姜黃素對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞B 類1 型清道夫受體表達(dá)的影響

肖韓艷 周 雯 李 巖 李廣濤 程連芝 程謨國 辛彩霞

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)二科，牡丹江 157000

臨床上，沒有能有效控制動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的藥物，因此控制AS 的可能作用位點(diǎn)及藥物的是目前研究熱點(diǎn)[1]。B 類1 型清道夫受體（scavenger receptor class B type 1，SR-B1）在脂質(zhì)外轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用，成為目前研究熱點(diǎn)[2]。體內(nèi)的SR-B1 功能影響高密度脂蛋白膽固醇代謝過程，研究SR-B1 介導(dǎo)的THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞的脂質(zhì)外運(yùn)機(jī)制，對(duì)防治AS 有重要的臨床意義。中藥具有多位點(diǎn)作用的特點(diǎn)，研究發(fā)現(xiàn)姜黃素在抗AS 中有較好的療效[3]，本實(shí)驗(yàn)研究了姜黃素對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞中SR-B1 的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 材料

THP-1 人單核細(xì)胞復(fù)蘇后，于含160 nmol/L PMA 無血清的RMMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，使THP-1 單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞后，加入80 μg/ml 人源氧化低密度脂蛋白（Ox-LDL），孵育48 h 分化為巨噬泡沫細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)組加入40 mg/L 姜黃素共培養(yǎng)者為實(shí)驗(yàn)組，設(shè)立空白為對(duì)照組。

1.2 紅油O 染色法評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積的影響：

接種于6 孔板細(xì)胞貼壁生長后，清洗換PMA 無血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基4 h，清洗后4% 多聚甲醛固定 30 min，油紅0 染色液染色20 min，蘇木精復(fù)染10 s，沖洗5 min，顯微鏡下觀察并照相。細(xì)胞漿內(nèi)脂滴為紅染，比較兩組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)染色情況。

1.3 熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)法測(cè)定THP-1 源性巨噬細(xì)胞膽固醇外流率

以每孔2×106密度將細(xì)胞接種于12 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)48 h，按上訴方法分組，加入熒光NBD 膽固醇孵育液，孵育4 h，洗滌后加入HDL 誘導(dǎo)外流液（RPMI1640培養(yǎng)基+0.2%BSA+HDL 50 μg/ml）孵育細(xì)胞4 h，孵育結(jié)束后收集誘導(dǎo)外流液，使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度。熒光強(qiáng)度（Fluorescence intensity，F(xiàn)I）測(cè)定，使用黑色酶標(biāo)板在熒光酶標(biāo)儀下檢測(cè)外流液及細(xì)胞裂解液中的熒光信號(hào)強(qiáng)度。細(xì)胞NBD 膽固醇外流率= 誘導(dǎo)外流液FI/（誘導(dǎo)外流液FI+ 細(xì)胞裂解液FI）

1.4 免疫印跡法（Western blot）

取兩組細(xì)胞，提取總蛋白，電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉孵育后加一抗，漂洗后加二抗，轉(zhuǎn)膜后顯影。使用 Labworks 分析系統(tǒng)計(jì)算各蛋白條平均光度、進(jìn)行相對(duì)定量分析。檢測(cè)，姜黃素對(duì)THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞表面SR-B1 表達(dá)的影響。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組脂質(zhì)沉積和膽固醇外流率比較

油紅O 染色顯示，實(shí)驗(yàn)組（圖1A）較對(duì)照組（圖1B），對(duì)照組（圖1B）可見更多的脂質(zhì)沉積。實(shí)驗(yàn)組膽固醇外流率為（29.0±1.9）% 高于對(duì)照組（22±2.2）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 紅油O 染色檢測(cè)兩組細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積（×200）

2.2 兩組SR-B1 表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組THP-1 源性巨噬泡沫細(xì)胞相比SR-B1 表達(dá)上調(diào)。

圖2 Western blot 檢測(cè)兩組SR-B1 表達(dá)

3 討論

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的最新統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)AS 相關(guān)的疾病已經(jīng)成為人類疾病負(fù)擔(dān)的首位[1-3]。研究結(jié)果表明低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein，LDL）是AS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，LDL 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)通過其氧化形式發(fā)揮作用，Ox-LDL 會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過吞噬脂質(zhì)，在血管內(nèi)皮下沉積并形成大量的死亡泡沫細(xì)胞，大量的死亡泡沫細(xì)胞能促進(jìn)AS 壞死核心的形成[1-2]。

逆膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)（reverse cholesterol transport, RCT）是機(jī)體排出膽固醇，進(jìn)而抗AS 重要機(jī)制[3]，巨噬細(xì)胞膽固醇外流是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)過程的起始及限速步驟，也是目前研究的熱點(diǎn)[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)SR-B1 是膽固醇外流的重要受體，其可能通過多個(gè)途徑起抗AS 作用。Zhang 等[4]追蹤觀察并標(biāo)記膽固醇在體內(nèi)的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，發(fā)現(xiàn)肝臟中SR-B1 的表達(dá)對(duì)RCT 有正性調(diào)節(jié)作用。Segatto M 等[5]研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞基底膜通過SR-B1 受體介導(dǎo)攝取血液中HDL 分泌膽汁，促進(jìn)膽固醇的排泄。DO 等[6]發(fā)現(xiàn)SR-B1 在顯著抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，促進(jìn)內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)，糾正內(nèi)皮型一氧化氮合酶/ 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶表達(dá)失衡，進(jìn)而減少Ox-LDL 形成，發(fā)揮抗AS 作用。Yuhann 等[7]觀察到HDL 結(jié)合SR-B1 可刺激人工培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)皮型一氧化氮合酶，以維持血管內(nèi)皮的完整性，是SR-B1 抗AS 的可能作用機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組紅油O 染色表明姜黃素可以促進(jìn)THP1 巨噬泡沫細(xì)胞膽固醇外轉(zhuǎn)運(yùn)，減少細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積。Western blot 結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組SR-B1 表達(dá)升高，表明姜黃素可以上調(diào)SR-B1 表達(dá)。由于本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)觀察指標(biāo)較少，計(jì)劃進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)觀察多個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白如ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1, ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Gl 的表達(dá)情況，以及不同濃度的姜黃素的作用情況。