黃連素對大鼠結(jié)腸敏感性和動力學(xué)異常引起腸易激綜合征的影響及其機制探討

柴 紅 吳平亞，2 楊 政 吳承云 譚詩云 羅和生

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)是臨床上最常見功能性腸病，全球患病率為2%—15%，甚至達到25%[1]。它的主要病理生理特征為患者腸道對額外刺激產(chǎn)生應(yīng)激性高敏感性和動力異常紊亂[2]。其實質(zhì)和節(jié)點歸結(jié)于結(jié)腸平滑肌細胞膜上L-型鈣通道(L-type Calcium Current,ICa-L)發(fā)生紊亂和電重構(gòu)，胞外Ca2+過多通過ICa-L進入細胞內(nèi)，使細胞膜電位升高，產(chǎn)生異常去極化及興奮性，誘發(fā)IBS[3]。所以，有關(guān)治療IBS的藥物亦可能需要針對其作用結(jié)腸平滑肌細胞膜上ICa-L。黃連素(Berberine,BBR)是古老傳統(tǒng)中藥黃連的主要成分，能夠改善高糖誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細胞和微血管內(nèi)皮細胞損傷[4]，調(diào)節(jié)大腦內(nèi)某些電壓依賴性離子通道，減弱結(jié)腸平衡肌的致敏性與應(yīng)激反應(yīng)，阻斷其興奮收縮偶聯(lián)和痙攣，起到治療IBS作用。推測BBR這種功效與其能直接抑制結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L有關(guān)，但它如何具體作用IBS病理生理特征及其機制的探討仍然有限[5]。本文以大鼠作為BBR作用對象，利用直結(jié)腸擴張實驗(Colorectal Distension,CRD)制備IBS模型，觀察BBR作用IBS前后大鼠癥狀和軀體化胃腸道反應(yīng)特征，以及結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L的變化，旨在為BBR應(yīng)用于臨床治療IBS提供更多實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和儀器

1.1.1動物：45只SPF級SD雄性大鼠購于武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，鼠齡8周，體質(zhì)量250±50g，購回后飼養(yǎng)于本院SPF級實驗動物中心，維持室溫25℃±2℃，相對濕度65%—70%，日光/黑暗周期12h/12h(光照時間7∶00-19∶00)，背景噪音為(40±10)dB，自由進食進水，1周后進入實驗。

1.1.2試劑和儀器：BBR購自中國食品藥品檢定研究院(國家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，含量為86.7%)；使用前臨時用去離子超純水經(jīng)超聲助溶配制成2.5mg/ml混懸溶液，供灌胃使用。HEPES、CollagenaseⅡ、胰蛋白酶抑制劑、CsCl、CsOH、Na2-ATP、EGTA、TEA 為Sigma公司產(chǎn)品。無鈣生理鹽溶液(PSS)(mmol/L)：NaCl 135.0，KCl 5.0，MgCl21.2，glucose 10.0，HEPES 10.0，用Tris-HCl調(diào)pH至7.4。獲得結(jié)腸平滑肌細胞的消化液：Ca2+-free PSS液，0.12% CollagenaseⅡ，0.2%胰蛋白酶抑制劑和0.2% BSA。記錄ICa-L電極外液(mmol/L)：NaCl 147.0，KCl 5.4，CaCl22.0，glucose 10.0，MgCl21.05，NaH2PO40.42，HEPES 10.0，用NaOH 調(diào)pH至7.35。記錄ICa-L電極內(nèi)液(mmol/L)：CsCl 135.0，MgCl24.0，HEPES 10.0，Na2-ATP 2.0，EGTA 10.0，TEA 20.0，用CsOH調(diào)pH至7.3。8導(dǎo)生理記錄儀(PowerLab 8/35，澳大利亞)、倒置顯微鏡(IX 70-122，日本)、細胞記錄槽(Warner1-260ul,美國)、Pulse+Pulsefit軟件(version8.31，德國)、膜片鉗放大器(EPC-9，德國)。

1.2 動物分組與處理

實驗大鼠分為對照組、IBS模型組(IBS組)和IBS模型+BBR干預(yù)組(BBR組)，每組各15只。利用CRD[6]建立IBS模型大鼠，具體操作如下：將30只造模大鼠在第1天禁食24h，禁水12h；第2天于清醒狀態(tài)下，在大致相同的時間段將大鼠放入特定自制的固定器(15cm×5cm×5cm透明塑料桶)內(nèi)，使大鼠只能上下運動，無法前后活動及轉(zhuǎn)身。取一根8F導(dǎo)尿管，一端用0號手術(shù)線綁一片從避孕套上剪下的膜，形成密閉可充氣的小囊(最大容量1—2ml)，另一端接一個三通閥，其另外2個開口分別接5ml注射器和壓力換能器，用注射器向?qū)蚬苄∧液蛪毫Q能器通道中注射生理鹽水后抽出，反復(fù)多次直至整個通道密閉無空氣和生理鹽水。給導(dǎo)尿管及其小囊外表以及大鼠肛門周圍涂抹有潤滑作用的醫(yī)用液體石蠟，將小囊導(dǎo)管經(jīng)大鼠肛門緩慢插入結(jié)腸中大約2cm，之后用膠布將暴露在外的導(dǎo)管固定在大鼠尾根部，靜待20min至大鼠適應(yīng)，通過注射器向小囊中注射一定量37℃生理鹽水?dāng)U張球囊，直至大鼠出現(xiàn)腹背部肌肉較強收縮并把腹部抬離地面的腹壁回撤反射(Abdominal Withdrawal Reflex,AWR)[7]，1次/5min，30s/次，重復(fù)測量3次，連續(xù)操作一周。對照組采用同樣方法，只是在氣囊導(dǎo)管插入肛門后不注入生理鹽水，亦即不產(chǎn)生AWR現(xiàn)象。造模成功大鼠會發(fā)生排便習(xí)慣、性狀和數(shù)量改變，大鼠明顯消瘦、毛發(fā)枯黃、食欲減退和體重減輕，精神萎靡消沉、運動和飲水減少，排便次數(shù)和顆粒數(shù)明顯增加、且性狀為稀水或糊狀。本文30例大鼠全部造模成功，隨機分配給IBS組和BBR組各15只。剩下未用于造模的15只大鼠作為對照組。將BBR按100mg/kg最大劑量配置成懸濁液，按3ml/次給BBR組大鼠灌胃，1次/天，7天為1個療程，連續(xù)2個療程，對照組和IBS組大鼠給予相同容量和療程的生理鹽水灌胃。在2個灌胃療程完成后，各組大鼠繼續(xù)喂養(yǎng)2周并觀察以下各指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1大鼠體重變化：大鼠體重變化是以造模前一天稱量所得體重與從灌胃開始至4周后第2天同一時間段稱量大鼠所得體重差值的絕對值表示。

1.3.2大鼠排便變化：觀察糞便性狀，計算排便數(shù)量。收集各組大鼠造模前一天以及從灌胃開始至4周后第2天同一時間段2h內(nèi)排出糞便的顆粒數(shù)，稱重(濕重)，后用烘箱烘干(75℃，2.5h)，再稱重(干重)，計算糞便含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.3大鼠IBS發(fā)生率：IBS發(fā)生率(%)=大鼠總例數(shù)-體重、排便特征性發(fā)生改變大鼠例數(shù)/大鼠總例數(shù)×100%。

1.3.4結(jié)直腸敏感性指標(biāo)AWR評分：在完成從灌胃開始到4周之后第2天，再一次行CRD過程，以擴張結(jié)直腸內(nèi)球囊引起大鼠腹部抬起和背部拱起作為標(biāo)準(zhǔn)，AWR評分由容量閾值得出[7]，由球囊直徑對應(yīng)的容積值表示：直徑2mm對應(yīng)0ml容量；直徑8.5mm對應(yīng)0.5ml容量；直徑10.9mm對應(yīng)0.8ml容量；直徑12.2mm對應(yīng)1.2ml容量；直徑13.5mm對應(yīng)1.6ml容量。

1.3.5結(jié)直腸動力異常指標(biāo)運動指數(shù)(Motility Index,MI)及其變化率：在完成AWR評分后，用注射器抽出導(dǎo)尿管小囊和通道中的生理鹽水，使壓力顯示在0mmHg附近，讓大鼠靜息60min(消除直結(jié)腸記憶對后續(xù)實驗數(shù)據(jù)影響)，之后將小囊導(dǎo)管經(jīng)大鼠肛門緩慢插入結(jié)腸中大約5—7cm，用注射器向?qū)蚬苄∧液屯分芯徛⑸?7℃生理鹽水?dāng)U張球囊，并觀察壓力曲線波形的變化，當(dāng)曲線波形變化最劇烈時，停止注射，關(guān)閉與注射器相連的三通閥門，穩(wěn)定30min，隨后再繼續(xù)記錄30min的結(jié)腸運動曲線，計算曲線下面積，即為直結(jié)腸MI(計算方法：連續(xù)測量5個10min內(nèi)的曲線下面積，取其均值，單位mmHg.S)；MI變化率=(實驗后的MI-實驗前的MI)/實驗前的MI×100%。

1.3.6結(jié)腸平滑肌細胞的分離及膜片鉗記錄：各組大鼠完成上述各項觀察指標(biāo)后，頸椎脫臼處死、開腹，取4—5cm長的近端結(jié)腸，于4℃的100% O2飽和Ca2+-free PSS液洗凈、平攤、固定，在解剖顯微鏡下銳性分離粘膜層和粘膜下層以環(huán)形肌為主的肌條，漂洗、剪碎、置于含消化液的燒杯中孵育、振蕩、吹打，消化15—20min得到單個結(jié)腸平滑肌細胞懸液。吸取數(shù)滴細胞懸液加入到顯微鏡載物臺上細胞記錄槽中(25-30℃)，靜置5min，用記錄ICa-L細胞外液沖灌細胞10min。再通過全細胞膜片鉗記錄方法對細胞進行鉗制，脈沖信號由Pulse+Pulsefit軟件控制，經(jīng)EPC-9放大器放大，由Pulse軟件收集并存儲于計算機硬盤中。玻璃微電極充灌電極內(nèi)液后電阻為2.5—3.5MΩ，對結(jié)腸平滑肌細胞進行封接，當(dāng)封接電阻達1GΩ以上后，補償快電容，施加負壓吸破細胞膜，給予慢電容和漏電容補償，形成全細胞記錄模式。將膜電位鉗制在-60mV，指令電位由-50mV到+50mV，躍階10mV，鉗制時間300ms，可記錄到一緩慢的內(nèi)向電流，此電流在-40mV開始激活，在+10mV達到最大，之后隨鉗制電壓的增加逐步減小。給予10μmol/L的L型鈣通道拮抗劑尼卡地平可以明顯抑制該電流，表明此電流為ICa-L。記錄ICa-L經(jīng)Pulse軟件采集并存儲于計算機，后用Igor Pro分析軟件對實驗圖形進行擬合分析處理。為消除細胞大小對統(tǒng)計影響，電流電位用電流密度(pA/pF)表示。ICa-L的電流-電壓曲線(Current-voltage Curve,I-V曲線)是以各自指令電壓為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的電流密度為縱坐標(biāo)繪制。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 三組大鼠主要臨床特征比較

在完成IBS造模并經(jīng)過連續(xù)2個灌胃療程，且繼續(xù)飼養(yǎng)2周后第2天比較各組大鼠主要臨床特征發(fā)現(xiàn)，三組大鼠主要臨床特征差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，IBS組大鼠皮毛枯黃無光澤，精神萎靡不振，厭食，體形消瘦，體重減輕明顯，排便顆粒數(shù)及其含水量、以及IBS發(fā)生率均增加顯著(t均>14.71，P<0.01)；而BBR組大鼠毛發(fā)光亮潔白，食欲良好，身體肥大，排便次數(shù)減少，明顯好于IBS組大鼠臨床癥狀，與IBS組比較，BBR組大鼠體重增加量、2h內(nèi)排出糞粒數(shù)及其含水減少量、IBS發(fā)生率均得以改善和減少(t均>9.62，P<0.01)，恢復(fù)到對照組水平(t均<1.74，P均>0.05)。見表1。

表1 三組大鼠主要臨床特征的比較均=15)

注：與對照組比較，1)P<0.01；與IBS組比較，2)P<0.01

2.2 三組大鼠結(jié)腸敏感性和動力異常主要指標(biāo)比較

三組大鼠結(jié)腸敏感性和動力異常主要指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與對照組比較，IBS組大鼠腹部抬起和背部拱起所需注水量減少明顯，結(jié)直腸MI及其變化率增加顯著(t均>20.17，P<0.01)；經(jīng)BBR灌胃作用后，BBR組大鼠上述各異常觀察值均較IBS組改善(t均>15.05，P<0.01)，基本恢復(fù)到對照組水平(t均<3.18，P均>0.05)見表2。

表2 三組大鼠結(jié)腸敏感性和運動失常主要指標(biāo)比較均=15)

注：與對照組比較，1)P<0.01；與IBS組比較，2)P<0.01

2.3 三組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L及其I-V曲線比較

與對照組比較，IBS組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L幅度明顯增大，而BBR組ICa-L幅度較IBS組顯著減小，且隨著鉗制電壓增大，ICa-L減小幅度更明顯，接近對照組范圍。當(dāng)鉗制電位為+10mV時，三組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=73.58，P<0.01)，與對照組比較，IBS組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L明顯增大[(7.69±0.45)pA/pF vs(15.38±2.19)pA/pF，t=13.08，P<0.01]，與IBS組比較，BBR結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L明顯減小 [(15.38±2.19)pA/pF vs(10.91±0.58)pA/pF，t=3.13，P<0.05]。另外，BBR組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L的I-V曲線較IBS組明顯上抬，處于IBS組和對照組之間，接近對照組，且各組I-V曲線的形態(tài)方向沒有發(fā)生改變，提示記錄結(jié)果穩(wěn)定可靠。見圖1、圖2。

注：A，對照組；B，IBS組；C，BBR組圖1 三組大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L

圖2 三組結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L的I-V曲線

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示我國普通人群IBS總體患病率為6.5%，其中22%曾因IBS癥狀而就診[8]。其主要病理生理基礎(chǔ)為胃腸道高敏感性和蠕動紊亂，二者或為單一引起，或多重因素合并誘發(fā)。鑒于此，本實驗IBS模型制備遵循國際公認CRD，即用一種體外強加的不利單因素影響大鼠的胃腸道功能，使大鼠無論從精神上還是胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定上得到折磨，出現(xiàn)毛發(fā)干枯灰黃，食欲減退消瘦、排便次數(shù)增加且性狀為稀水或糊狀等臨床癥狀，提示制備IBS模型成功，且高達93%的發(fā)生率，適合進行下一步的藥物干預(yù)實驗。然而目前治療IBS多限于西藥制劑，看似起效快，但遠期療效差，部分西藥可導(dǎo)致心血管毒性，高血壓危象，性功能障礙、失眠和藥物抵抗等并發(fā)癥，至今尚存爭議[9]。研究發(fā)現(xiàn)中草藥具有良好的抗IBS作用，與西藥相比毒性反應(yīng)較小。BBR是黃連中最主要的活性成分，對腸道疾病特別是腹痛、腹瀉等癥狀有良好的治療效果。本實驗觀察結(jié)果表明，經(jīng)BBR干預(yù)后的IBS大鼠，毛發(fā)光亮潔白，食欲良好，身體肥大，排便次數(shù)減少，體重增加更明顯，2h內(nèi)排出糞便顆粒數(shù)及其含水減少量均較顯著，引起IBS發(fā)生率也較明顯下降，提示BBR對IBS癥狀具有明顯改善作用，且本實驗是在BBR作用之后，停藥2周進行相關(guān)指標(biāo)觀察，提示BBR治療效果的穩(wěn)定性和持續(xù)性，不易復(fù)發(fā)，顯示BBR治療IBS具有更顯著的優(yōu)勢[10]。

IBS的發(fā)生來自腸道高敏感性和動力異常反應(yīng)，對其評估常選用引起各種感覺和運動變化的容量或壓力閾值，但對其有效治療藥物選擇仍處在開發(fā)之中[11]。BBR作為臨床上一種物美價廉的傳統(tǒng)止瀉藥物，被用來治療急慢性胃腸炎等腸道疾病歷史悠久，適用范圍廣，療效肯定。近年來臨床研究表明，BBR能夠緩解腹瀉、腹痛、腹脹等具有IBS臨床特征的疾患。本實驗結(jié)果表明，接受BBR作用的IBS大鼠的糞便排出量及其含水量均明顯減少，引起結(jié)直腸敏感性的腹壁回撤反射需要的注水量顯著增多，提示結(jié)直腸能夠經(jīng)受更大外力刺激，不易發(fā)生痙攣而產(chǎn)生紊亂性激烈蠕動。同時反映結(jié)直腸運動劇烈與減弱的運動指數(shù)及其變化率明顯下降，說明BBR對IBS大鼠的結(jié)直腸特別敏感性及其運動異常起到明顯抑制作用，可改善IBS大鼠排便習(xí)慣及其性質(zhì)，增加直結(jié)腸抵抗外部強烈刺激的能力，降低胃腸道壓力，減慢直結(jié)腸蠕動，緩解IBS大鼠的腹痛和/或腹瀉等臨床癥狀。所以，從治療效果可以看出，BBR對IBS大鼠的胃腸道高敏感性和動力異常形成的紊亂性腹痛、腹瀉等腸道不適狀態(tài)均有明顯改善。

IBS發(fā)生出自結(jié)腸平滑肌收縮反應(yīng)過度，張力增高，敏感性增強，其形成機制可能是平滑肌細胞ICa-L增加及其動力學(xué)發(fā)生異常改變，引起離子通道電重構(gòu)，造成結(jié)腸平滑肌細胞內(nèi)Ca2+超載，誘發(fā)結(jié)腸性動作電位觸發(fā)活動，導(dǎo)致結(jié)腸平滑肌細胞動作電位節(jié)律失常[12]。而BBR具有鈣通道拮抗劑作用，可減少基礎(chǔ)狀態(tài)和受刺激后人結(jié)腸黏膜的離子轉(zhuǎn)運，抑制平滑肌細胞上ICa-L，阻止小腸上皮細胞異常分泌，防治平滑肌異常過度敏感與異常蠕動，治療分泌性腹瀉，發(fā)揮治療IBS等功效[13]。本文實驗結(jié)果也表明，經(jīng)BBR作用后的IBS大鼠的結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L被顯著抑制，電流幅度在各鉗制電壓下均明顯減小，I-V曲線明顯上抬向?qū)φ战M大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L的 I-V 曲線靠近。說明BBR作用IBS大鼠結(jié)腸平滑肌細胞ICa-L的效果非常顯著，從而改善了IBS大鼠結(jié)腸平滑肌細胞膜上ICa-L的電重構(gòu)，防止IBS大鼠結(jié)腸平滑肌細胞外過多Ca2+通過ICa-L進入細胞內(nèi),引起Ca2+觸發(fā)Ca2+釋放(Ca2+-induced Ca2+release,CICR)的連鎖反應(yīng)，造成結(jié)腸平滑肌細胞內(nèi)Ca2+超載，引起Ca2+震蕩，誘發(fā)結(jié)腸性動作電位節(jié)律紊亂，敏感性異常而出現(xiàn)的IBS癥狀[14]。

綜上所述，BBR可改善IBS大鼠臨床特征，結(jié)腸敏感性和動力異常，其機制可能是BBR可以抑制大鼠結(jié)腸平滑肌細胞膜上ICa-L，該結(jié)果為BBR更好地應(yīng)用于臨床治療IBS提供了實驗依據(jù)和藥理基礎(chǔ)。

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