大刺鰍致病性維氏氣單胞菌分離鑒定及藥物敏感性研究

林 煜，樊海平，陳 斌，薛凌展，鐘全福，張 坤，吳 斌

（1福建省淡水水產(chǎn)研究所，福州350002；2福建天馬科技股份集團(tuán)有限公司，福州350308；3福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福州350002）

0 引言

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)普遍存在于淡水、污水、土壤乃至海水中，部分菌株是微生態(tài)環(huán)境中正常存在的[1]，而另一些菌株具有致病性，廣泛感染水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物 ，如中華絨螯蟹[2、3]、黃喉擬水龜[4]、黃顙魚(yú)[5、6]、中華鱉[7]、青海湖裸鯉[8]、鯽[9-12]、鱘[13、14]、南方鲇[15]、烏鱧[16]、胭脂魚(yú)[17]、齊口裂腹魚(yú)[18]、金魚(yú)[19]、鰻鱺[20]、羅非魚(yú)[21、22]、中國(guó)大鯢[23]和框鏡鯉[24]等諸多淡水養(yǎng)殖動(dòng)物，是水產(chǎn)養(yǎng)殖重要的致病菌之一。此外，維氏氣單胞菌對(duì)恒溫動(dòng)物是一種機(jī)會(huì)致病菌，但有人認(rèn)為免疫功能健全者也可被感染，患者發(fā)生急性腹瀉、菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等。近年來(lái)，日益增多的病例表明維氏氣單胞菌已成為一種重要的人、魚(yú)共患致病菌，并在食品安全上表現(xiàn)出重要意義，部分國(guó)家已經(jīng)將其規(guī)定為食品安全的檢疫對(duì)象[1、25]。

大刺鰍(Mastacembelus armatus)主要分布在中國(guó)長(zhǎng)江以南各水系。近年來(lái)，濫捕和環(huán)境污染加重等因素，造成大刺鰍野生資源銳減，部分省份已將其列入重點(diǎn)保護(hù)的野生動(dòng)物名錄[26-28]。福建省淡水水產(chǎn)研究所自2013年開(kāi)始，持續(xù)開(kāi)展人工繁育、苗種培育、病害防治、飼料營(yíng)養(yǎng)和養(yǎng)成等技術(shù)研究，突破了人工繁育、規(guī)?；绶N培育、精養(yǎng)池和土池養(yǎng)殖等關(guān)鍵技術(shù)[29-35]。在近年冬季溫棚養(yǎng)殖過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，為了維持水溫而減少換水量，易引起養(yǎng)殖水體氨氮和亞硝酸鹽升高，部分大刺鰍出現(xiàn)活力下降、游動(dòng)緩慢、食欲減退或喪失的癥狀；隨著病情進(jìn)一步發(fā)展，病魚(yú)體表局部皮膚特別是鰓蓋表面發(fā)炎后形成潰瘍，有時(shí)伴隨爛尾癥狀，解剖發(fā)現(xiàn)病鰍鰓絲潰爛，肝臟、腎臟和脾臟腫大并充血，部分病魚(yú)呈出血和腹水癥狀。此病從幼魚(yú)到成魚(yú)均發(fā)生，馴養(yǎng)的野生大刺鰍發(fā)病率高于人工繁育的子一代和子二代。由于發(fā)病后治愈期長(zhǎng)，且易反復(fù)發(fā)病，嚴(yán)重的單口池累計(jì)死亡量可達(dá)30%。為了明確病原，筆者開(kāi)展了病原的分離純化、致病性和致病菌株的藥物敏感性試驗(yàn)，以期為該病科學(xué)防控提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病大刺鰍（體長(zhǎng)8～22 cm，體質(zhì)量2～54 g）和回歸感染用健康大刺鰍（體長(zhǎng)18～22 cm，體質(zhì)量45～54 g），均采自順昌縣兆興魚(yú)種養(yǎng)殖有限公司。營(yíng)養(yǎng)瓊脂(Nutrient Agar)、腦心浸液培養(yǎng)基(Brain Heart Infusion Medium)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(Nutrient Broth)、水解酪蛋白瓊脂、革蘭氏染色液(Gram Stain Sets)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。藥敏紙片和細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司。TaqMix、DNA Marker DL2000 購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒、PCR 擴(kuò)增細(xì)菌 16S rDNA 試劑盒、TaqDNA 聚合酶均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司。

1.2 病原菌的分離純化與保存

取病魚(yú)體表局部皮膚和鰓蓋表面具有潰瘍癥狀的病魚(yú)，實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌操作分別取肝、腎組織于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板劃線(xiàn)分離細(xì)菌，28℃培養(yǎng)24 h后挑取形態(tài)大小、顏色等特征基本一致的優(yōu)勢(shì)菌落重復(fù)純化2 次，獲得純培養(yǎng)后，接種腦心浸出液培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)16 h，加入培養(yǎng)基體積25%無(wú)菌甘油混勻后，先放置于-20℃冰箱2 h，后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱備用。

1.3 回歸感染試驗(yàn)

取健康大刺鰍暫養(yǎng)于150 L玻璃缸中，連續(xù)曝氣，溫度控制在25～27℃，日投喂2次，正常排污投餌2次，每次30%，暫養(yǎng)7天穩(wěn)定后，試驗(yàn)前停食24 h后用于回歸感染試驗(yàn)。

將-80℃保存菌株接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24 h，無(wú)菌生理鹽水清洗制成菌懸液，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，采取無(wú)菌生理鹽水5 倍稀釋?zhuān)準(zhǔn)媳葷岱y(cè)量細(xì)菌懸液濃度至 4.70×1010、9.40×109、1.88×109、3.75×108、7.5×107cfu/mL。隨機(jī)撈取健康大刺鰍，共分6 組，每組7尾，背部肌肉注射，試驗(yàn)組每尾注射細(xì)菌懸液0.2 mL，對(duì)照組注射0.2 mL 無(wú)菌生理鹽水，暫養(yǎng)期間連續(xù)曝氣，不投餌，水溫26～28℃，每天換水1 次，每次換水30%。每日觀察記錄各組發(fā)病情況，及時(shí)撿除死亡大刺鰍，連續(xù)觀察14天，對(duì)瀕臨死亡、癥狀顯著的大刺鰍進(jìn)行細(xì)菌的再次分離、純化和保種。并進(jìn)行二次回歸感染、細(xì)菌分離、純化和保種。

1.4 菌株分類(lèi)與鑒定

1.4.1 形態(tài)特征觀察 將分離純化得到的菌株接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，28℃培養(yǎng)14～16 h，觀察菌落形態(tài)特征，挑取單菌落，革蘭氏染色，在Leica光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.4.2 生理生化特性測(cè)定 參照細(xì)菌微量生化反應(yīng)管說(shuō)明書(shū)及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[36]具體方法對(duì)純化的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。

1.4.3 16S rDNA鑒定 將保存菌株接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h后，取菌液經(jīng)12000 r/min離心10 min后收集菌體，DNA的提取參考天根細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。上游物序列5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物序列 5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR 反 應(yīng) 體 系50 μL，其中2×Premix Taq 25 μL(Takara)，上下游引物各2μL(10μmol/L)，DNA模板4μL，ddH2O 17μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min。PCR 反應(yīng)產(chǎn)物在120 V、1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳25 min后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果后送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測(cè)序，通過(guò)NCBI 中的nucleotide blast 進(jìn)行序列同源性分析，并采用ClustalX 1.8 軟件進(jìn)行序列比對(duì)，再通過(guò)MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 藥物敏感性試驗(yàn)

將首次分離保存菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，28℃培養(yǎng)24 h后，調(diào)整菌液濃度至108cfu/mL。取100μL 調(diào)整后的細(xì)菌懸液，均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂平板，適度干燥后用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，28℃培養(yǎng)24 h 后分別測(cè)量各種抗生素紙片抑菌圈的直徑，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)判別結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化與培養(yǎng)

從自然發(fā)病、一次回歸感染和二次回歸感染病魚(yú)中共分離純化到3 株細(xì)菌，分別命名為MaG170114NA、MaG170808NA、MaG170827NA。

2.2 回歸感染

2次回歸感染發(fā)病魚(yú)主要癥狀表現(xiàn)基本一致。24 h，注射針孔周?chē)慕M織微凸起且皮膚顏色發(fā)白，死亡的大刺鰍肝臟腫大、顏色暗紅；48 h，針孔周?chē)つw有出血現(xiàn)象，死亡大刺鰍肝臟腫大、顏色變淺呈粉色；3 天后，針孔處皮膚開(kāi)始潰爛，形成開(kāi)放性創(chuàng)口，死亡大刺鰍肝臟顏色呈土黃色，失血。個(gè)別死亡魚(yú)解剖腹腔積水。

人工歸回感染試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株MaG170114NA 的一次回歸濃度達(dá)1.88×109cfu/mL 3天產(chǎn)生死亡，濃度達(dá)9.4×109cfu/mL 1天產(chǎn)生死亡、3天死亡率100%。一次回歸感染分離菌株MaG170808NA的二次回歸感染濃度達(dá)1.85×108cfu/mL，24 h 產(chǎn)生死亡；濃度達(dá)9.24×108cfu/mL，24 h死亡率達(dá)100%，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表1～2。

表1 分離菌株MaG170114NA的一次回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3 病原菌的分類(lèi)與鑒定

2.3.1 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)特征 分離菌株在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)較快，菌落呈乳白色圓形，呈中央突起，表面光滑濕潤(rùn)，直徑為2～3 mm，表面光滑，顏色灰白色。菌體革蘭氏染色陰性，兩端鈍圓，短桿狀，菌體大小(0.5～0.6)μm×(0.8～1.0)μm，無(wú)芽胞。

表2 一次回歸感染分離菌MaG170808NA的二次回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

2.3.2 生理生化特性 分離菌株具有運(yùn)動(dòng)性，能在1%NaCl生長(zhǎng)，不能在6%NaCl中生長(zhǎng)，氧化酶、V-P反應(yīng)、甲基紅、吲哚試驗(yàn)、賴(lài)氨酸脫羧酶、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、苯丙氨酸脫氨酶陽(yáng)性，精氨酸雙水解、硫化氫產(chǎn)生、尿素水解、丙二酸鹽利用陰性，可利用葡萄糖、麥芽糖、甘露糖、海藻糖等，不發(fā)酵棉子糖、鼠李糖、阿拉伯糖等，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表3。參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，分離菌株的主要生化特征與維氏氣單胞菌特性基本一致，初步鑒定分離菌株為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)。

2.3.3 16S rDNA 序列分析 PCR 擴(kuò)增MaG170114NA菌株的16S rDNA 基因，獲得約為1500 bp左右的預(yù)期片段。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序及Blastn 在線(xiàn)比對(duì)分析，結(jié)果表明菌株MaG170114NA的16S rDNA與NCBI數(shù)據(jù) 庫(kù) 的Aeromonas veroniiB33（GeneBank 登 錄 號(hào)KU188295）和Aeromonas veroniiCT17（GeneBank 登錄號(hào)KM362731）的16S rDNA 基因序列同源性為100%。從構(gòu)建的致病性菌株MaG170114NA 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）可知，該致病性菌株與維氏氣單胞菌歸屬在同一分支中，即與維氏氣單胞菌親緣關(guān)系較近，可將其鑒定為維氏氣單胞菌。

2.4 藥物敏感性

菌株MaG170114NA對(duì)所測(cè)試的24種抗菌藥物中的氨基糖苷類(lèi)，β-內(nèi)酰胺類(lèi)中的頭孢噻肟、頭孢他啶以及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物中的紅霉素高度敏感；對(duì)喹諾酮類(lèi)的氧氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星及磺胺類(lèi)的復(fù)方新諾明中度敏感；對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)的青霉素類(lèi)藥物，喹諾酮類(lèi)的諾氟沙星和恩諾沙星，大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的羅紅霉素，四環(huán)素類(lèi)的四環(huán)素、多西環(huán)素，氯霉素類(lèi)的氟苯尼考，糖肽類(lèi)的萬(wàn)古霉素，多粘菌素類(lèi)的多粘菌素B等12種藥物耐藥，詳細(xì)結(jié)果見(jiàn)表5。

表3 分離菌株部分生理生化特征

3 結(jié)論

本研究對(duì)在人工養(yǎng)殖環(huán)境下發(fā)生的，主要癥狀表現(xiàn)為腹腔積液、腸道發(fā)炎、肛門(mén)紅腫、體表潰爛、爛尾、爛鰓等癥狀的大刺鰍進(jìn)行了跟蹤調(diào)查。對(duì)具典型癥狀的病魚(yú)的肝、腎等組織分離純化得到優(yōu)勢(shì)菌株MaG170114NA。人工回歸感染證實(shí)原始分離菌株MaG170114NA 為該患病大刺鰍致病菌。對(duì)菌株MaG170114NA進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性測(cè)定，并結(jié)合16S rDNA 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，鑒定MaG170114NA 菌株為維氏氣單胞菌。采用藥敏紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株MaG170114NA 的藥物敏感性，該菌株對(duì)頭孢他啶、慶大霉素、紅霉素等8 種藥物高度敏感；對(duì)氧氟沙星、環(huán)丙沙星、依諾沙星及復(fù)方新諾明4種藥物中度敏感；對(duì)氟苯尼考、恩諾沙星多粘菌素B等12種表現(xiàn)耐藥。

圖4 MaG170114Na菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表5 分離菌株MaG170114NA藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

維氏氣單胞菌是一種人、獸、魚(yú)共患病原菌，廣泛存在于水體及土壤之中，是動(dòng)物腸道和自然生態(tài)系統(tǒng)的正常菌群之一[1]。作為條件致病菌，有些菌株具有很強(qiáng)的毒力，對(duì)水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物具有很強(qiáng)的致病性，可引起黑魚(yú)、錦鯉、框鏡鯉、西伯利亞鱘、異育銀鯽、草魚(yú)、鰻鱺、黃顙魚(yú)、斑點(diǎn)叉尾鲴、胭脂魚(yú)、中華鱉、中華絨螯蟹等大多水產(chǎn)動(dòng)物大量發(fā)病死亡[37-40]，但維氏氣單胞菌引起養(yǎng)殖大刺鰍發(fā)病并產(chǎn)生死亡為首次報(bào)道。

維氏氣單胞菌感染水生動(dòng)物后的主要癥狀以鰭基出血、腹腔積液、肛門(mén)紅腫外凸等為主要特征[2-25]，如中華鱘感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基具出血點(diǎn)，鰓絲暗紅，腹部膨脹、泄殖孔腫脹，腹腔積血色液體，腸道充血[13]；齊口裂腹魚(yú)感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基充血，頭部鰓蓋等充血，肛門(mén)紅腫，腹腔積水，腸道發(fā)炎[18]；中國(guó)大鯢體表粘液脫落，皮膚出現(xiàn)白斑，四肢潰爛，露出紅色肌肉，胃、腸道內(nèi)壁有出血點(diǎn)[23]；胭脂魚(yú)感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為眼球充血，腹部有明顯出血點(diǎn)，體表少量鱗片脫落，肛門(mén)紅腫，并有大量黏液流出[17]；烏鱧感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為體表有大量出血點(diǎn)，鰭條充血，肛門(mén)紅腫，腸道充血[16]；暗紋東方鲀感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭基部充血、肛門(mén)紅腫、腹部膨脹、腹腔內(nèi)積血色液體[14]；美國(guó)鰣魚(yú)感染維氏氣單胞菌的主要癥狀為鰭條充血、鰓部顏色鮮紅、肛門(mén)紅腫、腹腔有血水、腸道內(nèi)無(wú)食物充滿(mǎn)黏液[41]。與本研究結(jié)果對(duì)比顯示，維氏氣單胞菌感染大刺鰍主要癥狀與大多水生動(dòng)物癥狀相似，主要表現(xiàn)為腹腔積液、腸道發(fā)炎、肛門(mén)紅腫，肝臟、腎臟和脾臟腫大并充血，但大刺鰍還同時(shí)表現(xiàn)體表局部發(fā)炎后形成潰爛病灶的典型癥狀，有時(shí)伴隨爛尾、爛鰓癥狀，這可能是大刺鰍具有群體棲息習(xí)性，體背部棘相互刺傷，導(dǎo)致維氏氣單胞菌病原菌在傷口處大量繁殖，最終表現(xiàn)出體表潰爛癥狀及爛尾癥狀。這與筆者在回歸試驗(yàn)中，試驗(yàn)魚(yú)注射部位表現(xiàn)出來(lái)的潰爛等癥相似。

不同地域、不同季節(jié)、不同宿主甚至同一養(yǎng)殖場(chǎng)隨不同養(yǎng)殖季節(jié)分離菌株的藥物敏感性存在差異。本試驗(yàn)對(duì)分離菌株的藥敏結(jié)果顯示，對(duì)頭孢噻肟、頭孢他啶、慶大霉素、妥布霉素、鏈霉素、卡那霉素、紅霉素等敏感，而對(duì)羅紅霉素、四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、諾氟沙星具有較強(qiáng)的耐藥性。這與之前報(bào)道的中華絨螯蟹、黃顙魚(yú)、鰻鱺、胭脂魚(yú)、中華鱉等水產(chǎn)動(dòng)物分離的維氏氣單胞菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果有差異。耿昕穎等對(duì)52株不同淡水魚(yú)類(lèi)維氏氣單胞菌耐藥表型的分析認(rèn)為，52株維氏氣單胞菌存在比較嚴(yán)重的耐藥性，且不同地域分離的維氏氣單胞菌菌株對(duì)常用的抗菌藥物的MIC結(jié)果存在明顯差異[42]；汪開(kāi)毓等[43]的研究認(rèn)為，不同地區(qū)分離的維氏氣單胞菌具有地域性差異，而同一地區(qū)分離株既存在相同基因型現(xiàn)象，也存在基因型多樣性現(xiàn)象。本研究根據(jù)藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果，選擇合適的藥物在大刺鰍維氏氣單胞菌病暴發(fā)期進(jìn)行了臨床治療，取得了良好治療效果。因此，不同地域、宿主、季節(jié)細(xì)菌性疾病的防治，應(yīng)對(duì)病原進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，選擇敏感藥物，精準(zhǔn)、科學(xué)用藥，及時(shí)控制病情。

本研究對(duì)大刺鰍維氏氣單胞菌病的治療過(guò)程發(fā)現(xiàn)該病具有治愈期長(zhǎng)且易反復(fù)發(fā)病的特點(diǎn)。這與維氏氣單胞菌作為條件致病菌，廣泛存在于水體及土壤之中[1]的特點(diǎn)相關(guān)。因此對(duì)該病應(yīng)以預(yù)防為主：保持養(yǎng)殖水體的清潔，避免維氏氣單胞菌病大量繁殖；做好大刺鰍的健康養(yǎng)殖，避免過(guò)密養(yǎng)殖造成體背部棘相互刺傷而感染病源菌等因素的發(fā)生。這樣才可以盡量避免該病的發(fā)生。