長枝木霉TL16菌株對南方根結線蟲的防治效果

李 瑞，李惠霞，謝丙炎，盧智琴，羅 寧

(1.甘肅農業(yè)大學 植物保護學院/甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.中國農業(yè)科學院 蔬菜花卉研究所，農業(yè)部園藝作物生物學與種質創(chuàng)制重點實驗室，北京 100081)

根結線蟲(Meloidogyne)是一類植物寄生性線蟲，具有種類多、分布廣、致病性強、繁殖及傳播速度快的特性，其寄主范圍超過5 500種，已成為設施農業(yè)生產(chǎn)中連作障礙及致病成災的重要病原線蟲之一[1-2]。迄今，已發(fā)現(xiàn)的根結線蟲約有100多種，其中爪哇根結線蟲(M.javanica)、花生根結線蟲(M.arenaria)、南方根結線蟲(M.incognita)和北方根結線蟲(M.hapla)是主要的世界性害蟲，以南方根結線蟲(M.incognita)危害最為嚴重[3]。隨著設施蔬菜的迅速發(fā)展，長期連茬栽培，使得根結線蟲病的危害日益嚴重。據(jù)聯(lián)合國糧農組織(FAO)估計，全世界每年由于植物寄生線蟲病害造成的經(jīng)濟損失達100億美元[7-9]，在我國每年因根結線蟲危害造成的損失達4億美元[10]。

根結線蟲二齡幼蟲孵化后，受根系分泌物的吸引，尋找寄主植物。二齡幼蟲可侵染根部的所有部位，進入根組織后形成穩(wěn)定的取食位點，誘導植物根系形成巨型細胞[4]，嚴重影響植物對水分和養(yǎng)分等物質的吸收和利用[5]。同時，根結線蟲侵入造成的傷口有利于土壤中其他病原物的侵入，引起復合侵染，進一步加重危害[6]。根結線蟲病的防治方法主要包括化學防治、農業(yè)防治、抗病品種的利用及生物防治等?；瘜W殺線劑具有毒性高、降解慢，對環(huán)境污染嚴重等缺點。培育抗病品種是防治根結線蟲病最經(jīng)濟有效的措施，但因致病性分化及抗病種質資源的缺乏，限制了抗病育種的進程[11]。生物防治因其具有清潔、高效的優(yōu)勢，可滿足無公害蔬菜的生產(chǎn)要求，是目前國內外線蟲防治的重點和熱點之一。越來越多的木霉(Trichoderma)菌株被開發(fā)成生防制劑廣泛用于蔬菜根結線蟲病的防治。木霉是一類分布廣泛的土壤習居菌，大量存在于植物根際及根表，是防治植物寄生性線蟲的重要生防資源[12]。木霉菌可以寄生于根結線蟲的卵，其發(fā)酵液可以殺死根結線蟲二齡幼蟲，減少根結數(shù)量。哈茨木霉菌TRI2在田間對黃瓜根結線蟲的防治效果達到72.20%，與阿維菌素具有相似的防治效果[17]。文獻報道[13-16]，長枝木霉菌(T.longibrachiatum)的多個菌株如T6，T05和T115D對根結線蟲具有較高的防治效果。張樹武等[16,18]研究報道，長技木霉菌株T6分生孢子懸浮液對黃瓜根結的抑制率為33.00%～79.00%。

受環(huán)境因素的影響，同一菌株在不同地區(qū)對線蟲的防治效果并不穩(wěn)定，且不同的菌株對不同線蟲的寄生能力也不相同，因而每個菌株的應用范圍受到了限制。為應對不同地區(qū)、不同線蟲危害的問題，進一步挖掘防治根結線蟲的木霉菌資源。試驗利用長枝木霉菌株TL16孢子懸浮液測定對南方根結線蟲卵和二齡幼蟲寄生和抑制效果，通過盆栽試驗測定TL16對黃瓜根結線蟲病的防治效果，以期為新型、高效的木霉菌殺線劑的開發(fā)及應用奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試長枝木霉TL16菌株(Trichodermalongibrachiatum)，由甘肅農業(yè)大學植物保護學院植物線蟲學實驗室分離，鑒定并保存。

南方根結線蟲(Meloidogyneincognita)由中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所病害組實驗室分離鑒定，在茄門辣椒上擴繁。

供試黃瓜(Cucumissativus)品種為中農6號，購自中蔬種業(yè)科技(北京)有限公司。

1.2 制備方法

1.2.1 長枝木霉TL16孢子懸浮液制備 將TL16在PDA平板上25℃培養(yǎng)7 d，向培養(yǎng)物中加一滴Tween-80和5 mL無菌水，反復沖洗，使分生孢子脫落，即得到分生孢子懸浮液原液。用血球計數(shù)板計算孢子濃度(3×107cfu/mL)，然后分別稀釋為1.5×107、7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mL，備用。

1.2.2 根結線蟲卵懸浮液制備 待茄門辣椒上的根結線蟲成熟后，用自來水清洗辣椒根部，挑取新鮮卵塊，置于含1.0% NaClO的5 mL離心管中，渦旋震蕩。在超凈工作臺內，用滅菌的100目(孔徑147 μm)網(wǎng)篩過濾，收集濾液，然后用400目(孔徑38 μm)網(wǎng)篩過濾，最后用無菌水將400目網(wǎng)篩上的卵沖洗至2 mL離心管中離心，制成1 000個卵/mL的懸浮液[19]。

1.2.3 根結線蟲二齡幼蟲收集 從辣椒根上挑取成熟卵塊用0.5%的NaClO消毒3～5 min，再用無菌水漂洗干凈，將卵塊置于濾網(wǎng)上，在直徑90 mm培養(yǎng)皿中加蒸餾水，于28℃孵化，24 h后從篩網(wǎng)下收集孵化的二齡幼蟲，制成1 000條/mL的線蟲懸浮液備用。

1.2.4 長枝木霉TL16孢子懸浮液對根結線蟲卵及二齡幼蟲的作用 該試驗在滅菌的96孔細胞培養(yǎng)板，25℃進行，每個孔中加50 μL線蟲(50 μL卵)懸浮液，100 μL TL16孢子懸浮液(7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mL)，以100 μL無菌水為對照，處理和對照均重復12次，共2次生物學重復。分別在24，48和72 h觀察線蟲的死亡情況；3，6和9 d觀察卵孵化情況，計算二齡幼蟲死亡率，卵孵化相對抑制率。

1.2.5 長枝木霉TL16盆栽試驗 將黃瓜種子依次用70%酒精和5%的NaClO各消毒3 min和5 min，最后用無菌水洗干凈，28℃催芽至露白后播種于育苗盤中，待黃瓜苗兩葉期時在處理液中浸根5 min后移栽至體積約300 mL的塑料杯中，每杯含80 g滅菌土壤(基質與蛭石3∶1)，移栽一株。試驗設5個處理，分別是濃度為3×107、1.5×107、7.5×106、3×106、1.5×106cfu/mLTL16孢子懸浮液以無菌水和1.8%的阿維菌素乳劑為對照。每處理18株，重復3次，共2次生物學重復。黃瓜移苗7 d后，在距根部2 cm處打1 cm深的小孔，接南方根結線蟲二齡幼蟲500條，40 d后觀察根部根結線蟲病害癥狀，統(tǒng)計根結數(shù)，根據(jù)根結數(shù)量及大小記載病情級別，并計算根結指數(shù)(GI)，評價防治效果。

根結線蟲病的分級方法采用Garabedian和Van Gundy(1983)[20]的分級標準，0級：根系健康，無根結；1級：有極少量根結，占全根系的1%～20%；2級：有少量根結，占全根系的21%～40%；3級：根結數(shù)量中等，占全根系的41%～60%；4級：根結數(shù)量很多，占全根系的61%～80%；5級：根結數(shù)量極其多且大，占全根系的81%～100%。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel和Word 2010進行數(shù)據(jù)處理和表格繪制，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，利用Duncan新復極差法進行差異顯著性檢驗(α=0.05)。表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 長枝木霉TL16孢子懸浮液抑制線蟲卵孵化

長枝木霉TL16孢子懸浮液對根結線蟲卵孵化具有明顯的抑制作用(表1)。其中，處理3 d時CK和1.5×106、3×106、7.5×106cfu/mL孢子液中卵孵化率分別為8.57%、4.05%、4.29%、4.05%，6 d時分別為13.93%、6.07%、5.36%、5.24%，9 d時分別為21.55%、10.00%、10.83%、6.67%，各處理濃度卵孵化率與對照均存在顯著差異。在第9 d時，濃度為7.5×106cfu/mL的孢子懸浮液對根結線蟲卵孵化的抑制率顯著高于其他2個濃度，抑制率達69.05%。同樣在第3、6 d時，7.5×106cfu/mL的濃度對卵孵化抑制率也略高于其他2個濃度，抑制率分別是52.78%和62.39%。試驗表明，7.5×106cfu/mL孢子液對根結線蟲卵孵化抑制效果最佳。從處理時間分析，在第6 d時，各處理濃度的平均抑制率最高，達到60.11%。

表1 不同濃度TL16孢子懸浮液對南方根結線蟲卵孵化的抑制作用

注：數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示菌株間差異顯著(P<0.05)，下同

2.2 長枝木霉TL16孢子懸浮液對根結線蟲二齡幼蟲的致死作用

試驗結果表明，長枝木霉TL16孢子懸浮液對南方根結線蟲二齡幼蟲無致死作用(表2)。在處理后24、48 h，TL16孢子懸浮液對根結線蟲的致死作用與對照之間無顯著差異，在72 h，TL16與CK之間略有差異，致死率為1.65%。

2.3 長枝木霉TL16對黃瓜根結線蟲盆栽防治效果

TL16孢子懸浮液能夠顯著降低黃瓜根結指數(shù)，不同濃度處理間存在顯著差異，防治效果隨著濃度的增大呈先增后減趨勢(表3)。當濃度為7.5×106cfu/mL時，對線蟲的防治效果最佳，根結指數(shù)為31.78%，防治效果達55.00%，其次是1.5×107cfu/mL，根結指數(shù)和防治效果分別為35.33%和50.00%，與阿維菌素的防治效果均無顯著差異。試驗結果表明，長枝木霉TL16孢子懸浮液對黃瓜根結線蟲具有與阿維菌素相似的防治效果，可有效的防治根結線蟲(圖1)。

表2 TL16孢子懸浮液對南方根結線蟲的致死作用

圖1 TL16孢子懸浮液對黃瓜根結線蟲的防治作用Fig.1 Control effects of TL16 spore suspension on M.incognita cucumberA.對照；B.1.8%阿維菌素；C.7.5×106孢子懸浮處理

3 討論

根結線蟲是農作物的重要病原物之一，近年來隨著全球氣候變暖和作物復種指數(shù)的不斷提高，根結線蟲對作物的危害愈來愈嚴重[23]。木霉作為一種重要的生防菌，在防治植物寄生性線蟲方面具有巨大的價值和應用前景。試驗從孢子懸浮液對南方根結線蟲卵和二齡幼蟲的離體試驗和溫室盆栽2個方面測定了長枝木霉菌株TL16對根結線蟲的防治效果，發(fā)現(xiàn)TL16孢子懸浮液對線蟲卵孵化具有較強的抑制作用，但對二齡幼蟲沒有致死作用。在盆栽試驗中，濃度為7.5×106cfu/mL的孢子懸浮液的防治效果較佳，其作用與阿維菌素基本相當。試驗結果可為根結線蟲生防菌的應用以及木霉生物制劑的開發(fā)利用提供依據(jù)。

目前有關木霉的生防機理主要表現(xiàn)在抗生、競爭、重寄生和誘導抗性等方面[27]。木霉產(chǎn)生的Peptaibols，可抑制多種病原菌，如11殘基，14殘基和18殘基的Peptaibols可抑制番茄早疫病，水稻紋枯病及辣椒疫霉病等[28]。有研究報道，綠色木霉中含有蔗糖水解反應的胞內轉運酶，可以跟病原菌競爭植物分泌的碳水化合物[29]。哈茨木霉可誘導菜豆對灰霉病和炭疽病產(chǎn)生抗性[30]，還可以產(chǎn)生幾丁質酶抑制根結線蟲卵的孵化[31]。張樹武等[22]研究發(fā)現(xiàn)長枝木霉分生孢子懸浮液對小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲具有較強的致死和寄生作用。

試驗結果表明，長枝木霉TL16孢子懸浮液對根結線蟲二齡幼蟲無致死作用，這與張樹武等[22]研究發(fā)現(xiàn)長枝木霉分生孢子懸浮液對小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲具有較強的致死和寄生作用不同，可能是受不同菌株致病性強弱、線蟲種類和植物種類及其對氣候的適應性等因素的影響[23]，但其孢子懸浮液對根結線蟲卵孵化具有明顯的抑制作用，這與Windham等[31]研究結果相似。盆栽試驗中TL16孢子懸浮液對黃瓜根結線蟲表現(xiàn)出較好的防效，防治效果隨著孢子濃度增大呈先增后減的趨勢。當孢子濃度為7.5×106cfu/mL時防效最佳，可能是TL16的大量繁殖與植株形成競爭關系，從植株和土壤中汲取生長所需營養(yǎng)物質，占據(jù)植株的生長空間，使得植株抗性降低。推測TL16除抑制卵孵化外，還可能誘導植株產(chǎn)生抗性，另外，TL16菌株能否對植株起到促生作用，這些都有待進一步的研究。

4 結論

長枝木霉TL16孢子懸浮液對南方根結線蟲卵孵化具有較明顯的抑制作用，處理9 d，濃度為7.5×106cfu/mL懸浮液抑制率為69.05%。同時在盆栽試驗中，TL16孢子懸浮液對黃瓜根結線蟲的防治效果隨著孢子濃度增大呈先增后減的趨勢，濃度為7.5×106cfu/mL時防效最佳，為55.00%。