從內(nèi)皮化進(jìn)程評(píng)價(jià)LAMaxTM 左心耳封堵器的有效性

吳曉霞，馬東星，孟越之，黃偉，陳奕龍，沈葉佳

心房顫動(dòng)（房顫）是臨床常見的心律失常，其主要危害之一是動(dòng)脈系統(tǒng)的血栓栓塞。90%非瓣膜性房顫患者的血栓來源于左心耳（LAA）。經(jīng)皮左心耳封堵術(shù)可作為卒中高危和有長(zhǎng)期口服抗凝治療禁忌證患者的治療選擇，被寫入了歐洲心臟病學(xué)會(huì)（ESC）房顫治療指南。針對(duì)經(jīng)皮左心耳封堵器械WATCHMAN（波士頓科學(xué)，美國）的循征醫(yī)學(xué)試驗(yàn)PROTECT AF、PREVAIL、ASAP、EWOLUTION 研究等證實(shí)了WATCHMAN 的臨床上的安全性及有效性[1-4]。

本研究應(yīng)用國產(chǎn)新型LAMaxTM左心耳封堵器對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行左心耳封堵術(shù)，并對(duì)術(shù)后1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的犬進(jìn)行解剖觀察，旨在觀察術(shù)后不同時(shí)間封堵器表面心內(nèi)膜覆蓋情況，評(píng)估封堵盤心房側(cè)內(nèi)皮化進(jìn)程，從解剖學(xué)角度評(píng)價(jià)左心耳封堵的有效性。

1 材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：2015 年8 月至2017 年1 月，健康犬30 只，雌性7 只，雄性23 只，體重24.5～36.0 kg，平均（27.8±3.7）kg，由北京市平谷區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)北京平谷模擬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，心電圖示30 只犬均為竇性心律。

左心耳封堵術(shù)：實(shí)驗(yàn)犬于術(shù)前12 h開始禁食，術(shù)前30 min 以鹽酸賽拉嗪注射液0.1 mg/kg 肌肉注射麻醉后仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，剃凈雙側(cè)腹股溝區(qū)及四肢體毛，行心電監(jiān)護(hù)、氣管插管并連接呼吸機(jī)機(jī)械通氣，于左后肢建立靜脈通道，以丙泊酚注射液靜脈滴注維持麻醉。經(jīng)右側(cè)股靜脈途徑行房間隔穿刺（圣猶達(dá)醫(yī)療，美國），送入豬尾導(dǎo)管（泰爾茂，日本）行左心耳造影，測(cè)量左心耳開口直徑、深度及LAMaxTM左心耳封堵器（深圳市科奕頓生物醫(yī)療科技有限公司，中國）工作軸線，選擇LAMaxTM型號(hào)及類型，將封堵器固定于推送桿頭端，由左心耳封堵器輸送鞘管（深圳市科奕頓生物醫(yī)療科技有限公司，中國）將封堵器調(diào)整至目標(biāo)葉內(nèi)，依次打開錨定盤及封堵盤，行牽拉試驗(yàn)確定是否固定牢固，行左心耳造影及經(jīng)食管超聲心動(dòng)圖（TEE），如符合“COVER”原則，釋放封堵器[5]。

TEE 檢查：超聲診斷儀：GE 公司Vivid E9 X Dclear 彩色多普勒超聲診斷儀，6VT 經(jīng)食管探頭，頻率為2～7 MHz。通過撐口器將探頭置入食管內(nèi)50～60 cm，分別從0°、45°～60°、80°～90°、120°～135°等不同角度顯示左心耳形態(tài)、分葉。測(cè)量左心耳開口最大徑、深度以及二尖瓣環(huán)至左上肺靜脈開口距離（MA-PV）等參數(shù)[6-7]，彩色多普勒顯像顯示肺靜脈及二尖瓣過瓣血流；術(shù)后觀察封堵器形態(tài)、位置及與周邊組織關(guān)系，圖像采集為3～5 個(gè)心動(dòng)周期圖像。

術(shù)后隨訪及解剖：按照隨機(jī)分組：即刻組7 只、1 個(gè)月組6 只、2 個(gè)月組5 只、3 個(gè)月組7 只、6 個(gè)月組5 只，按照時(shí)間表進(jìn)行TEE 復(fù)查，按照分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)犬過量麻醉劑處死。處死后，行大體解剖檢查。剖開胸腔，分離心臟周邊組織及血管，完整取出心臟，觀察心包腔內(nèi)是否有積液，并進(jìn)行肺臟、肝臟、脾臟等其他臟器的大體解剖標(biāo)本觀察。從右心房壁剪開心臟標(biāo)本，觀察房間隔穿刺點(diǎn)位置，隨后剪開房間隔進(jìn)入左心房，觀察封堵傘位置、形態(tài)、封堵盤表面情況、封堵盤與周圍組織關(guān)系等；再從左心耳頂部剪開左心耳壁觀察錨定盤固定情況。切除包含完整封堵器的左心耳組織，用10%甲醛溶液固定，包埋（光聚樹脂），以備切片。切片（EXAKT300CP 硬組織切片機(jī)、金剛石切割帶）、磨片（EXAKT400CS 硬組織磨片機(jī)），切片厚度為100～120 μM，HE 染色后光學(xué)顯微鏡下觀察封堵盤表面內(nèi)皮化及其它情況。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布方差齊者兩兩比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，方差不齊兩個(gè)獨(dú)立樣本間采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TEE 測(cè)量左心耳相關(guān)數(shù)據(jù)

30 只犬TEE 測(cè)量左心耳開口為（16.6±2.8）mm，深度為（24.0±4.1）mm，二尖瓣環(huán)至左上肺靜脈開口距離為（25.9±2.9）mm。封堵盤實(shí)際型號(hào)直徑（25.7±2.4）mm，術(shù)后TEE 測(cè)量封堵盤直徑（23.7±2.6）mm，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 左心耳封堵術(shù)后TEE 復(fù)查

術(shù)后即刻TEE 檢查：二維圖像顯示30 只犬的封堵器形態(tài)良好，5 只發(fā)現(xiàn)殘余分流（1 只分流束寬度約5 mm，其余4 只均＜3 mm）；3 只發(fā)現(xiàn)少量心包積液（1 只為即刻組，復(fù)查后處死）；4 只封堵盤對(duì)二尖瓣環(huán)有壓迫，其中1 只壓迫二尖瓣環(huán)的同時(shí)亦遮擋左上肺靜脈開口。

術(shù)后1 個(gè)月時(shí)，復(fù)查1 個(gè)月組、2 個(gè)月組、3個(gè)月組、6 個(gè)月組共23 只，TEE 顯示封堵器均覆蓋于左心耳開口，表面均未見血栓，4 只犬封堵盤壓迫二尖瓣環(huán)，其中2 只復(fù)查TEE 可見封堵盤對(duì)二尖瓣環(huán)的壓迫減輕，未對(duì)二尖瓣后葉運(yùn)動(dòng)造成影響。2只術(shù)后即刻發(fā)現(xiàn)心包積液的犬在1 個(gè)月復(fù)查時(shí)心包積液消失。

彩色多普勒血流顯像（CDFI）顯示殘余分流的5只犬中，1 只為1 個(gè)月組，1 只為2 個(gè)月組，3 只為3 個(gè)月組。1 個(gè)月TEE 復(fù)查時(shí)，1 個(gè)月組和2 個(gè)月組的2 只殘余分流消失，3 個(gè)月組3 只均仍可見殘余分流。2 個(gè)月復(fù)查時(shí)3 個(gè)月組中的1 只殘余分流消失，另2 只在3 個(gè)月復(fù)查時(shí)仍可見殘余分流。

2.3 解剖標(biāo)本觀察

對(duì)實(shí)驗(yàn)犬大體解剖標(biāo)本觀察，未見肝、脾、腎等主要器官的梗死病灶。

2.3.1 封堵盤形態(tài)對(duì)愈合反應(yīng)的影響

封堵盤完全拉入左心耳開口呈新月型者，其愈合反應(yīng)較快，在1 個(gè)月時(shí)心內(nèi)膜即可完全覆蓋封堵盤心房面，有的甚至完全覆蓋中央螺栓；但心內(nèi)膜是否中央螺栓完全覆蓋因個(gè)體差異而變化較大、反應(yīng)不一，有至3 個(gè)月還尚未完全覆蓋。

封堵盤未完全拉入左心耳開口的封堵盤表面愈合反應(yīng)差異顯著：1 個(gè)月組1 只封堵盤心房面被覆厚實(shí)新生內(nèi)皮，但接近二尖瓣環(huán)約60°區(qū)域尚未完全被新生組織覆蓋（圖1）；3 個(gè)月復(fù)查時(shí)仍有殘余分流的犬解剖可見封堵盤心房面已完全內(nèi)皮化，左上180°與周圍心房壁已經(jīng)緊密結(jié)合，右下180°左右范圍未與心房壁融合，掀起可見未完全封堵，仍有一縫隙與左心房交通（圖2）。

圖1 1 個(gè)月組犬解剖圖，封堵盤心房面已完全內(nèi)皮化,但接近二尖瓣環(huán)約60°區(qū)域尚未完全被新生組織覆蓋

圖2 CDFI 示術(shù)后3 個(gè)月仍可見殘余分流的1 只犬解剖結(jié)果

2.3.2 殘余分流者愈合反應(yīng)

TEE 示小葉未封堵并有殘余分流的3 個(gè)月組中的2 只犬，解剖可見1 只犬封堵盤一側(cè)邊緣陷入左心耳開口者，未及肺靜脈開口及二尖瓣環(huán)，封堵盤表面內(nèi)皮化完全，無血栓附著。另1 只封堵盤表面覆蓋組織、光滑,表面內(nèi)皮化完整，但封堵盤邊緣陷入左心耳處可見一細(xì)小縫隙，可以通過18 號(hào)針頭。

2.3.3 錨定盤的愈合反應(yīng)

2 只TEE 顯示封堵盤懸空于左心房?jī)?nèi)，未與左心耳開口完全貼合者，錨定盤封堵于左心耳頸部。錨定盤亦可通過新生組織與心房結(jié)合緊密，1 個(gè)月時(shí)封堵盤表面有較薄內(nèi)皮覆蓋，中央螺栓裸露。3個(gè)月時(shí)錨定盤位于左心耳開口完全內(nèi)皮化，封堵盤表面亦完全內(nèi)皮化，兩者中部的連接桿上亦完全附著新生組織。

2.3.4 經(jīng)皮左心耳封堵術(shù)后6 個(gè)月愈合反應(yīng)

6 個(gè)月組5 只犬封堵盤表面已完全內(nèi)皮化，其中2 只（21#，8#）封堵盤未拉入左心耳內(nèi)者封堵盤表面及背面均已內(nèi)皮化；8#封堵盤邊緣壓迫二尖瓣環(huán)及部分遮擋肺靜脈開口者，封堵盤表面內(nèi)皮化并與肺靜脈開口及二尖瓣環(huán)摩擦處形成類似新生肉芽組織；21#封堵盤下緣超過二尖瓣環(huán)約3 mm，與二尖瓣環(huán)磨擦部位見類似新生肉芽組織。

2.3.5 錨定盤固定情況

30 只犬的LAMaxTM錨定盤均固定于左心耳內(nèi)壁，未見穿出，即刻組可見錨定盤固定區(qū)局部有水腫，1 個(gè)月以上各組左心耳壁組織水腫消失。錨定盤與封堵盤之間連接桿固定良好，未見斷裂分離。因錨定區(qū)與封堵盤間距離較短，解剖可見完全封堵后錨定盤后部的左心耳腔因無血流進(jìn)，左心耳前后壁的完全黏連完全封閉左心耳腔，但有殘余分流者左心耳前后壁不能完全黏連。

2.3.6 組織切片觀察

在1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月的LAMaxTM封堵盤左心房側(cè)的病理切片中可見封堵盤心房側(cè)均可見新生內(nèi)膜覆蓋，新生內(nèi)膜從封堵盤延續(xù)至左心房表面，并與之黏連，顯示其愈合反應(yīng)良好，如大體標(biāo)本所見一致。錨定盤固定位置未見組織壞死（圖3）。

圖3 組織切片(沿著左心耳和封堵器中心矢狀切面)可見封堵盤心房側(cè)均可見新生內(nèi)膜覆蓋,錨定盤固定位置未見組織壞死

3 討論

隨著經(jīng)皮左心耳封堵術(shù)在臨床的逐步開展，針對(duì)左心耳的不同形態(tài)也涌現(xiàn)出不同設(shè)計(jì)的左心耳閉合器械。形似“瓶塞式”設(shè)計(jì)的WATCHMAN 以及AMPLATZER ACP（圣猶達(dá)醫(yī)療，美國）、LAmbre（先健科技，中國）類似“瓶蓋式”左心耳封堵器。本研究采用“瓶蓋式”設(shè)計(jì)的LAMaxTM封堵器，為雙盤狀結(jié)構(gòu)，由封堵盤、錨定盤及一腰部連接桿組成，封堵盤與錨定盤之間距離為10 mm。封堵盤由鎳鈦絲編織盤及被覆其上的阻流膜組成，該阻流膜心房面經(jīng)過嫁接負(fù)電荷，使得表面負(fù)離子化，降低封堵盤心房面表面的血小板黏附，同時(shí)提升阻流膜的親水性和生物相容性，降低器械相關(guān)性血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。錨定盤包括阻流膜及九根交錯(cuò)排布的固定倒鉤，形成盤狀結(jié)構(gòu)[5]。

繼Reddy 等[2]研究得出WATCHMAN 裝置封閉左心耳不劣于長(zhǎng)期華法林治療后，Holmes 等[3]研究中證實(shí)了早期的安全事件2.2%，顯著低于PROTECT AF，如需要心包穿刺引流的心包積液發(fā)生率從PROTECT AF 研究的2.9% 降至1.5%。PROTECT AF、PREVAIL 研究要求術(shù)后服用華法林和阿司匹林45 天，隨后停用華法林，改為氯吡格雷+阿司匹林雙聯(lián)抗血小板治療至術(shù)后6 個(gè)月。2017 年發(fā)表的Boersma 等[4]研究1 年的結(jié)果顯示：WATCHMAN 封堵器置入成功率提高，達(dá)98.5%；1年WATCHMAN 組缺血性卒中發(fā)生率為1.1%，大出血發(fā)生率2.6%，證實(shí)了其臨床上的有效性和安全性。EWOLUTION 研究中術(shù)后服用新型口服抗凝藥或維生素K 拮抗劑的比例為27%，應(yīng)用雙聯(lián)抗血小板治療者達(dá)60%，未用抗凝藥的患者占6%。

器械相關(guān)性血栓多見于封堵器置入后最初的幾周，封堵盤表面未完全內(nèi)皮化，其診斷依賴于TEE影像[8]。同時(shí)，器械相關(guān)性血栓亦可由繼發(fā)性原因（未完全封堵、左心耳殘余分流等）及患者的全身系統(tǒng)性原因引起。一項(xiàng)納入2008～2015 年30 項(xiàng)研究的薈萃分析顯示：2 118 例左心耳封堵術(shù)中出現(xiàn)82 例發(fā)生器械相關(guān)性血栓，發(fā)生率約3.9%，WATCHMAN 約3.4%，AMPLATZER ACP/Amulet 約4.6%[9]。

為了提供關(guān)于封堵器與組織接觸面愈合情況的組織病理學(xué)證據(jù)，Schwartz 等[10]應(yīng)用9 條犬，分別觀察了術(shù)后3 天、45 天、90 天WATCHMAN 表面內(nèi)皮化進(jìn)程，證實(shí)術(shù)后45 天即可見心內(nèi)膜完全覆蓋了封堵器心房面并延續(xù)至左心房表面，對(duì)封堵器心房面進(jìn)行了有效隔離，早期的纖維素沉積被心內(nèi)膜取代，心內(nèi)膜組織包括包裹在封堵盤的金屬及編織物中的蛋白聚糖-膠原基質(zhì)及平滑肌細(xì)胞。通過與人類標(biāo)本對(duì)比指出：動(dòng)物與人類的愈合反應(yīng)相似，但動(dòng)物的反應(yīng)較快一些。Tang 等[11]觀察了6 只實(shí)驗(yàn)犬置入LACBES?occluders 后封堵盤表面內(nèi)皮化情況，用電鏡掃描觀察到左心耳封堵術(shù)術(shù)后80 天及110 天內(nèi)皮細(xì)胞及基質(zhì)的附著。

本研究應(yīng)用LAMaxTM進(jìn)行左心耳封堵術(shù)，通過對(duì)左心耳封堵術(shù)后不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的大體標(biāo)本及病理組織切片的觀察，觀察了封堵器的形態(tài)、位置、塑形及對(duì)周邊組織的影響等，通過解剖證實(shí)封堵器置入良好，與周圍組織相容性較好，未見磨損二尖瓣環(huán)、肺靜脈壁及左心耳壁等情況發(fā)生，封堵盤表面新生組織完整，隨著置入時(shí)間的增加可以完全阻隔左心耳與左心房之間的血流交通，提示LAMaxTM的有效性。至術(shù)后6 個(gè)月TEE 復(fù)查未見器械相關(guān)性血栓發(fā)生，術(shù)后隨訪觀察及解剖均未見相關(guān)栓塞證據(jù)，提示LAMaxTM的安全性。

通過對(duì)左心耳封堵術(shù)后隨訪、解剖觀察可見本研究組提出的COVER 原則[5]對(duì)于此類“瓶蓋式”封堵器的重要意義，特別是“C”：Concavity 即封堵器是否拉入左心耳開口并呈新月型，將直接影響到封堵盤表面內(nèi)皮化的進(jìn)程，封堵盤按照COVER 原則完全封堵盤拉入左心耳開口呈新月型者，其愈合反應(yīng)較快，在1 個(gè)月時(shí)即可以完全覆蓋封堵盤表面，甚至完全覆蓋中央螺栓，內(nèi)皮化較快且完整；但封堵盤未完全拉入左心耳開口的封堵盤表面愈合反應(yīng)差異較大，并與封堵盤的形態(tài)、是否陷入左心耳開口相關(guān)，本研究中觀察到愈合反應(yīng)可以通過封堵盤與其接觸的位置反復(fù)摩擦形成肉芽組織完成其愈合過程；而封堵盤懸于左心房未覆蓋開口者，隨著時(shí)間的推移，錨定盤位于左心耳開口完全內(nèi)皮化，封堵盤表面及中部的連接桿上亦完全附著新生組織，從而阻斷左心房與左心耳之間的血流交通。因此，本研究提示經(jīng)皮左心耳封堵術(shù)操作的術(shù)者盡力將“瓶蓋式”封堵器的封堵盤拉入左心耳開口以縮短封堵盤表面內(nèi)皮化時(shí)間，必要時(shí)可以更換封堵器置入的小葉或封堵器型號(hào)，力求完美，進(jìn)而加速封堵盤表面內(nèi)皮化進(jìn)程。由此提示：封堵盤是否完全拉入左心耳開口將影響封堵盤左心房側(cè)的內(nèi)皮化進(jìn)程，進(jìn)而影響臨床患者抗凝治療的時(shí)間。

左心耳一般為狹長(zhǎng)、彎曲的管狀盲腔，分成開口、頸部和分葉3 個(gè)部，分葉部即為基底部，其腔內(nèi)有豐富的梳狀肌。LAMaxTM的封堵盤與錨定盤之間距離為10 mm，封堵盤固定在左心耳開口部，錨定盤通常固定于左心耳的頸部，從解剖標(biāo)本觀察錨定盤后部的左心耳分葉部因完全封堵無血流進(jìn)入，左心耳前后壁可以完全黏連，進(jìn)而達(dá)到了完全封閉左心耳腔的效果，但有殘余分流者左心耳前后壁不能完全黏連，未完全阻隔左心房與左心耳之間的血流交通。而WATCHMAN 的直徑與長(zhǎng)度呈正比，且其尾部撐開左心耳前后壁，無法完全閉塞左心耳腔，其封堵效果依靠封堵器表面的內(nèi)皮化達(dá)到，這也是這兩類不同類型封堵器的區(qū)別。

本研究應(yīng)用“瓶蓋式”設(shè)計(jì)的LAMaxTM左心耳封堵器對(duì)實(shí)驗(yàn)犬進(jìn)行左心耳封堵術(shù)，并對(duì)術(shù)后1 個(gè)月、2 個(gè)月、3 個(gè)月、6 個(gè)月的犬進(jìn)行解剖標(biāo)本觀察，顯示符合COVER 原則，即封堵盤完全拉入左心耳開口者術(shù)后1 個(gè)月新生內(nèi)膜可完全覆蓋封堵盤表面，而有殘余分流者即使彩色多普勒血流分流束寬度＜5 mm，至3 個(gè)月封堵盤邊緣仍可見一細(xì)小縫隙與左心房相通。術(shù)后6 個(gè)月時(shí)封堵盤表面已完全內(nèi)皮化，被厚實(shí)的新生組織所覆蓋，包括中心螺母的部位，即使封堵盤未拉入左心耳內(nèi)者封堵盤表面及背面均已內(nèi)皮化達(dá)到完全封堵左心耳的效果。從解剖學(xué)角度證實(shí)了LAMaxTM左心耳封堵器進(jìn)行左心耳封堵術(shù)的有效性。

本研究應(yīng)用的是正常竇性心律的實(shí)驗(yàn)犬，非房顫模型，故無心功能不全及左心房明顯擴(kuò)大的房顫心律實(shí)驗(yàn)犬，是本研究結(jié)論的局限性。