中國紅豆杉植株再生體系優(yōu)化

王 威,白江平，王 清，黃惠英

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

中國紅豆杉(Taxuswallichianavar.chinensis)為紅豆杉科紅豆杉屬常綠喬木。紅豆杉屬植物，全世界有11 種，中國原產(chǎn)有4個種1個變種，即中國紅豆杉(中國特有物種)、東北紅豆杉、云南紅豆杉、西藏紅豆杉、南方紅豆杉(變種)。紅豆杉是植物界的活化石，國家一級重點保護珍稀瀕危植物。從紅豆杉中提取的紫杉醇及其衍生物是目前世界上公認的廣普、高活性抗癌藥物，被稱為“晚期癌癥的最后一道防線”[1-2]。

從一棵紅豆杉樹皮中提取的紫杉醇含量僅為0.01%～0.05%。治療一個癌癥病人需要3～6棵100年的紅豆杉樹皮用于提取紫杉醇子[4]。紅豆杉在自然條件下生長緩慢，再生能力差，種子處于深休眠狀態(tài)，需經(jīng)兩冬一夏才能萌發(fā)，發(fā)芽率低[5]。人工繁殖主要靠扦插和種子育苗移栽等方法[6-8]，但繁殖速度較慢，繁殖材料利用率低，無法滿足紫杉醇提取所需用的原料[9]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)工廠化生產(chǎn)紅豆杉種苗，再進行人工栽培，是解決紫杉醇原料短缺的途徑之一[10]。

近年來有關(guān)紅豆杉的研究主要集中在人工種植，組織和細胞培養(yǎng)[10-13]，微生物和基因工程[14-16]，遺傳轉(zhuǎn)化[16]，紫杉醇的合成、化學(xué)提取等方面[16-17]。通過尋找最優(yōu)化的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基和愈傷組織分化培養(yǎng)條件，建立高效的植株再生系統(tǒng)及組培體系，以期為中國紅豆杉基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化，組培生產(chǎn)大量的愈傷組織或懸浮細胞，從中提取紫杉醇提供技術(shù)參考。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗用的中國紅豆杉枝條采自甘肅省隴南市徽縣，2016年6月剪取8年齡當年生的嫩枝。中國紅豆杉的試管苗由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院組培實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 外植體的滅菌處理及培養(yǎng) 將采回來的枝條剪去葉片后剪切成2～4 cm長的段,每段帶2～3個側(cè)芽,先用洗衣粉溶液浸泡10～15 min，再用自來水沖洗40 min，在超凈工作臺上,用75%的乙醇浸泡30 s后用15%的84消毒液浸泡12～15 min，再用0.1%的HgCl2消毒6～10 min,無菌水沖洗4～5次，然后接種到WPM附加植物生長調(diào)節(jié)劑2-ip，6-BA和NAA的初代培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件在25±2℃，16 h/d、1 600～2 000 lx光照條件下培養(yǎng)。

1.2.2 愈傷組織誘導(dǎo)和芽分化培養(yǎng) 將試管苗的葉片剪為長0.5 cm的小片，莖剪切成1 cm小段，分別接種到愈傷組織誘導(dǎo)的10種培養(yǎng)基(接種時莖段平放于培養(yǎng)基上，葉片的上表皮面與培養(yǎng)基接觸)。每瓶培養(yǎng)基上接種10塊，每個處理接種3瓶，每個處理設(shè)3個重復(fù)。將接種好材料的三角瓶和培養(yǎng)皿置于人工氣候箱，在(25±1)℃、12 h/d、1 600 lx光照條件下進行培養(yǎng)。培養(yǎng)10 d后觀察出愈時間，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，50 d后統(tǒng)計芽分化率和出苗的情況。

出愈率=愈傷化外植體數(shù)/總接種外植體數(shù)×100%

分化率=分化出芽愈傷組織數(shù)/總愈傷組織數(shù)×100%

各處理，各階段培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基，全部以WPM為基本培養(yǎng)基，附加AC 0.3%、蔗糖3%、瓊脂0.6%，pH 5.8。

1.2.3 試驗設(shè)計及數(shù)據(jù)處理 試驗設(shè)計和數(shù)據(jù)處理采用《農(nóng)業(yè)田間試驗統(tǒng)計分析軟件》[18]。

1.3 選擇試驗因素確定上、下線水平

根據(jù)紅豆杉組織和細胞培養(yǎng)等相關(guān)文獻報道[16-17]，以3種外源激素最高使用濃度為上限，以不使用為下限進行設(shè)計(表1)。

表1 3種外源激素使用濃度上、下界值

1.4 外源激素NAA，6-BA和2-ip配比組合及濃度實際值

為了減輕工作量，試驗對3種外源激素濃度和不同配比采用了三因子D-飽和最優(yōu)設(shè)計[19]。根據(jù)3種外源激素使用的濃度上、下界值，計算濃度梯度的變化區(qū)間，再按照三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計表配置出10種組合(表2)。

表2 各培養(yǎng)基3種外源激素組合編碼及實際值

1.5 結(jié)果統(tǒng)計分析

統(tǒng)計資料采用多元回歸分析，即先建立結(jié)構(gòu)矩陣，解線性方程組得到相關(guān)矩陣和解。當回歸模型通過擬合性檢驗后，利用回歸方程尋求優(yōu)化的因子組合，以獲得外源激素濃度和配比的優(yōu)化組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同的外源激素濃度配比對中國紅豆杉試管苗莖段愈傷組織及分化成苗的影響

將中國紅豆杉試管苗的莖段和葉片分別接種到10種6-BA，NAA和2-ip不同濃度配比的WPM培養(yǎng)基上，30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率，50 d后統(tǒng)計分化率(表3)。

運用多元二次數(shù)學(xué)模型Y=b0+∑bjXj+∑BijX1X3+∑BijXj2，對試管苗莖段的愈傷組織誘導(dǎo)率、芽分化率、根誘導(dǎo)率進行統(tǒng)計，分別得到三元二次回歸方程：

Y(s愈)=0.930-0.037X1-0.039X2-0.035X3-0.039X1X2-0.016X1X3-0.008X2X3-0.074X12-0.04X22-0.030X32

(r=0.946 6,f=83.932)

表3 3種外源激素濃度配比下中國紅豆杉試管苗莖段愈傷組織誘導(dǎo)率及分化成苗率

Y(S根)=0.046-0.027X1-0.037X2-0.049X3-0.012X1X2-0.125X1X3-0.128X2X3-0.128X12-0.056X22-0.154X32

(r=0.987 6,f=90.521)

Y(S芽)=0.930-0.037X1-0.039X2-0.035X3-0.039X1X2-0.016X1X3-0.008X2X3-0.74X12-0.047X22-0.030X32

(r=0.946 6,f=83.932)

由于試管苗的葉片培養(yǎng)均未發(fā)生芽分化，因此只對不同外源激素濃度和配比對葉片愈傷和生根的影響效應(yīng)進行多元回歸分析，得到三元二次方程：

Y(1愈)=0.611-0.041X1-0.008X2-0.089X3- 0.006X1X2-0.181X1X3-0.032X2X3-0.180X12-0.377X22-0.187X32

(r=0.992 9，f=154.749)

Y(1根)=0.129-0.018X1-0.091X2-0.038X3-0.237X1X2-0.184X1X3-0.146X2X3-0.128X12-0.056X22-0.154X32

(r=0.9879，f=90.521)

2.2 D-飽和最優(yōu)設(shè)計對中國紅豆杉莖段培養(yǎng)的不同外源激素濃度和配比尋優(yōu)

利用回歸方程尋優(yōu)，得到中國紅豆杉試管苗莖段、葉片愈傷組織誘導(dǎo)、芽、根分化的3種外源激素使用濃度較優(yōu)組合(表4)。

表4 D-飽和最優(yōu)設(shè)計對中國紅豆杉莖段培養(yǎng)的3種外源激素濃度和配比尋優(yōu)

結(jié)果表明，在培養(yǎng)基WPM中添加了NAA 0.2 mg/L、6-BA 2.25 mg/L、2-ip 1.5 mg/L，當生長素/細胞分裂素摩爾濃度比為1∶5時，有利于莖段脫分化形成愈傷組織;(2)在培養(yǎng)基WPM中只添加NAA 0.4 mg/L對根分化有利；(3)在培養(yǎng)基WPM中只添加6-BA 3.4 mg/L與2-ip 4.5 mg/L，不加NAA，當兩種激素摩爾濃度比為1∶1.2時，有利于芽分化；(4)在培養(yǎng)基WPM中添加NAA 0.3 mg/L和6-BA 3.4 mg/L、2-ip 3.0 mg/L，摩爾濃度比增大到(1∶6)時，有利于葉片脫分化形成愈傷組織。

3 討論

(1)組織培養(yǎng)技術(shù)是生物工程技術(shù)的基礎(chǔ)，在紅豆杉細胞培養(yǎng)和基因工程的遺傳轉(zhuǎn)化工作中建立好的植株再生體系主要依賴于植物組織培養(yǎng)技術(shù)，與一般的植物組織培養(yǎng)相比要求更高，內(nèi)容更加復(fù)雜。首先要有一個高頻的再生系統(tǒng)，其中包括外植體的選擇，最佳培養(yǎng)基和適宜品種的確定等。試驗對中國紅豆杉試管苗的莖段及葉片的再生能力進行了研究，經(jīng)過試驗對比，初步確定試管苗莖段是比較容易再分化的材料，具有生長狀況易于確定，誘導(dǎo)率高、分化能力較強的突出特點，試驗結(jié)果與Wang G Y等[20]的研究基本一致。用試管苗葉片誘導(dǎo)出來的愈傷組織容易死亡，再生能力差，試驗結(jié)果與甘煩遠等[21]的研究結(jié)論相似。因此，用葉片作細胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化的受體材料有待進一步研究。

(2)好的細胞培養(yǎng)和植株再生體系的基礎(chǔ)是篩選出好的培養(yǎng)基。紅豆杉組織培養(yǎng)技術(shù)研究始于20世紀80年代，文獻報道的培養(yǎng)基配方中的基本成分大部分是MS或B5等[21-22]，在試驗中變化最多的是植物生長調(diào)節(jié)劑，尤其是生長素和細胞分裂素[23]。通常篩選最佳培養(yǎng)基配方采用的方法是將激素設(shè)計為系列濃度，然后組配所有可能的組合，進行培養(yǎng)篩選。如果將這一方法應(yīng)用到細胞培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化體系的培養(yǎng)基篩選中工作量很大。為了得到可靠的試驗數(shù)據(jù)，在試驗中快速、準確的設(shè)計和處理大量的數(shù)據(jù)，可采用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計方法。采用了以WPM為基本培養(yǎng)基，附加0.3% AC、3%蔗糖、0.6%瓊脂，pH 5.8，針對6-BA，2-ip和NAA，用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計配置10個組合，篩選出了適合誘導(dǎo)莖段和葉片愈傷組織的培養(yǎng)基，莖段愈傷組織分化芽的培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基。

4 結(jié)論

對植物生長調(diào)節(jié)劑6-BA，2-ip和NAA應(yīng)用三因素D-飽和最優(yōu)設(shè)計方法，在配置的10個組合培養(yǎng)基中篩選出了WPM +6-BA 2.25 mg/L+2-ip 1.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L為最適合誘導(dǎo)莖段愈傷組織的培養(yǎng)基。WPM+6-BA 3.4 mg/L+2-ip 3.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L為葉片最適合誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基；WPM+6-BA 3.4 mg/L+2-ip 3.0 mg/L為最適合莖段愈傷組織分化芽的培養(yǎng)基，WPM+NAA 0.4 mg/L為適合的生根培養(yǎng)基。

從試管苗莖段和葉片的再生能力比較試驗中發(fā)現(xiàn)，用葉片誘導(dǎo)出來的愈傷組織，隨著培養(yǎng)時間的延長和繼代次數(shù)的增加，愈傷組織逐漸變黑死亡，未能分化出芽。初步判斷試驗中篩選的培養(yǎng)基適合試管苗莖段的植株再生培養(yǎng)，而不適合葉片的植株再生培養(yǎng)。