CircHIPK3通過(guò)調(diào)控p53-Akt-Mdm2通路影響食管鱗癌的惡性表型

茍?jiān)凭?，馬繼龍，韓松辰，金大成，陳猛，王兵，柏啟州

0 引言

食管癌是一種高發(fā)病率和高死亡率的疾病[1-2]，主要由食管黏膜上皮細(xì)胞異型增生而來(lái)，分為食管鱗癌和食管腺癌兩種。發(fā)展中國(guó)家和亞洲地區(qū)食管癌病理類(lèi)型主要是食管鱗癌，我國(guó)約86%以上的患者都屬此列[3]。臨床上晚期食管鱗癌5年總體生存率低于15%，早期食管鱗癌患者存活率則可以超過(guò)80%[4-6]。手術(shù)對(duì)早期食管鱗癌療效確切，術(shù)后放化療療效仍有爭(zhēng)議，靶向治療已被證實(shí)對(duì)多種惡性腫瘤效果良好，但目前食管鱗癌的靶向治療仍缺乏更加有效的治療靶點(diǎn)。

環(huán)狀RNA是一種非編碼RNA，HIPK3可以產(chǎn)生22種環(huán)狀RNA，其中3種存在于動(dòng)物體內(nèi)，其余19種存在于人體細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)CircHIPK3在多個(gè)惡性腫瘤內(nèi)存在表達(dá)異常[7-9]。本文研究了食管鱗癌組織中CircHIPK3表達(dá)異常對(duì)食管鱗癌的影響，以期為食管鱗癌的診斷和靶向治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究人群及組織樣本 本研究納入11例臨床患者病理資料，其中男8例、女3例；患者平均年齡（58.82±9.67）歲；1例患者家族中曾患類(lèi)似疾病，余10例無(wú)遺傳病史；5例有吸煙史；7例有飲酒史；中段食管鱗癌患者8例，上段和下段食管鱗癌患者分別為1例和2例，排除腫瘤位置位于賁門(mén)者（胃食管結(jié)合部腫瘤病理及治療目前暫無(wú)確切研究結(jié)果，加入可能會(huì)影響研究結(jié)果）；腫瘤組織分型中，高分化2例、中分化6例、低分化3例；所有患者腫瘤分期均為可手術(shù)的Ⅰ期或Ⅱ期，其中Ⅰ期患者8例、Ⅱ期患者3例。術(shù)前對(duì)患者腫瘤大小、分期、肺功能、心功能進(jìn)行評(píng)估，本研究中患者臨床及病理分期標(biāo)準(zhǔn)為2013年AJCC分期。

根據(jù)術(shù)前病理活檢進(jìn)行篩選，對(duì)入選患者嚴(yán)格追蹤觀察，術(shù)后病理活檢結(jié)果確定最終是否納入研究。癌組織取自患者腫瘤部位，且顯微鏡下復(fù)查可見(jiàn)明顯異形細(xì)胞；癌旁組織取自遠(yuǎn)離瘤體≥5 cm的位置，且在顯微鏡下復(fù)查時(shí)未觀察到腫瘤細(xì)胞。

1.1.2 細(xì)胞EC9706細(xì)胞系購(gòu)于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，選取傳代少于6月的細(xì)胞，培養(yǎng)使用RPMI1640培養(yǎng)基；10%北美胎牛血清；1%雙抗，5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑及儀器 CCK-8（Sigma,USA）、血清（Boehringer-Ingelheim company）、胎牛血清（Biological Industries,Israel）、Transwell 小室（Costar,USA）、Matrigel（Gibco,USA）、TRIzol（Invitrogen,Carlsbad,CA,USA）、ant-P53、ant-Akt和ant-Mdm2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，β-actin鼠抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。過(guò)表達(dá)病毒及低表達(dá)病毒均由美國(guó)賽業(yè)公司合成構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 HIPK3表達(dá)量與食管鱗癌發(fā)生關(guān)系預(yù)測(cè) 通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)（http://gepia.cancer-pku.cn/）下載食管鱗癌患者相關(guān)數(shù)據(jù)，其中食管鱗癌患者共182例，非癌患者286例。對(duì)食管鱗癌患者HIPK3的表達(dá)量行數(shù)據(jù)分析，同時(shí)對(duì)不同分期的食管鱗癌患者的HIPK3的表達(dá)量進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 過(guò)表達(dá)及低表達(dá)CircHIPK3食管鱗癌細(xì)胞株的構(gòu)建及檢測(cè) 將食管鱗癌EC9706細(xì)胞以5×105個(gè)/毫升的密度接種于6孔板中，每組設(shè)2個(gè)平行孔。對(duì)照組加入等體積PBS，12 h后分別更換新鮮培養(yǎng)液，于37°C,5%CO2,95%濕度環(huán)境中繼續(xù)孵育。兩天后收集細(xì)胞，用嘌呤霉素篩選。試驗(yàn)共分四組，高表達(dá)組、高表達(dá)對(duì)照組、低表達(dá)組和低表達(dá)對(duì)照組，見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)分組Table1 Test grouping

1.2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，0.25%的胰酶進(jìn)行消化制成單細(xì)胞懸液，CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以每孔1×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中并繼續(xù)孵育，第2、3、4天分別于每孔加入10 μl CCK-8，37℃孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.2.4 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在24孔板中每孔接種1×105個(gè)細(xì)胞，加入0.1%BSA-RPMI1640，將Transwell小室置于24孔板中，加入細(xì)胞懸液100 μl。36 h后取出小室，甲醛固定，結(jié)晶紫染色，擦去濾膜內(nèi)表面細(xì)胞。計(jì)數(shù)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)，每膜計(jì)數(shù)5個(gè)隨機(jī)不同視野，每組設(shè)3次重復(fù)。

1.2.5 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 在濾膜內(nèi)表面涂基質(zhì)膠形成人工重組基底膜，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.7 qRT-PCR 檢測(cè)CircHIPK3 的表達(dá)情況 TRIzol提取細(xì)胞總RNA，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為37℃，15 min；85℃，5 s。GAPDH作為內(nèi)參，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA作為模板按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)配制10 μl的PCR反應(yīng)體系，見(jiàn)表2，反應(yīng)條件為：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。測(cè)Ct值，基因的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt表示。

表2 PCR反應(yīng)體系及計(jì)量表格Table2 PCR reaction system and metrological table

1.2.8 預(yù)測(cè)下游調(diào)控miRNA種類(lèi) 通過(guò)生物信息學(xué)分析的方式，對(duì)CircHIPK3基因的下游miRNA和調(diào)控通路進(jìn)行分析，然后再分別通過(guò)TargetScan 7（http://www.targetscan.org/mamm_31）、miRBASE（http://www.mirbase.org/）、miRDB（http://mirdb.org/）和DIANA（https://academic.oup.com）四種軟件，使用Venn圖法，取四種軟件預(yù)測(cè)miRNA的交集進(jìn)行驗(yàn)證，再通過(guò)單一數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)下游miRNA進(jìn)行評(píng)價(jià)預(yù)測(cè)。

1.2.9 Western blot檢測(cè)CircHIPK3細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá) RIPA提取蛋白，蛋白濃度與5×SDS蛋白上樣緩沖液以1:4比例混合，煮沸變性后，10%的SDS-PAGE分離樣品，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，將膜與一抗室溫孵育2 h，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，暗室中加入ECL試劑，X線片曝光，顯影和定影。在ImageQuant 350電泳凝膠成像分體系統(tǒng)中曝光拍照，并借助Image J軟件對(duì)吸光度值進(jìn)行分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白吸光度值/GAPDH蛋白吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS24.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用GraphPad Prism 6.0作圖。運(yùn)用t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIPK3與食管鱗癌的關(guān)系

通過(guò)對(duì)生物信息數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)HIPK3高表達(dá)的食管鱗癌患者，生存率顯著低于HIPK3低表達(dá)患者。對(duì)不同分期食管鱗癌患者的HIPK3表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)早期食管鱗癌患者的HIPK3表達(dá)較低，而晚期食管鱗癌患者的HIPK3表達(dá)較高，見(jiàn)圖1。

2.2 CircHIPK3的表達(dá)在癌組織和癌旁組織中的差異

CircHIPK3在18例樣本中明顯高表達(dá)，其中高表達(dá)的癌組織（n=11）占所有高表達(dá)組織的61%，表達(dá)量明顯高于癌旁組織（P＜0.005）。

2.3 CircHIPK3的異常表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在CircHIPK3高表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖速度明顯加快，低表達(dá)的CircHIPK3腫瘤細(xì)胞增殖明顯被抑制。即pcDNA3.1bcirc＞pcDNA3.1b＞NC＞shRNA，見(jiàn)圖2。

2.4 CircHIPK3對(duì)EC9706細(xì)胞遷移能力的影響

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHIPK3高表達(dá)的EC9706細(xì)胞遷移能力高于高表達(dá)對(duì)照組（P＜0.001）；CircHIPK3低表達(dá)EC9706細(xì)胞的遷移速度明顯減慢（P＜0.001），見(jiàn)圖3。

2.5 CircHIPK3對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHIPK3高表達(dá)的EC9706細(xì)胞侵襲能力高于高表達(dá)對(duì)照組（P＜0.001）；而CircHIPK3低表達(dá)的EC9706細(xì)胞侵襲能力明顯低于低表達(dá)對(duì)照組（P＜0.001），見(jiàn)圖4。

2.6 CircHIPK3的表達(dá)和EC9706細(xì)胞凋亡的相關(guān)性

CircHIPK3高表達(dá)的EC9706細(xì)胞的凋亡速度小于高表達(dá)對(duì)照組（P＜0.001）；而CircHIPK3低表達(dá)的EC9706細(xì)胞凋亡速度較低表達(dá)對(duì)照組增快（P＜0.001），見(jiàn)圖5。

2.7 CircHIPK3和P53-Akt-Mdm2通路蛋白表達(dá)相關(guān)性

圖1 HIPK3與食管鱗癌患者生存率和分期的關(guān)系Figure1 Relation between HIPK3 and survival rate(A),staging(B) of esophageal carcinoma patients

圖2 CircHIPK3的異常表達(dá)對(duì)EC9706細(xì)胞增殖的影響Figure2 Effect of abnormal expression of CircHIPK3 on proliferation of EC9706 cells

圖3 CircHIPK3對(duì)EC9706細(xì)胞遷移能力的影響Figure3 Effect of CircHIPK3 on migration ability of EC9706 cells

圖4 CircHIPK3對(duì)EC9706細(xì)胞侵襲能力的影響Figure4 Effect of CircHIPK3 on invasion ability of EC9706 cells

本研究使用Venn圖法對(duì)四種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)CircHIPK3影響的下游miRNA主要包括hsa-miR-302e；hsa-miR-520a-3p；hsa-miR-520e；hsa-miR-520b；hsa-miR-520c-3p；hsa-miR-520d-3p；單一數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CircHIPK3和miRNA的通路進(jìn)行分析（CircHIPK3和miRNA的相關(guān)關(guān)系評(píng)分見(jiàn)表3），發(fā)現(xiàn)其主要功能的實(shí)現(xiàn)與p53-Akt-Mdm2通路相關(guān)。對(duì)四種CircHIPK3不同表達(dá)的食管鱗癌細(xì)胞的p53-Akt-Mdm2通路相關(guān)蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)的CircHIPK3細(xì)胞內(nèi)的抑癌基因p53被明顯抑制，而細(xì)胞內(nèi)的Akt-Mdm2信號(hào)通路則處于激活狀態(tài)，癌細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)量隨之增加，其對(duì)癌細(xì)胞的影響較大，最重要的是導(dǎo)致癌細(xì)胞的生理過(guò)程包括增殖、遷移和侵襲以及相關(guān)癌癥蛋白的表達(dá)增加，癌細(xì)胞的相關(guān)功能增強(qiáng)；反之，低表達(dá)的CircHIPK3則對(duì)癌細(xì)胞的功能有抑制作用，見(jiàn)圖6。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)CircHIPK3在11例食管鱗癌標(biāo)本中和7例癌旁組織中呈上調(diào)趨勢(shì)，4例食管鱗癌旁組織樣本中表達(dá)下調(diào)。基于CircHIPK3表達(dá)存在顯著差異，本研究在細(xì)胞層面對(duì)CircHIPK3在食管鱗癌中的表達(dá)情況進(jìn)行了進(jìn)一步試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CircHIPK3表達(dá)升高促進(jìn)食管鱗癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，抑制細(xì)胞凋亡，而下調(diào)CircHIPK3表達(dá)具有相反的作用。有研究表明以上miRNA多與CD44因子和p53-Akt-Mdm2通路的表達(dá)相關(guān)[10-13]。本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)CircHIPK3的下游調(diào)控基因及蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步分析，并使用Western blot進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)CircHIPK3低表達(dá)時(shí)，抑癌基因p53被激活，Akt-Mdm2信號(hào)通路被抑制，其表達(dá)的相關(guān)p53-Akt-Mdm2通路蛋量減少，癌細(xì)胞的功能抑制。

圖5 CircHIPK3的表達(dá)和EC9706細(xì)胞凋亡的相關(guān)性Figure5 Correlation between CircHIPK3 expression and apoptosis of EC9706 cells

表3 CircHIPK3和mirRNA的相關(guān)關(guān)系評(píng)分Table3 Correlation score between CircHIPK3 and mirRNA

研究者們通過(guò)對(duì)人體腫瘤組織的基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA在膀胱癌、腸癌、肝癌、肺癌等人體多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，且通過(guò)參與多種腫瘤相關(guān)蛋白如WNT和VEGF等的合成過(guò)程發(fā)揮作用[9,14-15]。Zheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)circHIPK3在多種癌癥的癌組織和癌旁組織中差異穩(wěn)定。此后，較多研究[9,16-17]也得到類(lèi)似的結(jié)果。

腫瘤蛋白p53是抑癌基因的一種。p53基因在各種內(nèi)外因素的作用下（包括物理輻射、化學(xué)污染、生物及病毒因素等多種因素）發(fā)生突變后，其空間構(gòu)象隨著改變，此時(shí)，p53基因失去了對(duì)細(xì)胞的正常調(diào)控，使細(xì)胞和組織癌變。研究表明，在所有惡性腫瘤中，該基因的突變率約50%[18]。

絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）是一種原癌基因，在調(diào)控細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要作用[18-20]，且其對(duì)于腫瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)途徑與p53完全相異；Mdm2是一種人體的癌蛋白，是p53基因的主要調(diào)節(jié)蛋白，Mdm2突變與p53突變不共存，可通過(guò)特異性結(jié)合p53阻斷其生物學(xué)活性，與腫瘤的增殖密切相關(guān)[21-22]。同時(shí)Akt可以穩(wěn)定Mdm2蛋白的作用，協(xié)同Mdm2抑制p53活性[23-25]。因此，我們推測(cè)CircHIPK3可能通過(guò)該通路調(diào)節(jié)食管鱗癌細(xì)胞的生理活性。

本研究首先通過(guò)慢病毒構(gòu)建具有不同CircHIPK3表達(dá)水平的食管鱗癌細(xì)胞系，觀察到p53-Akt-Mdm2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)mRNA和蛋白的水平隨CircHIPK3的表達(dá)不同而改變。在穩(wěn)定過(guò)表達(dá)CircHIPK3的細(xì)胞中，Akt-Mdm2通路的作用被促進(jìn)，同時(shí)抑癌基因p53作用被抑制，癌細(xì)胞的功能增強(qiáng)。CircHIPK3低表達(dá)則結(jié)果相反。

圖6 CircHIPK3和P53-Akt-Mdm2通路蛋白表達(dá)相關(guān)性Figure6 Correlation between CircHIPK3 and P53-Akt-Mdm2 pathway protein expression

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CircHIPK3促進(jìn)人食管鱗癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并抑制細(xì)胞凋亡，這可能通過(guò)調(diào)節(jié)p53-Akt-Mdm2信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，CircHIPK3存在作為食管鱗癌潛在靶點(diǎn)的可能性，但本研究對(duì)其具體作用通路和機(jī)制表述仍不明確，還需要更大樣本和更深入的研究。