鋅離子在缺血預(yù)處理保護機制中的作用

溫凌娜，田增有，張春來，周洪霞，習(xí)瑾昆

隨著溶栓療法、冠狀動脈支架置入術(shù)等在心肌梗死治療上的廣泛應(yīng)用，缺血再灌注（I/R）損傷越來越受到關(guān)注。1986 年，Murry 等[1]首次提出缺血預(yù)處理（IPC），發(fā)現(xiàn)IPC 可保護心肌免受I/R 損傷。Stokfisz 等[2]闡明了IPC 可能通過一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶為中心的途徑、再灌注損傷補救激酶（RISK）途徑和生存活化因子增強（SAFE）途徑等保護心肌。近期研究表明，IPC 可減少心肌I/R 誘導(dǎo)的細胞凋亡[3]。

鋅離子是細胞正常結(jié)構(gòu)和功能的基礎(chǔ)[4]，其失調(diào)與許多心血管疾病的發(fā)病機制有關(guān)[5]。鋅離子可通過調(diào)節(jié)幾種重要蛋白激酶的活性在細胞信號傳導(dǎo)中起重要作用，如通過激活RISK 信號通路發(fā)揮心臟保護作用[6]。近期研究發(fā)現(xiàn)，瑞芬太尼通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起到心臟保護作用，而鋅離子可能參與了這一過程[7]。Wang 等[8]研究表明鋅離子可通過調(diào)節(jié)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）的開放參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），使心肌免受I/R 損傷。據(jù)報道，再灌注時細胞鋅離子濃度會降低[6]。本研究探索IPC 是否能通過防止再灌注時的鋅離子損失來保護心臟。

1 材料與方法

實驗動物及分組：50 只健康雄性Wistar 大鼠，每只重250～350 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，實驗動物使用許可證號：SCXK（京）2014-0004。大鼠被隨機分為五組：假手術(shù)組（對照組）、I/R 組、I/R+IPC 組、I/R+IPC+鋅離子抑制劑（TPEN）組、I/R+TPEN 組，每組10 只。

主要材料與試劑：鋅離子檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；抗核因子E2 相關(guān)因子2（Nrf2）抗體、抗磷酸化蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（p-PERK）抗體，均購自英國abcam 公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔免疫球蛋白G 抗體（Cell Signaling Technology 公司，美國）；末端脫氧核苷基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 原位末端標記（TUNEL）凋亡檢測試劑盒（羅氏公司，美國）；TPEN（Sigma 公司，美國）。

儀器：Langendorff 體外心臟灌流系統(tǒng)、數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（成都儀器廠）；電泳及濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)（北京六一儀器廠）；Multiskan FC 型酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司]、Tanon-5200 生物圖像采集系統(tǒng)（Tanon 公司，中國）；BX53 熒光正置顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

離體大鼠心臟I/R 模型的建立：Lengandorff 系統(tǒng)建立大鼠心肌I/R 模型。配置Krebs-Henseleit（K-H）緩沖液（pH=7.4）加到灌流裝置內(nèi)，在37℃下，95%氧氣、5%二氧化碳充氣30 min。將大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸取出心臟，立即放入盛有4℃生理鹽水的平皿內(nèi)，沖掉殘留血液，迅速懸掛于Langendorff 灌流裝置上，行主動脈逆行灌流。在左前降支周圍放置5-0 絲線縫合線，并將縫合線的末端穿過一小片柔軟的乙烯管以形成圈套。通過拉動圈套，用小止血鉗夾緊管道來固定，以誘導(dǎo)缺血。再灌注時，松開小止血鉗。對照組只懸線不結(jié)扎血管。I/R+IPC 組在缺血30 min 前給予3 輪5 min 缺血/5 min 再灌注。TPEN（10 μmol）在IPC 或缺血30 min的前5 min 給予。所有心臟穩(wěn)定至少20 min。

鋅離子水平測定[9-10]：提取心肌組織蛋白，按照鋅離子檢測試劑盒說明書操作，檢測各組鋅離子水平。

心肌梗死面積測定：再灌注達120 min 時，永久性結(jié)扎冠狀動脈，由主動脈逆行注入2%伊文斯蘭以顯示危險區(qū)。取下心臟，放入-80℃冰箱凍存30 min，取出冷凍的心臟，快速切成厚度約1 mm 的心臟組織切片，置于1%三苯基氯化四唑（TTC）磷酸鹽緩沖液中（pH=7.4），37℃恒溫孵育20 min 后取出，浸入10%的福爾馬林溶液10 min，以提高染色和非染色組織的對比度。此時，在危險區(qū)，未被TTC 染色的區(qū)域（白色）被確認為梗死區(qū)域。將心臟組織切片放在兩塊玻璃板中間并壓平，放上橫尺作為標尺，拍照，使用Image-J 軟件量化。通過公式“心肌梗死面積百分比（%）=梗死區(qū)/危險區(qū)×100%”，進行心臟梗死區(qū)面積百分比的測定。

蘇木素-伊紅（HE）染色觀察形態(tài)學(xué)改變：心肌組織在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流動水沖洗24 h。依次過梯度酒精、醇苯混合液、二甲苯，浸蠟，60℃～62℃烤箱中過夜，包埋，切片，60℃烤箱中烘烤30 min，二甲苯脫蠟、梯度酒精及水化，蘇木素染色3 min，水洗。鹽酸酒精分化10 s，用1%氨水藍化1 min，水洗。伊紅染色3 min，依次梯度酒精脫水、二甲苯透明。中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍片。

蛋白免疫印跡實驗檢測Nrf2、p-PERK 表達：提取心肌組織總蛋白，用BCA 試劑盒蛋白定量[11]。以80 μg 蛋白上樣，電泳并轉(zhuǎn)膜。10%脫脂奶粉室溫封閉30～60 min，p-PERK（1：500 一抗稀釋液稀釋）、Nrf2 抗體（1：1 000）4℃孵育過夜雜交。辣根過氧化物酶標記的二抗（1：2 000 0.1%的TBST 稀釋）室溫孵育1 h，用增強化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒熒光顯色。β 肌動蛋白（β-actin）抗體為內(nèi)參。Image J 圖像分析軟件對條帶進行灰度掃描及定量分析。

TUNEL 法檢測細胞凋亡情況[12]：制備心肌組織切片，常規(guī)脫蠟脫水，用蛋白酶K（20 μg/ml 溶于Tris/HCl 中，pH 7.4～8.0）室溫孵育15～30 min，PBS（主要成分：NaCl、Na2HPO4·12H2O、KCl、KH2PO4，濃度10 mmol，pH 7.4）沖洗，滴加50 μl 的TUNEL 反應(yīng)混合溶液，在濕盒中37℃孵育60 min，PBS 沖洗，加入50 μl 轉(zhuǎn)化劑-POD，在濕盒中37℃孵育30 min，PBS 沖洗，加入50～100 μl 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）底物溶液，室溫孵育10 min，PBS 沖洗。蘇木素復(fù)染，封片，顯微鏡觀察并拍片。

實驗步驟：離體心臟灌流，穩(wěn)定20 min，缺血30 min，再灌注120 min。IPC 組在缺血前進行3 輪5 min 缺血/5 min 再灌注。取左心室危險區(qū)組織進行指標檢測。取再灌注30 min 的心肌組織進行鋅離子濃度測定及蛋白免疫印跡實驗檢測。取再灌注120 min 的心肌組織，進行HE 染色及TUNEL 細胞凋亡檢測。再灌注120 min 測量心肌梗死面積百分比。

統(tǒng)計學(xué)方法：采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用表示。顯著性檢驗采用完全隨機設(shè)計的單因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

各組大鼠心肌組織內(nèi)鋅離子水平比較（圖1）：與對照組相比，I/R 組大鼠在心臟再灌注后心肌組織內(nèi)鋅離子水平顯著降低；而與I/R 組相比，I/R+IPC組大鼠心臟再灌注后心肌組織內(nèi)鋅離子水平升高。上述各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖1 各組大鼠心肌鋅離子水平比較（n=5,±s）

各組大鼠心肌梗死面積比較（圖2）：與對照組相比，I/R 組大鼠心肌梗死面積顯著增加；與I/R 組相比，I/R+IPC 組大鼠心肌梗死面積減?。慌cI/R+IPC 組相比，I/R+IPC+TPEN 組大鼠心肌梗死面積又顯著增加。上述各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

各組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)比較（圖3）：對照組大鼠心肌纖維排列整齊，無斷裂，胞質(zhì)和胞核清晰，無炎細胞浸潤。與對照組相比，I/R 組大鼠心肌纖維排列紊亂、斷裂，間隙增寬。與I/R 組相比，I/R+IPC 組大鼠心肌纖維排列相對整齊，間隙相對緊密，斷裂相對較少。與I/R+IPC 組相比，I/R+IPC+TPEN 組大鼠心肌纖維排列紊亂，間隙顯著增寬，斷裂明顯增加。

圖2 各組大鼠心肌梗死面積比較（n=5,±s）

圖3 各組大鼠心肌蘇木素-伊紅染色結(jié)果（×40）

各組大鼠心肌組織中p-PERK、Nrf2 蛋白表達水平比較（圖4）：與對照組相比，I/R 組大鼠心肌組織中p-PERK、Nrf2 兩種蛋白的表達水平均顯著升高；與I/R 組相比，I/R+IPC 組大鼠心肌組織中上述兩種蛋白的表達水平顯著降低；與I/R+IPC 組相比，I/R+IPC+TPEN組大鼠心肌組織中上述兩種蛋白的表達水平明顯升高；上述各組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

各組大鼠心肌細胞凋亡情況比較：I/R 組大鼠心肌凋亡細胞明顯多于對照組；而與I/R 組相比，I/R+IPC 組大鼠心肌凋亡細胞減少；加入TPEN后，心肌凋亡細胞又明顯增多（圖5）。與對照組相比，I/R 組大鼠心肌細胞凋亡指數(shù)（AI）顯著增加[（35.80±5.31）% vs（5.80±2.86）%]；I/R+IPC 組 大鼠心肌細胞AI 顯著低于I/R 組[（16.20±4.82）% vs（35.80±5.31）%]；與I/R+IPC 組相比，I/R+IPC+TPEN組大鼠心肌細胞AI 明顯升高[（32.60±6.03）% vs（16.20±4.82）%]；以上組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織中p-PERK、Nrf2 蛋白表達水平比較（n=5,±s）

圖5 各組大鼠TUNEL 法檢測到的心肌細胞凋亡情況（×40）

3 討論

鋅離子是細胞質(zhì)、囊泡、細胞器以及細胞核中最豐富的細胞內(nèi)金屬離子[13]。鋅離子參與人體細胞代謝過程，可直接調(diào)節(jié)激酶、磷酸酶活性。據(jù)報道，補充鋅離子可降低動脈粥樣硬化的風(fēng)險，并可預(yù)防心肌梗死和I/R 損傷[14]。既往研究發(fā)現(xiàn)，IPC 可能通過激活NO 系統(tǒng)保護心臟[15]；同時，NO 可能在再灌注時通過提高鋅離子水平保護心臟[16]。為探討鋅離子是否參與IPC 的保護機制，本研究對實驗大鼠的心肌組織進行鋅離子水平檢測。結(jié)果顯示，與對照組相比，I/R 組大鼠心肌組織中鋅離子水平顯著降低，表明I/R 導(dǎo)致組織內(nèi)鋅離子流失；與I/R 組相比，IPC 后大鼠心肌組織內(nèi)鋅離子水平明顯增加，說明IPC 可能通過防止鋅離子流失發(fā)揮保護作用。

IPC 是一種內(nèi)源性保護現(xiàn)象[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，IPC 可能通過蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激酶（PERK）途徑減弱ERS 誘導(dǎo)的細胞凋亡，保護大腦免受I/R 損傷[18]。Nrf2 是PERK 的下游底物，PERK 可通過激活Nrf2，增加C/EBP 同源蛋白（CHOP）的表達，進而使抑凋亡因子Bcl2 蛋白表達下調(diào)、促凋亡因子Bax 蛋白表達上調(diào)，引起細胞凋亡[19-20]。在本研究中，與I/R 組相比，I/R+IPC 組大鼠心肌梗死面積比顯著降低，心肌纖維排列相對緊密、斷裂減少，p-PERK、Nrf2 蛋白表達顯著減少，說明IPC 可能通過抑制PERK/Nrf2 通路減輕I/R 損傷、保護心?。患尤隩PEN 后，心肌梗死面積比顯著升高，心肌纖維排列疏松、斷裂較多，p-PERK、Nrf2 蛋白表達顯著增多，凋亡細胞明顯增多；而與I/R 組相比，I/R+TPEN 組上述結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，說明TPEN 抑制IPC 的保護作用，而TPEN 為鋅離子抑制劑，說明鋅離子參與IPC 的這一保護作用。

既往研究表明，如果患者在心肌梗死前先出現(xiàn)心絞痛，可被認為是IPC 的一種形式，此類患者出現(xiàn)急性心肌梗死時，溶栓治療后的心肌梗死面積較梗死前無心絞痛者更小[21]。臨床上通過運動訓(xùn)練誘導(dǎo)心肌缺血預(yù)適應(yīng)可保護心臟。最新研究發(fā)現(xiàn)，來自IPC 的微泡可以通過減弱ERS 誘導(dǎo)的細胞凋亡來保護心臟免受I/R 損傷[22]，為臨床治療目標提供了新的見解。因此，進一步了解IPC 在I/R 損傷中的保護機制，可能為臨床治療提供了新的證據(jù)。

鋅離子代謝的失調(diào)與許多心血管?。–VD）有關(guān)。低鋅血癥和鋅轉(zhuǎn)運蛋白異常與動脈粥樣硬化和微血管疾病有關(guān)。現(xiàn)有證據(jù)支持血管壁中存在鋅離子調(diào)節(jié)途徑，其與NO 的產(chǎn)生和作用相關(guān)，從而對血管疾病的發(fā)病機理和治療產(chǎn)生影響[23]。既往研究發(fā)現(xiàn)，血清鋅離子水平與血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶和心肌肌鈣蛋白T 水平呈顯著負相關(guān)，急性心肌梗死的患病率隨血清鋅離子濃度的增加而降低[24]。鋅離子還可以減輕心肌梗死后大鼠的心臟重構(gòu)[25]。如果在CVD 早期發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)鋅離子穩(wěn)態(tài)的改變，則可能通過盡早干預(yù)鋅離子水平來改善CVD 患者預(yù)后。

總之，IPC 可能通過鋅離子抑制PERK/Nrf2 通路而發(fā)揮心肌保護作用，進一步了解其作用機制有助于臨床預(yù)防和減少心肌I/R 損傷，從而改善患者預(yù)后。