(dòng)飼喂系統(tǒng)測(cè)定，其他因素幾乎一致，在分析中不再考慮。

2 結(jié)果與分析

2.1PLA2G4A基因多態(tài)性檢測(cè) DNA 樣本進(jìn)行混池測(cè)序后用DNAMAN 軟件對(duì)經(jīng)PCR 擴(kuò)增的PLA2G4A基因各段擴(kuò)增序列進(jìn)行比對(duì)分析尋找SNP 位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)本研究中24 對(duì)引物的擴(kuò)增片段進(jìn)行逐個(gè)分析，共發(fā)現(xiàn)9 個(gè)SNP 位點(diǎn)，依次記為SNP1、SNP2、SNP3SNP4、SNP5、SNP6、SNP7、SNP8、SNP9（表3）。

基因型頻率和基因頻率及Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。在SNP1 位點(diǎn)檢測(cè)到CC、CT、TT 3 種基因型，且CC 型為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP2 位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AC、CC 3 種基因型，AC 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP3 位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AT、TT 3 種基因型，AT 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP4 位點(diǎn)檢測(cè)到GG、GT、TT 3 種基因型，GG 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP5 位點(diǎn)檢測(cè)到CC、TC、TT 3 種基因型，且CC 為優(yōu)勢(shì)基因型；SNP6 位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AG、GG 3 種基因型，且GG 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP7 位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AG、GG 3 種基因型，且AG 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP8 位點(diǎn)檢測(cè)到CC、TC、TT 3 種基因型，且TC 為優(yōu)勢(shì)基因型；在SNP9 位點(diǎn)檢測(cè)到AA、AC、CC 3 種基因型，且AA 為優(yōu)勢(shì)基因型。SNP1～9 多態(tài)位點(diǎn)分別以C、C、A、G、C、G、A、C、A 為優(yōu)勢(shì)基因。哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)表明，SNP 1、4、5、6、8、9 嚴(yán)重偏離哈代溫伯格平衡，表明該群體可能受到了選擇等影響。

2.2 豬PLA2G4A基因多態(tài)性與飼料報(bào)酬性狀的關(guān)聯(lián)分析如表5 所示，SNP3 對(duì)ADG 有極顯著影響（P=0.000 3），而其他SNP 對(duì)這4 種性狀均沒(méi)有顯著影響。

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，豬PLA2G4A基因與ADG 顯著相關(guān)，與飼料報(bào)酬的性狀關(guān)聯(lián)不密切。這與Qiu 等[8]在研究黃姑魚(yú)的遺傳連鎖圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)PLA2G4A是生長(zhǎng)相關(guān)QTL 區(qū)域的重要生長(zhǎng)基因相一致。與Harris 等[9]在對(duì)獼猴抗肥胖的研究中發(fā)現(xiàn)，磷脂酶A2（PLA2G4A）與體重的持續(xù)穩(wěn)定和胰島素敏感性顯著相關(guān)等研究結(jié)果一致，說(shuō)明PLA2G4A基因在生長(zhǎng)增重方面的作用。

不同物種的PLA2G4A基因結(jié)構(gòu)和位置并不相同。豬PLA2G4A基因[14]定位在第9 號(hào)染色體上，由29個(gè)外顯子28 個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，長(zhǎng)約311 kb，共轉(zhuǎn)錄9 條mRNA，轉(zhuǎn)錄區(qū)域的相對(duì)位置為1～108、410～493、1249～1430、1858～2001、3337～3480、3600～3716、5115～5286。而人PLA2G4A基因[15]位于1 號(hào)染色體，長(zhǎng)度約160 kb，包含19 個(gè)外顯子和18 個(gè)內(nèi)含子，編碼689 個(gè)氨基酸，在腎上腺和膀胱中表達(dá)較多，在肝臟中表達(dá)較少，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)1 298 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)。從信號(hào)通路來(lái)看，PLA2G4A基因產(chǎn)物在磷脂代謝通路Phospholipid→Arachidonic acid→PGH2的第一步起磷脂酶的作用，該通路第二步由PTGS2/COX-2基因產(chǎn)物催化，COX-2 產(chǎn)物可作為評(píng)價(jià)機(jī)體能量代謝的重要指標(biāo)，可反映棕色脂肪組織的功能狀態(tài)，與降低體脂率也有密切關(guān)系[16]。COX-2基因在能量代謝方面的重要作用在一定程度上也可以證明PLA2G4A可能與ADG性狀相關(guān)。

表2 166 頭大白豬測(cè)定期間飼料報(bào)酬性狀描述

表3 豬PLA2G4A 基因中的SNP 位點(diǎn)

本研究結(jié)果顯示，與ADG 極顯著相關(guān)的SNP 位于內(nèi)含子16，可為近些年來(lái)對(duì)內(nèi)含子功能的研究提供材料。從位置上可以看到，該內(nèi)含子16 的SNP 位點(diǎn)與外顯子16 距離很近，該SNP 突變可能因?yàn)橛绊懥宿D(zhuǎn)錄后的剪切而發(fā)揮作用；這與目前一些疾病突變集中在內(nèi)含子與外顯子的交界致使外顯子缺失或內(nèi)含子未被剪切而引發(fā)突變，最終導(dǎo)致疾病的研究結(jié)果相似[17]，需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

除了與增重有關(guān)，PLA2G4A基因在疾病方面的研究也比較充分。Brooke 等[18]在研究人狹窄性腸炎潰爛的遺傳因素時(shí)，發(fā)現(xiàn)與PLA2G4A純合子4 bp（g.155574_77delGTAA）的缺失相關(guān)。張志瑁等[19]研究發(fā)現(xiàn)，PLA2G4A基因AA 基因型可能是印度人精神分裂癥發(fā)病的危險(xiǎn)因素；Wei 等[20]報(bào)道，在英國(guó)人中PLA2G4A基因與精神分裂癥相關(guān)聯(lián)。Gosenca 等[21]認(rèn)為，HERV-Ec1 的轉(zhuǎn)錄會(huì)有效促進(jìn)cPLA2 表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。Mcgowen 等[22]發(fā)現(xiàn)，鼠中PLA2G4A的單獨(dú)缺失與妊娠后期的并發(fā)癥顯著相關(guān)。這些研究結(jié)果說(shuō)明PLA2G4A基因功能比較復(fù)雜，值得深入研究。

綜上，本文的研究結(jié)果可為PLA2G4A 在飼料報(bào)酬方面的作用以及內(nèi)含子功能的研究提供依據(jù)，但本實(shí)驗(yàn)也存在樣本數(shù)量較小、結(jié)果受批次影響較大的問(wèn)題，導(dǎo)致PLA2G4A 與FCR、RFI 等性狀不存在顯著關(guān)聯(lián)。后續(xù)研究將擴(kuò)大測(cè)定數(shù)量，并采集疾病數(shù)據(jù)，綜合生長(zhǎng)、飼料報(bào)酬和疾病，進(jìn)一步研究PLA2G4A 的代謝過(guò)程和分子機(jī)理，為養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)和人畜疾病治療做出貢獻(xiàn)。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，豬PLA2G4A基因位于內(nèi)含子16，具體位置為豬9 號(hào)染色體128126157 的SNP 位點(diǎn)與豬的ADG 有極顯著相關(guān)，而其他8 個(gè)SNP 位點(diǎn)與這4 種飼料報(bào)酬性狀均無(wú)顯著相關(guān)。

表4 PLA2G4A 基因SNP 突變位點(diǎn)的哈代溫伯格平衡檢驗(yàn)

表5 豬PLA2G4A 基因多態(tài)性與飼料性狀的關(guān)聯(lián)分析