內(nèi)皮祖細(xì)胞來源的外泌體減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性損傷*

李羅成 王志維 吳紅兵 任宗力 任 偉

血管內(nèi)皮功能失調(diào)和損傷是心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和損傷的因素很多，缺氧是常見的因素之一。根據(jù)文獻(xiàn)報道，患有睡眠呼吸暫停綜合征或慢性阻塞性肺部疾病的患者，心腦血管疾病的發(fā)病率是正常人群的3-4倍[1]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和修復(fù)過程中主要通過兩種方式發(fā)揮重要作用：一是直接分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)，二是通過旁分泌多種生物因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及損傷狀態(tài)下的存活[2]。

在細(xì)胞進(jìn)行旁分泌過程中，外泌體(Exosomes，EXOs)起著類似貨倉的作用。EXOs是由真核細(xì)胞分泌的一種小囊泡，大部分直徑約30-100nm。因其在體液中可穩(wěn)定存在，并包含多種生物調(diào)節(jié)因子，可產(chǎn)生與其來源細(xì)胞相同的作用，近年來作為一種理想的基因載體引起廣泛關(guān)注[3-4]。EXOs通過細(xì)胞間質(zhì)或循環(huán)系統(tǒng)將細(xì)胞產(chǎn)生的生長因子、mRNA和miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)至靶細(xì)胞，被靶細(xì)胞攝取后調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)行為[5]。來源于EPCs的外泌體(EPCs-EXOs)是否也能執(zhí)行轉(zhuǎn)運(yùn)功能，從而實(shí)現(xiàn)EPCs的部分甚至全部生物學(xué)功能，值得探討。本文利用EPCs-EXOs干預(yù)經(jīng)缺氧處理的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)，以明確EPCs-EXOs對內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑

EPCs和HUVECs(Lonza公司，瑞士)，鼠抗CD63多克隆[TS63]抗體、兔抗α-tubulin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記兔抗鼠IgG(Abcam，英國)。兔抗CD81多克隆抗體(Santa Cruz，美國)，EXOs提取液(Total Exosome Isolation Reagent)(Invitrogen，美國)。RIPA lysis buffer、BCA蛋白檢測試劑盒、CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1EPCs培養(yǎng)及傳代：凍存的EPCs細(xì)胞株復(fù)蘇后，放入預(yù)涂過I型鼠尾膠的6孔培養(yǎng)板，采用含有5%胎牛血清和細(xì)胞因子的EGM-2 MV培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天更換一次培養(yǎng)液直至傳代。于倒置相差顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞生長達(dá)到培養(yǎng)板底部的80%-90%時進(jìn)行傳代，第2-6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2外泌體提?。簜鞔蟮腅PCs用無外泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)液，2 000g 離心30 min去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。將離心后的培養(yǎng)基以比例2∶1(v/v)添加EXOs提取液，4℃孵育過夜后10 000g離心1h。離心沉淀物即為外泌體，-80℃保存。

1.2.3Western blot檢測EXOs膜性標(biāo)志物：在提取的EXOs中加入適量RIPA lysis buffer，BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，取50μg蛋白質(zhì)經(jīng)15%聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)移到PVDF膜。轉(zhuǎn)膜后置于含5%脫脂奶粉的TBST中進(jìn)行封閉，加入一抗室溫孵育2h，TBST洗滌后再加入HRP標(biāo)記的二抗，37℃孵育1h。ECL化學(xué)發(fā)光，膠片曝光，采用Image J軟件對Western blot結(jié)果進(jìn)行條帶灰度分析。以a-tubulin蛋白為內(nèi)參照，目標(biāo)蛋白與a-tubulin蛋白條帶灰度比值為該蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4EXOs電鏡樣本制備和觀察：取出-80℃冰箱中保存的EXOs，放于冰水混合物中解凍，用4℃ 1×PBS將EXOs稀釋為0.5mg/ml的懸液。將碳包覆鎳網(wǎng)置于濾紙上，吸取20μl EXOs懸液，滴至碳包覆鎳網(wǎng)上，紅外燈下烘烤5min，烘干后在碳包覆鎳網(wǎng)上滴加1-2滴1%磷鎢酸，再次烘烤5min，于透射電鏡下觀察EXOs形態(tài)。

1.2.5HUVECs分組處理：HUVECs復(fù)蘇后，采用含10%胎牛血清和1%雙抗(青鏈霉素混合液)的RPMI 1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2-3天更換培養(yǎng)液。通過倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)到培養(yǎng)板底部的80%或出現(xiàn)接觸抑制時，進(jìn)行傳代。傳代次數(shù)為3-7次的HUVECs用于實(shí)驗(yàn)。缺氧處理時，當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)到培養(yǎng)板底部的80%，將培養(yǎng)板放置于低氧培養(yǎng)箱(1% O2，5% CO2，94% N2)中培養(yǎng)8h。低氧處理后，再將細(xì)胞移到常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并在不同時間點(diǎn)檢測細(xì)胞增殖、凋亡和遷移情況。實(shí)驗(yàn)分為三組：(1)正常對照組，按上述方法培養(yǎng)，但不作缺氧處理；(2)缺氧組，采用上述方法培養(yǎng)的HUVECs；(3)缺氧+EPCs-EXOs組，進(jìn)行缺氧處理前，在HUVECs中加入EPCs-EXOs，隨后即開始缺氧處理。

1.2.6CCK-8試劑盒檢測HUVECs增殖：將各組HUVECs按每孔4×103個接種至96孔板中，按照實(shí)驗(yàn)分組處理后置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(37℃，5% CO2)，培養(yǎng)0h、24h、48h后棄培養(yǎng)基，每孔加入新鮮配制的10μl毒性檢測液CCK-8，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育4h后，用酶標(biāo)儀測450nm波長處的吸光度(OD值)，根據(jù)公式計算相對細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對照組OD值×100%。

1.2.7流式細(xì)胞儀檢測HUVECs凋亡：將培養(yǎng)0h、24h、48h的HUVECs通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行凋亡檢測。收集培養(yǎng)液中懸浮的細(xì)胞和培養(yǎng)瓶內(nèi)貼壁的細(xì)胞，離心后棄去上清，滴加200μl Annexin V-FITC結(jié)合液，震蕩重懸細(xì)胞后再加入5μl Annexin V-FITC并混勻，在4℃下避光孵育15min。再在上述重懸細(xì)胞中加入5μl PI 染色液，混勻后于4℃下避光孵育5min，隨后通過流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡細(xì)胞比例。

1.2.8劃痕法檢測HUVECs遷移：先將6孔板背后用直尺和標(biāo)記筆均勻劃上間隔為0.5cm的橫線，每孔至少穿過5條線；然后每孔加入約5×105個HUVECs，并加入培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；第二天用移液器槍頭對6孔板底部的細(xì)胞進(jìn)行劃痕，再用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行處理，然后放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于0h、24h、48h拍照，比較各組細(xì)胞在各時間點(diǎn)遷移率：細(xì)胞遷移率=1-實(shí)測劃痕面積/初始劃痕面積，因拍照所取的劃痕長度一致，實(shí)際計算細(xì)胞遷移率=1-實(shí)測劃痕寬度/初始劃痕寬度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EPCs-EXOs的結(jié)構(gòu)

經(jīng)透射電鏡觀察EXOs的外觀結(jié)構(gòu)，可見EXOs呈橢圓形或杯狀膜性囊泡，大小不等，直徑約40-110nm，較多EXOs聚集在一起呈葡萄狀排列。囊泡因內(nèi)容物不同呈現(xiàn)出不同的透亮度。見圖1。

圖1 EPCs-EXOs鏡下形態(tài)(透射電鏡)

2.2 EPCs-EXOs標(biāo)志蛋白表達(dá)

與EPCs相比，EPCs-EXOs中CD63和CD81呈強(qiáng)陽性表達(dá)，相對表達(dá)量均顯著高于EPCs(P<0.01)，見圖2、表1。

圖2 EPCs和EPCs-EXOs標(biāo)志蛋白CD63、CD81表達(dá)(Western blot)

表1 EPCs及EPCs-EXOs CD63、CD81的相對表達(dá)量

注：與EPCs比較，1)P<0.01

2.3 EPCs-EXOs對低氧條件下HUVECs增殖的影響

0h時各組細(xì)胞增殖差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。24h時，與正常對照組比較，缺氧組細(xì)胞增殖率明顯降低(P<0.05)；缺氧+EPCs-EXOs組細(xì)胞增殖率較缺氧組明顯改善(t=5.96，P<0.01)，接近對照組水平(t=1.47，P>0.05)。48h時，各組間統(tǒng)計分析結(jié)果與24h相近(缺氧組vs正常對照組：t=5.51，P<0.05；缺氧+EPCs-EXOs組vs缺氧組：t=2.88，P<0.05；缺氧+EPCs-EXOs組 vs 正常對照組：t=0.45，P>0.05)，見表2。

表2 各組細(xì)胞相對增殖率

注：與正常對照組比較，1)P<0.05；與缺氧組比較，2)P<0.05，3)P<0.01

2.4 EPCs-EXOs減少低氧條件下HUVECs凋亡

0h時各組細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。24h時，與正常對照組比較，缺氧組HUVECs凋亡率明顯增加(t=7.74，P<0.01)；與缺氧組比較，缺氧+EPCs-EXOs組HUVECs凋亡率顯著下降(t=4.76，P<0.01)，但仍高于正常對照組(t=4.38，P<0.01)。48h時，各組間統(tǒng)計分析結(jié)果與24h相近(缺氧組vs正常對照組：t=16.12，P<0.01；缺氧+ EPCs-EXOs組 vs 缺氧組：t=14.12 ，P<0.01；缺氧+ EPCs-EXOs組 vs 正常對照組：t=5.83，P<0.01)。見表3及圖3。

表3 各組細(xì)胞凋亡率比較

注：與正常對照組比較，1)P<0.01；與缺氧組比較，2)P<0.01

圖3 各組HUVECs凋亡(流式細(xì)胞術(shù))

2.5 EPCs-EXOs改善低氧條件下HUVECs的遷移能力

24h時，與正常對照組比較，缺氧組HUVECs遷移率明顯降低(t=17.53，P<0.01)；與缺氧組比較，缺氧+EPCs-EXOs組HUVECs遷移率明顯改善(t=8.91，P<0.01)，且與正常對照組差異不顯著(t=0.55，P>0.05)。48h時，各組HUVECs爬片劃痕寬度進(jìn)一步減小，與正常對照組比較，缺氧組HUVECs遷移率明顯降低(t=7.35，P<0.01)；缺氧+EPCs-EXOs組HUVECs遷移率仍明顯高于缺氧組(t=7.84，P<0.01)，與正常對照組相比較無明顯差異(t=0.58，P>0.05)。見圖4及表4。

圖4 各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

表4 各組細(xì)胞遷移率比較

注：與正常對照組比較，1)P<0.01；與缺氧組比較，2)P<0.01

3 討 論

低氧可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷，體外缺氧環(huán)境中培養(yǎng)的HUVECs增殖、遷移能力下降，凋亡細(xì)胞比例隨著時間推移明顯上升。本研究顯示，在缺氧HUVECs中加入EPCs-EXOs，可以改善缺氧對HUVECs細(xì)胞增值和遷移能力的影響，并能抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。這些結(jié)果表明EPCs-EXOs可減輕內(nèi)皮細(xì)胞缺氧性損傷，具有一定的抗凋亡作用。

內(nèi)皮細(xì)胞缺氧可發(fā)生在多種病理生理狀態(tài)下，如冠狀動脈粥樣硬化引起的冠狀動脈供血不足，腦血管栓塞引起的腦血管缺血，睡眠呼吸暫停綜合征和慢性阻塞性肺部疾病引起的全身缺氧等，都對血管內(nèi)皮細(xì)胞直接或間接造成缺氧，引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。缺氧可以引起內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并誘發(fā)凋亡[6]。內(nèi)皮損傷是多種心腦血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并與心腦血管疾病形成惡性循環(huán)，隨著心腦血管疾病的進(jìn)展，內(nèi)皮損傷日趨加重，繼而進(jìn)一步促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)展，最終引起致死性疾病的發(fā)作。

基于干細(xì)胞的心腦血管疾病治療曾經(jīng)給研究者帶來曙光。EPCs是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，可以分化成為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，對血管新生和再生有直接作用，還可通過旁分泌的方式的促進(jìn)血管細(xì)胞增殖和遷移，從而刺激新生血管的形成。但應(yīng)用到臨床上因?yàn)槊庖吲女?、染色體差異和栓塞形成等問題，受到極大的局限[7]。研究發(fā)現(xiàn)，EPCs還可通過分泌細(xì)胞因子實(shí)現(xiàn)功能，這與EPCs改變靶細(xì)胞所處的微環(huán)境有關(guān)，近年的研究更是發(fā)現(xiàn)EPCs的旁分泌機(jī)制在血管新生和再生中更為重要[8]。EXOs作為一種重要的旁分泌方式，可以通過轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳物質(zhì)和蛋白分子到靶細(xì)胞，在細(xì)胞間信息傳輸方面起著關(guān)鍵作用。EPCs的免疫原性主要來自其大分子蛋白和多糖等成分，而EXOs的內(nèi)容物以小分子為主，且主要是不具有免疫原性的核酸分子，故EXOs雖具有來源細(xì)胞的相似功能特性，但不具有免疫、血管栓塞等方面的副作用，提示使用EXOs可能是一種比干細(xì)胞移植更安全的治療模式[9]。

本文提取了EPCs分泌的EXOs，并將其用來干預(yù)缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞。本文研究結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞缺氧處理24h后，其增殖和遷移能力下降，細(xì)胞凋亡水平增加。而在缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞中加入EPCs-EXOs時，缺氧的內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移能力有一定程度的恢復(fù)，其凋亡比例也出現(xiàn)下降，與正常組相比，其增殖、遷移能力相近。盡管外泌體處理后缺氧內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡比例稍高于正常對照組，但其凋亡仍得到了明顯的減輕。

綜上所述，在缺氧發(fā)生后，EPCs-EXOs可以改善內(nèi)皮細(xì)胞活性，減輕內(nèi)皮細(xì)胞的缺氧性損傷，具體的調(diào)節(jié)分子機(jī)制尚待進(jìn)一步研究闡明。

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