濕潤燒傷膏對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中骨形成蛋白7表達的影響

蘭海生 黃許森 單云龍 黃海舸 岑小寧 鐘麗華 李明尚

【摘要】?目的?動態(tài)觀察濕潤燒傷膏對大鼠慢性難愈合創(chuàng)面組織中BMP-7表達的影響。方法?按照隨機數(shù)表將54只健康成年SPF級SD雄性大鼠分為慢創(chuàng)組（18只）、美寶濕潤燒傷膏（MEBO）組（18只）和貝復濟組（18只），模型建立后，慢創(chuàng)組創(chuàng)面局部涂生理鹽水、MEBO組局部涂美寶濕潤燒傷膏、貝復濟組局部涂外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子干預治療，并分別于治療后第3、7、14天檢測并對比各組大鼠創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平以及脂肪細胞的生成情況。結果?（1）在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平組內比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），BMP-7蛋白的表達水平逐漸升高（第3天<第7天<第14天），組間對比：MEBO組、貝復濟組與慢創(chuàng)組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），MEBO組與貝復濟組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（2）隨著治療時間延長，脂肪細胞生成數(shù)逐漸增多（P<0.01），其中MEBO組、貝復濟組脂肪細胞生成數(shù)較慢創(chuàng)組多（P<0.05）。結論?濕潤燒傷膏可有效上調創(chuàng)面組織中BMP-7的表達水平，促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成。

【關鍵詞】?濕潤燒傷膏;慢性難愈合創(chuàng)面;BMP-7;脂肪細胞

中圖分類號：R642?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.003

體表慢性難愈合創(chuàng)面是指由多種原因引起的治療1個月以上仍未愈合且無明顯愈合傾向的創(chuàng)面[1]。慢性難愈合創(chuàng)面是外科常見疾病之一，因其治療周期長、難度大及費用高，往往造成患者巨大負擔。在創(chuàng)面修復過程中，往往伴隨著一系列復雜炎癥免疫反應及內環(huán)境變化，如：肌成纖維細胞在損傷部位遷移復位以及細胞外基質沉積，而過度的細胞外基質沉積往往造成疤痕愈合，疤痕愈合不僅影響美觀同時也影響機體的功能，因此尋找有效促進慢性難愈合創(chuàng)面愈合，并且減少疤痕產生的藥物成為臨床研究的熱點和難點[2]。目前研究表明，美寶濕潤燒傷膏（MEBO）可通過調控血管內皮生長因子（VEGF）等多條信號通路促進創(chuàng)面愈合，但其對瘢痕修復的具體機制未完全闡明，而骨形成蛋白7（Bone morphogenetic protein 7，BMP-7）能夠通過拮抗轉化生長因子-β1（TGF-β1）等信號通路抑制纖維化，從而抑制疤痕產生[1，3～4]。遂筆者通過觀察創(chuàng)面組織中BMP-7的表達情況，為揭示該藥物在促進創(chuàng)面愈合，減少疤痕產生的部分分子機制提供一定的理論基礎。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

1.1.1?實驗動物

健康成年SPF級SD雄性大鼠54只購于長沙市天勤生物技術有限公司，鼠齡12～14周，體重240～270 g，于屏障環(huán)境動物實驗室內進行飼養(yǎng)、造模、取標本。本研究經右江民族醫(yī)學院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2?主要試劑

貝復濟（rb-bFGF，外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子，國藥準字19991021，珠海億勝生物制藥有限公司生產）;濕潤燒傷膏（moist exposed burn ointment，MEBO，國藥準字Z20000004，汕頭市美寶制藥有限公司生產）;水合氯醛（CAS登記號302-17-0，泰興市豪申化工貿易有限公司生產）;醋酸氫化可的松注射液（國藥準字H31021290，上海通用藥業(yè)股份有限公司生產）;改良油紅O染色液（北京索萊寶科技有限公司，貨號20190423）;BMP-7一抗：Rabbit Anti-BMP7抗體[EPR5897]，分子量：49 kD，abcam，貨號ab129156，稀釋比例：1∶1000;二抗：山羊抗兔的二抗，北京中杉，貨號ZB2301，稀釋比例：1∶3000。

1.2?實驗方法

1.2.1?動物分組及模型建立

按照隨機數(shù)表將54只大鼠分為慢性難愈合創(chuàng)面組（慢創(chuàng)組）、MEBO濕潤燒傷膏組（MEBO組）和貝復濟組各18只，其中貝復濟組為陽性對照組。以水合氯醛腹腔注射麻醉（0.3 mL/l00 g）及背部備皮后，用直徑為l.5 cm的圖章標記，并在無菌條件下沿標記分別于脊柱兩側各做深達筋膜層的全層皮膚缺損創(chuàng)面，建立全層皮膚缺損創(chuàng)面后，立即肌肉注射醋酸氫化可的松注射液（8 mg/100 g），使其形成慢性難愈合創(chuàng)面，創(chuàng)面常規(guī)消毒后，慢創(chuàng)組創(chuàng)面局部涂生理鹽水、MEBO組局部涂美寶濕潤燒傷膏、貝復濟組局部涂外用重組牛堿性成纖維細胞生長因子，并予無菌干紗布包扎固定，每天換藥2次[1，3]。

1.2.2?標本采集

分別于創(chuàng)面處理后第3天、第7天、第14天，從每組中隨機選取6只大鼠，取創(chuàng)面組織制作冰凍切片，余暫時存放于液氮中，并置于-80℃的冰箱內儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3?Western blotting技術檢測BMP-7蛋白表達水平

取組織100 mg，置于冰面上，加入1 mL組織裂解液，予勻漿機將標本攪碎，15 000 r/min進行離心20 min，取上清，提取組織蛋白，檢測蛋白含量，并將蛋白變性后保存?zhèn)溆?將提取的蛋白上樣置于80 V恒壓下進行電泳，待條帶均勻后，在300 mA恒流下進行半干轉60 min，隨即室溫搖床封閉，并于4℃搖床內孵育一抗過夜;一抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并加二抗室溫孵育l.5 h;二抗孵育后，用PBST洗膜三次，每次5 min，并于暗室內曝光;最后用Image J圖像分析軟件對檢測結果進行灰度分析，樣本蛋白含量=目的條帶積分吸光度值/內參條帶積分吸光度值[1，5]。

1.2.4?改良油紅O染色檢測脂肪細胞表達情況

取新鮮組織置于10%福爾馬林固定10 min后水洗，于冰凍切片機制成10 μm厚度切片，切片入蒸餾水沖洗，再入60%異丙醇浸洗20 s，入改良油紅O染色液中加蓋密閉染色10 min，然后入60%異丙醇分色，入蒸餾水稍沖洗，Mayer蘇木素染色液復染核2 min，入1%鹽酸分化10 s，蒸餾水沖洗多余染料，濾紙吸干水分，甘油明膠封片，最后用Imagepro plus圖像分析軟件對脂肪細胞計數(shù)。

1.3?統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，其中計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，并根據(jù)方差齊性檢驗結果采用LSD法或Games-Howell法進行組間對比，組間不同時項對比采用重復測量方差分析，檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2?結果

2.1?三組大鼠創(chuàng)面組織內BMP-7蛋白的表達水平對比

經重復測量方差分析，組間干預因素以及不同觀察時項之間差異均有統(tǒng)計學意義（干預方法為主效應，F(xiàn)=26.52，P=0.01;以觀察時項為主效應，F(xiàn)=71.01，P=0.001;兩者交互作用，F(xiàn)=4.35，P=0.21），在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織中BMP-7蛋白的表達水平組內比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），BMP-7蛋白的表達水平逐漸升高（第3天<第7天<第14天），同一時項組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.05），其中MEBO組與貝復濟組對比差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），BMP-7蛋白的表達水平，MEBO組=貝復濟組>慢創(chuàng)組。見表1。Western blotting法檢測BMP-7蛋白表達條帶見圖1。

2.2?三組大鼠創(chuàng)面組織油紅O切片中脂肪細胞數(shù)對比

在治療的第3天、第7天、第14天，創(chuàng)面組織油紅O切片中脂肪細胞數(shù)組內比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），脂肪細胞數(shù)逐漸升高（第3天<第7天<第14天），同一時項組間比較差異亦有統(tǒng)計學意義（P<0.01），其中MEBO組與貝復濟組脂肪細胞數(shù)第3天、第7天、第14天均明顯多于慢創(chuàng)組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），第7天和第14天MEBO組脂肪細胞數(shù)多于貝復濟組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見表2。大鼠創(chuàng)面組織的油紅O染色情況見圖2。

3?討論

創(chuàng)面愈合包括了細胞的遷移、增殖分化、炎癥反應、細胞生長因子分泌、基質沉積和血管形成等。在慢性難愈合創(chuàng)面愈合過程中，損傷炎癥刺激后，成纖維細胞在趨化因子的作用下進入創(chuàng)口并分裂增殖，成纖維細胞的增殖和膠原的沉積有利于創(chuàng)面的愈合，但長期過度增殖和過多的膠原沉積往往導致增生性瘢痕形成，修復的瘢痕不僅影響美觀，而且彈性較差、汗液蒸發(fā)緩慢、近關節(jié)處瘢痕易限制關節(jié)活動等一系列問題影響了組織的功能[6]。

因虛感邪，邪氣致瘀，瘀阻傷正，化腐致?lián)p是慢性難愈合創(chuàng)面病情演變特點之一，隨著對慢性難愈合創(chuàng)面了解的不斷深入，近年來越來越多中醫(yī)療法應用于慢性難愈合創(chuàng)面的治療，其中又以中醫(yī)外治法效果最為顯著[3，7]。MEBO由黃連、黃柏、黃芩、地龍、罌粟殼為主要成分，目前研究表明，MEBO所含的低分子蛋白質、脂肪和糖等營養(yǎng)物質，可直接作用于潰瘍創(chuàng)面，并在局部被組織吸收，為創(chuàng)面組織的再生修復提供營養(yǎng)原料，加快創(chuàng)面的愈合，此外，MEBO干預治療能通過調控ERK1/2和p38的傳導信號通路明顯提高創(chuàng)面肉芽組織VEGF、bFGF、EGF基因及蛋白表達，從而加速成纖維細胞、血管內皮細胞的增殖分化，調節(jié)創(chuàng)面修復基質的形成，促進肉芽組織生長及肉芽組織在創(chuàng)面的填充，促進創(chuàng)面成纖維細胞增殖和毛細血管再生，最終加快創(chuàng)面愈合的進程，減少創(chuàng)面疤痕的產生[1，8～9]。因其療效顯著，皮膚再生醫(yī)療技術（MEBT/MEBO）已納入國家規(guī)劃教材《中西醫(yī)結合外科學》，同時制定相關臨床應用規(guī)范，廣泛應用于臨床慢性難愈合創(chuàng)面的治療[10]。

BMP-7是BMP家族中的成員之一，是一種分泌型多功能蛋白，BMP-7最初被認為具有促進骨形成的作用，但近年研究發(fā)現(xiàn)，BMP-7與多種疾病的抗纖維化作用有關。BMP-7因具有抑制纖維化、促進皮膚發(fā)育等功能，故BMP-7在創(chuàng)面修復中可能起到促進再生，減少疤痕愈合的作用。Smad依賴途徑在調控纖維化中具有重要作用，BMP-7通常與受體結合并使之發(fā)生磷酸化后發(fā)揮作用。當受體磷酸化后，可作用于下游的Smad蛋白并與不同的Smad蛋白結合形成相應的轉錄調節(jié)復合物，從而進入到細胞核內作用于特定基因序列，發(fā)揮抗纖維效應[11]。Guo等人[12]研究證實，外源性給予BMP-7干預，可減少瘢痕組織中膠原沉積和纖維化蛋白的表達，且呈時間和劑量依賴型。在本研究中，創(chuàng)面形成的第3天，慢創(chuàng)組BMP-7蛋白的表達量低于MEBO組和貝復濟組，隨著時間延長，在創(chuàng)面形成的第7天和第14天，各組的BMP-7蛋白的表達逐漸上升，MEBO組和貝復濟組表達量高于慢創(chuàng)組，提示美寶濕潤燒傷膏和貝復濟均能促進創(chuàng)面中BMP-7蛋白的表達。

在人皮膚中，BMP-7蛋白主要表達在表皮、真皮乳頭層和毛囊外結構，其中在皮脂腺、汗腺、立毛肌和血管中顯著表達，同時BMP-7蛋白的分布又隨毛發(fā)周期改變而改變，提示BMP-7可能參與皮膚發(fā)育和功能的調節(jié)[13～14]。在創(chuàng)面愈合過程中，組織的再生需要新生毛囊，趨化因子通過激活骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號的轉導，促進成纖維細胞轉化成脂肪細胞，從而促進毛囊的生成，促進再生。在本研究中，創(chuàng)面組織中的脂肪細胞隨時間延長，數(shù)量增多，而在同一時項，MEBO組和貝復濟的脂肪細胞生成數(shù)多于慢創(chuàng)組，提示美寶濕潤燒傷膏能有效促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成，脂肪細胞充分填充皮下纖維結締組織，有利于減少成纖維細胞的沉積，從而減輕創(chuàng)面疤痕修復。

綜上所述，我們猜測，MEBO可能通過上調創(chuàng)面中BMP-7蛋白的表達，從而促進創(chuàng)面組織中脂肪細胞的生成，減少成纖維細胞的沉積，減少疤痕產生，促進創(chuàng)面的再生。但信號通路調控與創(chuàng)面修復的關系是相當復雜的，不同通路的激活與拮抗貫穿了修復與再生的整個過程，而瘢痕組織的過度增生也與免疫炎癥反應有著密切的聯(lián)系，本研究中只顯示美寶濕潤燒傷膏能夠有效激活創(chuàng)面組織中BMP-7的表達以及脂肪細胞的生成，但其具體是如何調控下游信號通路仍需進一步研究。

參?考?文?獻

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（收稿日期：2019-07-11?修回日期：2019-09-10）

（編輯：潘明志）