內(nèi)皮祖細(xì)胞CXC趨化因子受體7對(duì)腦缺血再灌注后血管新生的作用

范加維，楊拯，王近吳，范道貴，蔣仕秋，曾江華，易紅梅，戴小珍，劉海榮

1.成都醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川成都市 610500；2.成都醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川成都市 610500；3.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，四川成都市 610500；4.遂寧市第一人民醫(yī)院，四川遂寧市629000

腦卒中是全球?qū)е滤劳龊蜌埣驳拇笱芗膊≈?。缺血性腦卒中是最常見(jiàn)的腦卒中類型[1]。干細(xì)胞治療已成為治療缺血性損傷的主要策略之一[2]。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一種形成新生血管的前體細(xì)胞，能定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞[3-4]。組織缺血或內(nèi)皮損傷后，EPCs 從骨髓動(dòng)員到外周循環(huán)[5-6]，歸巢到血管損傷部位，促進(jìn)新血管形成和內(nèi)皮損傷修復(fù)[7]。外周血中EPCs數(shù)量是內(nèi)皮功能和心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志之一[8-9]，在高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病患者和吸煙者的外周血中，EPCs 數(shù)量明顯減少[9]。心血管疾病患者常伴隨高脂、高糖血癥[10-11]，導(dǎo)致外周血EPCs 數(shù)量明顯減少。外源性EPCs 移植是治療心腦缺血損傷的重要策略之一。EPCs 移植能縮小腦梗死體積，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善神經(jīng)功能[12-13]。EPCs 移植也存在許多問(wèn)題，如移植后EPCs靶向歸巢到缺血組織的能力較差，存活能力低，導(dǎo)致EPCs利用率低，限制了EPCs的臨床應(yīng)用。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)也稱CXCL12，是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)的趨化因子[14]。CXCL12 與其受體趨化因子受體(CXCchemokine receptor,CXCR)4、CXCR7相互作用，在腦缺血損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用[15-17]。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，CXCL12 基因治療可顯著改善腦缺血所致白質(zhì)損傷，促進(jìn)少突膠質(zhì)祖細(xì)胞向小鼠腦缺血部位遷移，并發(fā)現(xiàn)CXCL12/CXCR4的作用主要是促進(jìn)少突膠質(zhì)祖細(xì)胞的增殖和遷移，而CXCL12/CXCR7 的主要作用是促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[7,18]，EPCs同時(shí)表達(dá)CXCR4 和CXCR7 兩種受體，兩種受體的作用不盡相同。糖尿病小鼠骨髓來(lái)源的EPCs 中，CXCR7 表達(dá)明顯下調(diào)；上調(diào)CXCR7 表達(dá)能明顯改善糖尿病下肢缺血[7]。

難以獲得大量自體EPCs 是EPCs 治療缺血性疾病臨床應(yīng)用面臨的主要困難之一。人臍帶血和臍帶組織可成為EPCs 來(lái)源[19-20]；臍帶血和臍帶來(lái)源的EPCs 免疫源性較低，異種移植也不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)，能有效改善缺血組織的血管新生[19,21]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，CXCR7 在臍帶血來(lái)源EPCs 的存活中扮演重要角色，抑制CXCR7 活性將顯著增加EPCs 凋亡。本研究探討上調(diào)CXCR7 表達(dá)對(duì)臍帶血來(lái)源EPCs 的存活和血管新生的影響，為臍帶血EPCs 治療缺血性疾病提供更好策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器和設(shè)備

細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(jī)、冰凍切片機(jī)：美國(guó)THERMO 公司。流式細(xì)胞儀：美國(guó)BD 公司。酶標(biāo)儀：美國(guó)BIOTEK 公司?；瘜W(xué)發(fā)光儀、梯度PCR 儀、實(shí)時(shí)定量PCR (real time-PCR,RT-PCR)儀：美國(guó)BIORAD 公司。倒置熒光顯微鏡：日本NIKON 公司。正置熒光顯微鏡：德國(guó)LEIKA公司。低速多管自動(dòng)平衡離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器公司。

1.1.2 主要試劑

人淋巴細(xì)胞分離液Histopaque 1077、人纖維連接蛋白、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)、SDF-1、FITC-UEA-1：日本SIGMA 公司。EBM-2：美國(guó)LONZA 公司。胎牛血清、胰酶：美國(guó)GIBCO公司。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、CD133、CD31抗體：美國(guó)CELL SIGNALING TECHNOLOGY 公司。CXCR7：美國(guó)ABCAM 公司。Dil-標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍?Dil-Ac-LDL)：美國(guó)BIOMEDICAL TECHNOLOGIES 公司。化學(xué)發(fā)光底物：美國(guó)MILLIPORE 公 司。iScript cDNA Synthesis Kit、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix：美國(guó)BIO-RAD 公司?；|(zhì)膠：美國(guó)BD 公司。兔抗Actin、山羊抗兔IgG：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Cy3標(biāo)記山羊抗兔IgG(H+L)、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)、DAPI、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？俁NA 提取試劑盒、高效RIPA 組織細(xì)胞快速裂解液：北京索萊寶科技有限公司。Annexin v-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒：江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。pLVX-EGFP-3FLAG-Puro載體：上海升博生物技術(shù)有限公司。CXCR7、GAPDH 引物：上海生工生物有限公司。水合氯醛：成都市科龍化工試劑廠。氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride,TTC)：斯百全化學(xué)上海有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EPCs的分離和培養(yǎng)

采取人臍帶血20 ml，PBS 等體積稀釋；貼壁緩慢加入盛有等體積Histopaque 1077 的上層，室溫2000 r/min 離心20 min 后，管內(nèi)液體分為4 層；取中間白膜層細(xì)胞，PBS 重懸洗滌2 次，1200 r/min 離心10 min。用添加含多種生長(zhǎng)因子的SingleQuots 并加入含10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基EGM-2MV 重懸，將細(xì)胞接種于預(yù)先用人纖維連接蛋白包被的6 孔板中，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。待細(xì)胞長(zhǎng)到80%～90%融合，傳代培養(yǎng)[7,22]。

1.2.2 EPCs的鑒定

1.2.2.1 Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結(jié)合實(shí)驗(yàn)

取培養(yǎng)14 d 的細(xì)胞，吸棄細(xì)胞板內(nèi)培養(yǎng)液，PBS輕輕洗滌3 次，去除未貼壁細(xì)胞。每孔加入10 μg/ml Dil-ac-LDL 200 μl，37 ℃、5%CO2、飽和濕度恒溫孵育4 h；吸棄細(xì)胞板中液體，用PBS輕輕洗滌3次，每次5 min；預(yù)冷的4%多聚甲醛固定10 min；棄固定液，PBS 洗2 次，每次5 min；加入10 μg/ml FITCUEA-1 200 μl，孵育1 h 后，棄液體；PBS 輕輕洗滌3次，每次5 min；50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下拍照觀察[7]。

1.2.2.2 表面標(biāo)志物

取培養(yǎng)14 d 細(xì)胞，PBS 洗滌，胰酶消化，離心，收集細(xì)胞；棄上清，細(xì)胞計(jì)數(shù)，5×104/孔接種至24 孔板。細(xì)胞貼壁穩(wěn)定生長(zhǎng)后，PBS洗滌2次，PBS 500 μl中分別加入VEGFR2 和CD133單克隆抗體10 μl，混勻后加入24 孔板中，37 ℃孵育60 min；PBS 洗滌3 次。PBS 500 μl 中分別加入Cy3 和Alexa Fluor 488 熒光二抗5 μl，37 ℃孵育60 min；PBS 洗滌3 次，DAPI 復(fù)染；PBS 洗滌3 次，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下拍照觀察。

1.2.3 慢病毒載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)染

利用基因重組技術(shù)，將人源CXCR7 基因克隆到pLVX-EGFP-3FLAG-Puro 載體，構(gòu)建CXCR7 過(guò)表達(dá)載體(pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro)；采用慢病毒包裝體系，將三質(zhì)粒系統(tǒng)(pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro 1.5 μg、pCMV-dR8.9 0.5 μg、pCMVVSV-G 1 μg)共轉(zhuǎn)染至293T 細(xì)胞中，包裝成慢病毒顆粒。轉(zhuǎn)染36～48 h 后，收集培養(yǎng)液上清，超速離心法濃縮和純化，檢測(cè)病毒滴度。

取第4 代EPCs，5×104/孔接種到24 孔板，次日用于病毒感染。細(xì)胞分為正常C 組(不感染病毒)、對(duì)照C 組(感染pLVX-EGFP-3FLAG-Puro 病毒)和感染C 組(感染pLVX-CXCR7-EGFP-3FLAG-Puro 病毒)。按照MOI=50 加入相應(yīng)病毒顆粒孵育24 h，更換新鮮培養(yǎng)基。感染72 h后，倒置熒光顯微鏡觀察GFP表達(dá)，將感染率70%以上的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CXCR7在EPCs中的表達(dá)

1.2.4.1 RT-PCR

轉(zhuǎn)染72 h 后，收集正常C 組、對(duì)照C 組和感染C組EPCs各1×106個(gè)，按說(shuō)明書(shū)提取總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模版，RT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中CXCR7 mRNA 表達(dá)水平(以GAPDH 為內(nèi)參)，目的基因表達(dá)水平用2-ΔΔCt表示。

CXCR7 上游引物序列5'-CGC CTC AGA ACG ATG GAT C-3'，下游引物序列5'-AAC AAG TAA ACC CGT CCC AGA-3'。GAPDH 上游引物序列5'-CAG GAG GCA TTG CTG ATG AT-3'，下游引物序列5'-GAA GGC TGG GGC TCA TTT-3'。

1.2.4.2 Western blotting

轉(zhuǎn)染72 h后，各組加裂解液抽提蛋白，BCA法蛋白定量。每個(gè)樣品取蛋白20 μg，轉(zhuǎn)膜、封閉，加CXCR7一抗(1∶200)4 ℃孵育過(guò)夜；洗膜，加二抗(1∶1000)，37 ℃孵育60 min；洗膜，ECL 試劑盒曝光顯色，Image J 軟件分析各條帶灰度值，以β-actin 為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)灰度。

1.2.5 基質(zhì)膠成管試驗(yàn)

將基質(zhì)膠用不含生長(zhǎng)因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基1∶1 稀釋，100 μl/孔包被48 孔板。4×104/孔分別接種對(duì)照C組和感染C 組EPC，每種細(xì)胞各分3 組：空白組不添加其他試劑，ox-LDL 組加ox-LDL 50 μg/ml，處理組加ox-LDL 50 μg/ml 和SDF-1 50 μg/ml。37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)6 h，顯微鏡下觀察管樣結(jié)構(gòu)形成并拍照。Image J軟件計(jì)算管樣結(jié)構(gòu)長(zhǎng)度[7]。

1.2.6 Annexin v-FITC/PI染色

對(duì)照C 組和感染C 組EPCs 分別接種于6 孔板中，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，同前法分為3 組。24 h 后，PBS 洗去未貼壁細(xì)胞，不含EDTA 0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。根據(jù)Annexin v-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV+/PI-細(xì)胞(早期凋亡細(xì)胞)[7]。

1.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備

成年Sprague-Dawley 大鼠36 只，體質(zhì)量(220±20)g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院/四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，許可證號(hào)SCXK(川)2013-15。Longa 線栓法制備大鼠右側(cè)腦缺血再灌注損傷模型[23]。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24 h 后，采用Longa 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分，無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2 分，向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，損傷側(cè)出現(xiàn)Horner綜合征；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，喪失意識(shí)；5 分，死亡。0、4、5 分的大鼠舍棄，并補(bǔ)充大鼠[23-24]。于再灌注后7 d和14 d再次評(píng)分。

1.5 細(xì)胞移植

再灌注24 h 后，造模成功的大鼠等分為PBS 組(n=12)、對(duì)照組(n=12)和移植組(n=12)。對(duì)照C 組和感染C 組EPCs 重懸于PBS 溶液中，對(duì)照組和移植組大鼠尾靜脈輸注對(duì)照C 組和感染C 組EPCs 2×106個(gè)，體積1 ml，PBS組輸注等體積PBS。

1.6 腦梗死體積檢測(cè)

再灌注后14 d，各組取6 只大鼠麻醉，迅速取出腦組織，-20 ℃速凍，均勻切開(kāi)，2%TTC 37 ℃染色20 min，Image J計(jì)算梗死體積[24]。

1.7 GFP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)

其余6 只大鼠取腦組織包埋于OCT 中，制作冰凍切片。各組取一套切片正置熒光顯微鏡下拍照觀察，計(jì)算GFP陽(yáng)性EPCs數(shù)。

1.8 免疫熒光染色

各組另取一套冰凍切片，PBS浸洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS 浸洗，山羊血清室溫封閉30 min；加CD31一抗(1∶200) 4 ℃孵育過(guò)夜；PBS 浸洗，加熒光標(biāo)記二抗(1∶500) 37 ℃孵育1 h；PBS 浸洗，含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)區(qū)域中毛細(xì)血管數(shù)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Origin 7.5 完成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析和作圖。結(jié)果以()表示，各組間比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 EPCs的分離培養(yǎng)及鑒定

細(xì)胞培養(yǎng)3 d，出現(xiàn)典型的克隆集落樣結(jié)構(gòu)；7 d時(shí)集落樣結(jié)構(gòu)逐漸消失，大部分細(xì)胞鋪展，呈“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)(圖1)。

細(xì)胞培養(yǎng)14 d 時(shí)，與Dil-ac-LDL、FITC-UEA-1孵育，在熒光顯微鏡下觀察可見(jiàn)紅色和綠色熒光(圖2)，并表達(dá)EPCs 表面標(biāo)志物VEGFR2 和CD133(圖3)。既能攝取Dil-ac-LDL 又能結(jié)合FITC-UEA-1 的棕黃色雙熒光細(xì)胞，VEGFR2和CD133雙陽(yáng)性細(xì)胞定義為分化期EPCs。

2.2 EPCs中CXCR7的表達(dá)

轉(zhuǎn)染72 h 后，感染C 組見(jiàn)大量GFP 陽(yáng)性細(xì)胞(圖4)，感染率達(dá)70%以上；GFP 蛋白主要分布在細(xì)胞膜周邊。

Western-blotting 和RT-PCR 均顯示，感染C 組CXCR7 蛋白和mRNA 表達(dá)量明顯高于正常C 組和對(duì)照C組(P＜0.01)，后兩組間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1、表2。

圖1 不同時(shí)間EPCs形態(tài)變化(倒置顯微鏡，×100)

圖2 Dil-ac-LDL攝取和FITC-UEA-1結(jié)合實(shí)驗(yàn)(×200)

圖3 細(xì)胞表面標(biāo)志物VEGFR2和CD133(免疫熒光染色，×400)

圖4 對(duì)照C組和感染C組CXCR7表達(dá)(倒置熒光顯微鏡，×100)

表1 各組CXCR7蛋白表達(dá)(/β-actin)

表2 各組CXCR7 mRNA的表達(dá)(2-ΔΔCt)

2.3 基質(zhì)膠成管試驗(yàn)和Annexin v-FITC/PI染色

與各自空白組相比，各組ox-LDL 組管樣結(jié)構(gòu)相對(duì)長(zhǎng)度均明顯下降(P＜0.01)；感染-處理組管樣結(jié)構(gòu)相對(duì)長(zhǎng)度較對(duì)照-處理組顯著延長(zhǎng)(P＜0.001)。見(jiàn)圖5、表3。

與各自空白組相比，各組ox-LDL 組EPCs 凋亡率明顯增加(P＜0.01)；感染組顯著低于對(duì)照組(P＜0.001)。見(jiàn)圖6、表4。

2.4 腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)和微血管新生

再灌注后7 d，移植組大鼠Longa評(píng)分低于對(duì)照組和PBS 組(P＜0.05)；再灌注后14 d，對(duì)照組Longa 評(píng)分低于PBS 組(P＜0.05)，移植組低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)表5。

再灌注后14 d，對(duì)照組腦梗死體積低于PBS 組(P＜0.05)，移植組低于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)圖7、表6。

移植組GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于對(duì)照組(P＜0.05)，毛細(xì)血管數(shù)高于對(duì)照組(P＜0.05)。見(jiàn)圖8、圖9、表7。

3 討論

本研究顯示，EPCs 轉(zhuǎn)染CXCR7 后，可顯著增強(qiáng)EPCs 在ox-LDL 作用下管樣結(jié)構(gòu)形成能力和抗凋亡能力；移植轉(zhuǎn)染CXCR7的EPCs，可促進(jìn)EPCs歸巢至缺血部位，并促進(jìn)缺血組織微血管新生。這在一定程度上解決了移植后EPCs 靶向歸巢能力差、存活能力低和利用率低的難題，為干細(xì)胞治療缺血性疾病提供了新的方法。

EPCs 是一種新生血管形成的前體細(xì)胞，能定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞，主要存在于骨髓、外周血和臍帶血中，EPCs 介導(dǎo)的血管新生是治療缺血性疾病的重要策略之一[22,25-27]。由于外周血中EPCs 含量較低，骨髓采集量少，臍帶血成為獲取EPCs 的主要來(lái)源。前期研究發(fā)現(xiàn)[22]，移植人臍帶血來(lái)源的單核細(xì)胞到大鼠心肌組織，未出現(xiàn)移植排斥反應(yīng)。本研究移植人臍帶血來(lái)源的EPCs至大鼠體內(nèi)，也未出現(xiàn)移植排斥反應(yīng)。

腦中卒患者常伴有高血脂血癥，導(dǎo)致外源性EPCs 存活能力較低，歸巢到缺血部位能力差。SDF-1通過(guò)與其受體CXCR4 和CXCR7 結(jié)合，在EPCs 的存活、動(dòng)員和歸巢中發(fā)揮重要作用；在應(yīng)激狀態(tài)下，CXCR7 起主導(dǎo)作用[7]。本研究采用ox-LDL 模擬體內(nèi)高脂血癥環(huán)境，發(fā)現(xiàn)上調(diào)EPCs 中CXCR7 表達(dá)能抑制ox-LDL 對(duì)EPCs 的損傷，與我們前期研究結(jié)果一致[7]。本研究還顯示，移植轉(zhuǎn)染CXCR7 的EPC 能改善大鼠神經(jīng)功能，增加缺血部位EPCs數(shù)量和毛細(xì)血管密度。

Qiu 等[28]發(fā)現(xiàn)，骨髓源性EPCs 移植可以減輕腦缺血再灌注損傷，與EPCs 的抗氧化和抗凋亡能力有關(guān)。Bai 等[29]發(fā)現(xiàn)，EPCs 治療可增加缺血腦組織中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，從而改善神經(jīng)功能。本研究進(jìn)一步證實(shí)，移植EPCs 能改善大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能，移植轉(zhuǎn)染CXCR7的EPCs效果更顯著。

圖5 各組管樣結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果(×100)

圖6 細(xì)胞凋亡流式分析結(jié)果

圖7 各組腦梗死灶體積(TTC染色)

表3 各組細(xì)胞管樣結(jié)構(gòu)的相對(duì)長(zhǎng)度(/空白組)

表4 各組細(xì)胞凋亡率比較(%)

表5 各組Longa評(píng)分的比較

表6 各組腦梗死體積比較(%)

圖8 各組GFP陽(yáng)性細(xì)胞分布(正置熒光顯微鏡，×100)

圖9 各組毛細(xì)血管分布(免疫熒光染色，×100)

表7 各組GFP陽(yáng)性和毛細(xì)血管數(shù)比較

綜上所述，上調(diào)SDF-1/CXCR7 信號(hào)軸明顯改善EPCs 在高脂環(huán)境下的存活能力，還能有效促進(jìn)其靶向歸巢至缺血組織并促進(jìn)血管新生，為EPCs 移植治療缺血性疾病的臨床應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。