內(nèi)皮素1基因rs5370位點多態(tài)性與中國女子長跑運動員運動表現(xiàn)之間的關(guān)聯(lián)性研究

楊賢罡1， 李燕春 鄧瀟瀟3 胡揚

1 河北省體育科學研究所河北省神經(jīng)肌肉功能與力量訓練實驗室（河北石家莊050011）

2 北京體育大學中國運動與健康研究院（北京100084）

3 重慶第二師范學院教師教育學院（重慶400065）

心血管系統(tǒng)的良好適應(yīng)性是評估優(yōu)秀長跑運動員的首要因素[1]。內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）是人體內(nèi)作用最強的內(nèi)源性血管收縮肽[2]，參與運動中血管、呼吸道平滑肌的增生[3]，參與運動員心臟的重塑[1]和低氧習服過程[4，5]，是評估長跑運動能力適宜的候選基因。

人類內(nèi)皮素-1基因（Endothelin 1，EDN1）位于染色體6p24.1，全長6836bp，包括5個外顯子和4個內(nèi)含子，含有2156個SNP位點。EDN1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA首先翻譯合成前內(nèi)皮素原（preproendothelin-1，ppET-1），隨后ppET-1經(jīng)特異內(nèi)肽酶進行第一次酶切產(chǎn)生內(nèi)皮素原（preendothelin-1，pET-1），pET-1在運動等應(yīng)激情況下經(jīng)內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶進行第二次酶切產(chǎn)生成熟的ET-1[2]。rs5370位點位于第5外顯子的第61個核苷酸，發(fā)生G→T的突變，導致第198個密碼子發(fā)生賴氨酸→天門冬氨酸的轉(zhuǎn)變。該位點的表示方式包括Lys198Asn，G198T，G5665T和K198N 等。rs5370位點的多態(tài)性與高血壓及相關(guān)疾病[6]以及ET-1水平[7，8]相關(guān)聯(lián)。本實驗室前期提出其GT基因型可以作為優(yōu)秀北方漢族長跑運動員選材和北方漢族男性心功能訓練效果的標記[9]。高原訓練是長跑運動員重要的訓練內(nèi)容，rs5370位點多態(tài)性同樣與高原的適應(yīng)能力[7]和HiHiLo訓練的敏感性[9]存在聯(lián)系。

由于前期針對運動員群體rs5370位點的研究僅采用case-control設(shè)計，缺乏與運動能力表型，特別是競技成績的關(guān)聯(lián)性研究，且該位點的分布及對表型的影響存在性別差異[9，10]。因此，本研究選取備戰(zhàn)2012年倫敦奧運會周期內(nèi)的中國女子長跑運動員作為研究對象，分析該位點在我國女子長跑運動員中的分布頻率及特征；通過rs5370位點與肺功能、運動生理機能和競技成績之間的橫向關(guān)聯(lián)性分析，為深入闡述rs5370位點的多態(tài)性與長跑運動能力之間的關(guān)系及將其應(yīng)用于運動員選材工作提供依據(jù)。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

于2009年3月至2010年5月期間選取中國女子專業(yè)長跑運動員共79名，包括1名回族，其余均為漢族，出生地包括以遼寧、山東、河南為主的北方省份（n=64，82.1%）和以貴州、云南、江蘇等為主的南方省份（n=14，17.9%），主項包括5000 米、10000 米和馬拉松，絕大多數(shù)運動員存在兼項情況。該運動員樣本占中國田徑協(xié)會運動員實時注冊數(shù)據(jù)庫的近80%，其中健將級以上運動員達到90% 以上。

運動員基本情況：年齡22.33 ± 2.50歲，身高164.76 ± 5.08 cm，體重52.10 ± 7.20 kg，訓練年限4.99 ± 2.62年，其中國際健將19名，健將13名，一、二級水平47名。所有受試者均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 血樣采集及全基因組DNA提取

使用EDTA.K2 抗凝管收集運動員靜脈血5 ml。用Promaga公司基因組DNA提取試劑盒提取白細胞中的全基因組DNA，分裝于-70攝氏度保存待測。

1.2.2 基因多態(tài)性分析

DNA 樣本經(jīng)稀釋（至5 ng/mL）后進行PCR擴增，擴增后經(jīng)堿性磷酸酶消化處理后，再進行單堿基延伸反應(yīng)，對終止反應(yīng)物進行脫鹽和懸浮后，將最終分型產(chǎn)物點樣到芯片上，并用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF）進行分析。SNP位點分型利用美國Sequenom公司的MassARRAY 系統(tǒng)完成，PCR引物和單堿基延伸引物用Assay Designer軟件包設(shè)計，基因型解析由上海邃志生物科技有限公司完成。隨機選取5名運動員的樣本采用基因測序以驗證MALDITOF 檢測結(jié)果，基因測序由上海生物工程有限公司完成。

rs5370位點的PCR 引物和單堿基延伸引物如下：PCR 引物1：ACGTTGGATGGGTCTGTCACCAATGTGCTC，PCR引物2：ACGTTGGATGCTTTTCATGATCCCAAGCTG。產(chǎn)物長度為100個堿基對，退火溫度為 53.7℃。延伸引物為 GATCCCAAGCTGAAAGGCAA（分子量為6144）。

不同等位基因的PCR 延伸產(chǎn)物及分子量如下：等位基因為G 時延伸產(chǎn)物為GATCCCAAGCTGAAAGGCAAG（分子量6431.2）；等位基因為T時延伸產(chǎn)物為GATCCCAAGCTGAAAGGCAAT（分子量6471.1）。

1.2.3 生理機能測試

采用日本CHESTGRAPH HI-101型肺功能儀測試運動員的肺活量（vital capacity，VC）、用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）、1 秒用力呼氣量（forced expiratory volume，F(xiàn)EV1）、每分通氣量（minute ventilation volume，MVV），并計算FEV1/FVC%。

采用逐級遞增負荷跑臺方案測試無氧閾攝氧量（VO2-AT）、無氧閾速度（V-AT）、最大攝氧量（VO2max）、最大跑速（V-VO2max）和最大通氣量（VE），并計算VO2-AT/ VO2max。測試方案、測試儀器和跑速判斷標準等見文獻[11]，力竭、通氣無氧閾的判斷標準見文獻[12]。

測試時間為2009年3月至2010年5月，期間運動員均處于專項有氧能力儲備階段，無明顯傷病和疲勞情況。

1.2.4 個人最好成績（personal best，PB）

通過國際田聯(lián)和中國田徑協(xié)會官方網(wǎng)站的賽事成績查詢系統(tǒng)檢索運動員3個主項的PB，部分賽事數(shù)據(jù)不全者采用對教練員進行回訪追溯的方式獲取。

進行橫向關(guān)聯(lián)分析所采用的PB 數(shù)據(jù)包括運動員接受生理機能測試時的PB（記做PB1）和截止到2018年11月時的PB（記做PB2）兩部分。PB2獲取時所有運動員均已退役，其中國際健將和國家健將分別達到了25名和21名。

1.2.5 統(tǒng)計學分析

采用χ2檢驗進行哈溫平衡分析，比較不同樣本間基因型、等位基因頻率分布的差異，以及不同基因型攜帶者運動水平分布的差異，并計算OR值及95%CI。不同基因型攜帶者之間生理表型指標的比較先通過斜率同質(zhì)性檢驗排除訓練年限和基因型之間的交互作用，再以訓練年限作為協(xié)變量進行協(xié)方差分析，最后通過LSD法進行事后兩兩比較。不同基因型間個人最好成績的比較通過單因素方差分析進行，并通過LSD 法進行兩兩比較，顯著性水平定為P＜0.05。

2 結(jié)果

2.1 EDN1基因rs5370位點的基因型解析結(jié)果

rs5370位點的檢測成功率100%，隨機選取的運動員樣本經(jīng)基因測序與MALDI-TOF結(jié)果完全吻合。

2.2 中國女子長跑運動員EDN1基因rs5370位點的基因型頻率和等位基因頻率分布

中國女子長跑運動員的rs5370位點中，GG、GT和TT基因型的頻率分別為50.6%、36.7%和12.7%。等位基因G和T頻率分別為69.0%和31.0%。

提取相近人群研究中的樣本來源、例數(shù)、基因型和等位基因頻率等數(shù)據(jù)（表1），需要考慮到不同樣本之間在區(qū)域、種族和性別等方面的異質(zhì)性。在普通健康人群中，樣本9～12 不符合哈溫平衡定律，不具有群體代表性。運動員人群中，樣本1 同樣不符合哈溫平衡定律。

剔除普通健康人群的樣本9～12后，將中國女子長跑運動員與其他人群樣本進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因型頻率分布與普通健康人群樣本1～3（χ2=8.08，P=0.02；χ2=61.10，P=0.00；χ2=21.84，P=0.00），運動員人群樣本1、2 之間均具有顯著性差異（χ2=6.75，P=0.03；χ2=7.44，P=0.02）；等位基因頻率分布與普通健康人群2、3 之間存在顯著性差異（χ2=70.32，P=0.00；χ2=21.69，P=0.00），與運動員人群樣本無顯著差異。

2.3 EDN1基因rs5370位點不同基因型攜帶者之間生理表型指標比較

訓練年限和rs5370位點多態(tài)性對所有肺功能指標的影響均無交互作用。以訓練年限作為協(xié)變量進行協(xié)方差分析，結(jié)果顯示rs5370位點多態(tài)性對肺功能指標均無顯著影響，見表2。

表2 rs5370多態(tài)性位點不同基因型攜帶者之間肺功能指標比較

訓練年限和rs5370位點多態(tài)性對所有運動機能指標的影響均無交互作用。以訓練年限作為協(xié)變量進行協(xié)方差分析，結(jié)果顯示rs5370位點多態(tài)性對VO2max和VO2-AT/VO2max 均存在顯著影響（P=0.002，P=0.040）。事后兩兩比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GT基因型攜帶者的VO2max 顯著高于GG 基因型攜帶者（P=0.000），而對于VO2-AT/VO2max，前者顯著低于后者（P=0.019），詳見表3。

表3 rs5370多態(tài)性位點不同基因型之間生理機能指標比較

2.4 EDN1基因rs5370位點不同基因型攜帶者競技成績和運動等級分布比較

本研究中運動員群體3個單項的PB2較PB1均有顯著提高（5000 米：P=0.017；10000 米：P=0.011；馬拉松：P=0.002），見表4。

rs5370位點多態(tài)性對10000米的PB2存在影響趨勢（P=0.076），兩兩比較發(fā)現(xiàn)GT基因型攜帶者的10000米PB2顯著快于GG基因型攜帶者（P=0.024），見表5。

表4 運動員2010年和2018年各單項PB的比較

表5 rs5370多態(tài)性位點不同基因型攜帶者之間各單項PB2的比較

不同基因型攜帶者的運動水平分布情況見表6。將國家健將和一、二級合并為國家水平，發(fā)現(xiàn)GT基因型攜帶者在國際健將和國家水平上的分布存在顯著差異（χ2=6.19，P=0.013），GT基因型攜帶者成為國際健將的OR值=3.73（95%CI：1.29～10.81）。

表6 rs5370多態(tài)性位點不同基因型攜帶者運動等級分布

3 討論

3.1 選擇EDN1基因rs5370位點作為長跑運動表現(xiàn)候選基因標記的依據(jù)

規(guī)律性運動能夠降低動物心肌中ET-1的mRNA表達[19]，以及人體血漿中的ET-1水平[20，21]，ET-1所介導的血管收縮力下降是有氧運動介導內(nèi)皮依賴性血管擴張功能改善的重要機制[22]。運動減弱冠狀血管的收縮通過減少ET-1的產(chǎn)生所介導[23]，且ET-1能夠反映運動誘發(fā)心肌缺血的嚴重程度[24]。但中長跑運動員ET-1的基礎(chǔ)水平和急性運動后的增加幅度更高[25]，則與耐力訓練引起心血管系統(tǒng)內(nèi)分泌的適應(yīng)性改變有關(guān)。除心血管外，ET-1 同樣促進呼吸道平滑肌的收縮和增生。哮喘患者[26]和青年足球運動員[27]在劇烈運動后，發(fā)生運動性支氣管痙攣者的呼出氣冷凝液和血漿中的ET-1均顯著升高，而對照組不變或下降。運動后血漿ET-1 升高的幅度與VO2max 呈正相關(guān)，提示ET-1 增強心血管的收縮與運動員良好的心肺功能有關(guān)[25]。此外，ET-1還可以用于高原或低氧習服程度的評估。大學生游泳運動員高原訓練中晨起血清ET-1的變化率與高原訓練前后專項成績的變化率呈負相關(guān)，血清ET-1下降提示低氧習服快[4]。但是在北方漢族大學生中，習服者在低氧訓練后再次接受低氧暴露后的ET-1水平和升高程度均高于未習服者[5]。

rs5370位點的T等位基因或TT基因型與更高的血壓基礎(chǔ)水平[28]、面對應(yīng)激時更大的血壓反應(yīng)[29]和更強的血管收縮[30]相關(guān)聯(lián)。rs5370位點的多態(tài)性與心功能、心肺耐力的基礎(chǔ)水平[9]，以及血壓[28]、心功能、心肺耐力[9]的訓練適應(yīng)性相關(guān)聯(lián)，不同研究結(jié)果之間的差異可能與研究對象的群體代表性、訓練背景[9]和種族[28]有關(guān)。

上述研究基礎(chǔ)提示EDN1基因rs5370位點是評估長跑運動能力適宜的候選基因標記。

3.2 EDN1基因rs5370位點多態(tài)性與長跑運動能力的關(guān)聯(lián)性及機制探討

本實驗室前期通過case-control設(shè)計發(fā)現(xiàn)北方漢族優(yōu)秀長跑運動員（健將和國際健將）中，GT基因型的分布頻率顯著高于普通人[9]。由于本研究的運動員樣本包含部分非健將級運動員，整體水平低于前期的運動員樣本。比較這兩份運動員樣本的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因型頻率存在顯著差異，同樣表現(xiàn)為GT型頻率前期樣本高于本研究樣本，分別為0.59和0.37。與此同時，與北方漢族優(yōu)秀男子長跑運動員進行比較，發(fā)現(xiàn)基因型頻率同樣存在差異，這種差異可能涉及性別因素[10]。在北方漢族的普通人和優(yōu)秀長跑運動員中，均表現(xiàn)出TT基因型和T等位基因的頻率女性高于男性[9]。

EDN1基因rs5370位點的多態(tài)性對肺功能存在影響。攜帶TT型的阻塞性睡眠呼吸暫?；颊?，其呼吸暫停低通氣指數(shù)顯著高于GG、GT攜帶者[10]。慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患者中，GT基因型攜帶者FEV1每年的下降程度低于GG基因型攜帶者[31]。但本研究在中國女子長跑運動員中未發(fā)現(xiàn)不同基因型攜帶者之間的肺功能指標存在差異，推測原因與rs5370位點多態(tài)性對運動員人群肺功能的影響很小，并被環(huán)境因素（如訓練經(jīng)歷）所遮掩有關(guān)。

EDN1基因rs5370位點的多態(tài)性同樣影響有氧運動能力，COPD 患者中rs5370位點GG 型攜帶者的VO2max水平更高（OR=6.1，95%CI=0.83～11.4）[32]。本研究結(jié)果顯示：中國女子長跑運動員中rs5370位點的多態(tài)性與運動生理學指標顯著關(guān)聯(lián)，GT基因型攜帶者的VO2max和10000米PB顯著優(yōu)于GG型攜帶者。推測其原因在于：（1）升高ET-1 水平增強心血管系統(tǒng)機能。rs5370多態(tài)性會影響ET-1的生成水平，TT型攜帶者的血漿ET-1水平顯著高于GT和TT型攜帶者[7，8]。此外，高原訓練約占長跑運動員總訓練時間的1/6～1/4。ET-1可通過HIF-1α誘導來促進血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因的表達[3]，VEGF的生成增加改善肌肉的氧交換。（2）提高Ca2+的敏感性改善跑步經(jīng)濟性（running economy，RE）。T 等位基因與Ca2+介導的血管收縮力量增加相關(guān)聯(lián)[30]。競技長跑項目對RE 水平要求很高，Ca2+的敏感性增加可以降低肌纖維收縮和神經(jīng)-肌肉傳導過程對Ca2+的需要，減少Ca2+泵的能量消耗，有助于提高長跑運動員的RE水平[33]。（3）促進糖酵解代謝途徑。蛋白質(zhì)中特定的賴氨酸殘基與糖酵解中間代謝產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，該反應(yīng)抑制糖酵解酶的活性[34]。rs5370位點導致的非同義突變解除了這一反應(yīng)對糖酵解酶活性的抑制，有利于增強長跑運動員在比賽中的加速和沖刺能力，以獲得更好的PB。上述改變有利于提高有氧運動能力和競技成績。由于rs5370位點所在區(qū)域在第一次酶切過程中被剪切，因此推測該位點的突變主要是通過影響mRNA的穩(wěn)定性、改變ppET-1的氨基酸序列甚至空間結(jié)構(gòu)以及第一次酶切過程影響成熟ET-1的生成，而對第二次的酶切過程影響不大，需要進一步研究證實rs5370多態(tài)性位點的生物學功能。本研究并未觀察到TT攜帶者高于GT、GG攜帶者，原因可能與過高水平的ET-1導致血管收縮增加和血壓升高，反射性抑制了心率[25]，降低了運動中心臟泵血功能的儲備能力，產(chǎn)生了不利結(jié)果[1]。同時TT型攜帶者的例數(shù)較少可能導致結(jié)果偏倚。

但是GT型攜帶者的VO2-AT/VO2max顯著低于GG攜帶者。AT與VO2max、RE是長跑運動員取得成功的3個關(guān)鍵生理學因素，VO2-AT/VO2max 是AT 攝氧量與VO2max 之間的比值。國際優(yōu)秀女子長跑運動員的VO2-AT/VO2max 為80%～90%左右，該值越大，說明相對于遺傳基礎(chǔ)，有氧訓練的水平越高[12]，一定程度上可以反映運動員在AT 時的RE 水平[35]。由于AT 相比較VO2max受訓練因素的影響更大，長時間耐力性訓練可使肌肉工作效率和RE每年提高1%～3%[35]，因此推測該結(jié)果可能與訓練年限有關(guān)。

鑒于運動表現(xiàn)受多基因調(diào)控的復雜性，rs5370位點對運動表型的影響還受到不同基因相互之間、同基因不同位點之間的連鎖不平衡以及社會環(huán)境因素的影響。ET-1介導平滑肌的收縮與腎上腺素系統(tǒng)[36]、NO[27]、環(huán)前列腺素[37]、血管緊張素II[30]等激素或信號分子之間存在交互作用。rs5370和rs4714383 所構(gòu)建的單體型對HERITAGE人群收縮壓、脈壓差訓練適應(yīng)性個體差異的解釋程度分別為2.6%和3.5%，其中單一位點的解釋程度為0.8%～1.7%[28]。rs5370位點的多態(tài)性對血壓、心肺功能等表型指標的影響與肥胖[10]、心肺耐力[28]、社會經(jīng)濟狀況[29]等因素存在交互作用。

4 結(jié)論

本研究通過橫向關(guān)聯(lián)研究設(shè)計分析了在中國女子長跑運動員中，EDN1基因rs5370位點多態(tài)性與運動生理機能和競技成績之間的關(guān)系，并通過與本實驗室前期北方漢族優(yōu)秀運動員樣本的對照分析，進一步證實了rs5370位點GT基因型是中國女子長跑運動員的敏感基因標記，且GT 型攜帶者的有氧運動能力和10000米PB更好。