雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建

殷玉瑾+張巫凡+張聰+王臣

摘 要：本試驗(yàn)旨在構(gòu)建雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)。通過(guò)分子生物學(xué)方法，將雞胚成纖維細(xì)胞cDNA片段連接于T7SeLect 10-1載體上，然后進(jìn)行體外包裝、原始文庫(kù)的測(cè)定、擴(kuò)增及滴度的測(cè)定、序列測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體原始文庫(kù)的滴度為1.1×106pfu/mL，重組效率為60%，擴(kuò)增后的雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的滴度為1.8×1010 pfu/mL，雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)測(cè)序后經(jīng)同源性比對(duì)，有9個(gè)噬菌斑的測(cè)序結(jié)果與雞全基因同源，1個(gè)為空載體。本實(shí)驗(yàn)初步構(gòu)建了雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)，為進(jìn)一步研究雞胚成纖維細(xì)胞蛋白相互作用提供了實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。

關(guān)鍵字：雞胚成纖維細(xì)胞；T7噬菌體；噬菌體文庫(kù)；蛋白質(zhì)相互作用

雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）是一種常用的原代培養(yǎng)細(xì)胞， 在實(shí)驗(yàn)中常作宿主細(xì)胞，用于體外培養(yǎng)許多病毒。雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）存在病毒受體，因此能夠增殖病毒。雞胚成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)在分子生物學(xué)，細(xì)胞學(xué)，遺傳學(xué)，免疫學(xué)，病毒學(xué)，腫瘤學(xué)，及細(xì)胞工程學(xué)等領(lǐng)域，發(fā)展成為一門重要的生物技術(shù)，并取得顯著成就。T7噬菌體是裂解性噬菌體，在細(xì)胞質(zhì)中完成組裝后，成熟的噬菌體直接通過(guò)細(xì)胞裂解而釋放。不像絲狀噬菌體系統(tǒng)，展示在T7表面的多肽或蛋白質(zhì)不需要通過(guò)細(xì)胞膜分泌出來(lái)，因而其表面展示多肽和蛋白的范圍廣。另外，T7噬菌體生長(zhǎng)迅速、復(fù)制速度快、克隆效率高以及穩(wěn)定的特性，使之成為替代其他傳統(tǒng)系統(tǒng)的更好選擇。為此，我們擬構(gòu)建雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體表達(dá)文庫(kù)，以期從中篩選出不同病毒的相關(guān)受體，為進(jìn)一步研究雞胚成纖維細(xì)胞蛋白相互作用提供了實(shí)驗(yàn)研究平臺(tái)。

一、材料與方法

1.試驗(yàn)材料

T7Select10-1b? Cloning Kit （Novagen公司），雞胚成纖維細(xì)胞cDNA：由本實(shí)驗(yàn)室制備和保存。

2.雞胚成纖維細(xì)胞cDNA與T7受體臂的連接

在無(wú)菌的1.5mL管中混合cDNA片段與T7受體臂，然后輕輕地用移液器槍頭上下吹打混勻，于16℃孵育12～16h。貯存于4℃，備用。

3.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的體外包裝

向以解凍的25?L T7選擇性包裝提取物中加入5?L連接反應(yīng)產(chǎn)物，室溫孵育2h后，再加入270?L無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基，終止反應(yīng)。

4.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體原始文庫(kù)的測(cè)定

雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體原始文庫(kù)進(jìn)行測(cè)定，然后隨機(jī)挑選10個(gè)陽(yáng)性克隆，用 T7seleet UP/DOWN引物進(jìn)行PCR檢測(cè)其重組率。最后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

5.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的擴(kuò)增及滴度的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)選用平板法對(duì)文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。首先將過(guò)夜培養(yǎng)的宿主菌按2%的接種量接種50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～1.0，貯存于4℃，備用。最后通過(guò)噬菌斑測(cè)定擴(kuò)增后文庫(kù)的滴度（同原始文庫(kù)滴度測(cè)定）。

6.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的序列測(cè)定

取上述隨機(jī)挑選的10個(gè)陽(yáng)性克隆噬菌斑PCR產(chǎn)物，送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果NCBI進(jìn)行比對(duì)，鑒定其與雞基因全序列的同源性。

二、結(jié)果與分析

1.雞胚成纖維細(xì)胞cDNA T7噬菌體原始文庫(kù)的滴度

雞胚成纖維細(xì)胞體噬菌體原始文庫(kù)在倍比稀釋度為10-3時(shí)的噬菌斑個(gè)數(shù)約100（圖1），在稀釋度為10-4時(shí)的噬菌斑個(gè)數(shù)為11（圖2），代入公式：稀釋倍數(shù)×10×板上噬菌斑的數(shù)量，計(jì)算得雞胚成纖維細(xì)胞T7 噬菌體原始文庫(kù)的滴度為1.1×106pfu/ mL。

2.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)的重組子鑒定

隨機(jī)挑選10個(gè)噬菌斑，用 T7seleetUP/DOWN引物進(jìn)行PCR檢測(cè)重組子比例，重組子為6個(gè)，占60%，即雞胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)重組率為60%。

3.雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)擴(kuò)增后的滴度

擴(kuò)增后的雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)稀釋度為10-7時(shí)的噬菌斑個(gè)數(shù)約為200，在稀釋度為10-8時(shí)的噬菌斑個(gè)數(shù)為18，經(jīng)計(jì)算得擴(kuò)增后的雞胚成纖維細(xì)胞T7噬菌體文庫(kù)滴度為1.8 ×1010 pfu/mL。

三、討論

雞胚成纖維細(xì)胞是雞胚成纖維細(xì)胞（ CEF） 是一種常用的原代培養(yǎng)細(xì)胞， 是許多病毒體外培養(yǎng)的宿主細(xì)胞， 是研究細(xì)胞相互作用的重要模型。噬菌體展示技術(shù)是近年建立和發(fā)展起來(lái)的利用噬菌體表達(dá)外源基因的一項(xiàng)新技術(shù)，它實(shí)現(xiàn)了基因型和表型的結(jié)合，提供了高效率的篩選系統(tǒng)。通過(guò)噬菌體展示技術(shù)的生物淘選過(guò)程， 篩選與靶標(biāo)高度親和的蛋白質(zhì)序列， 從而有助于研究分子間的相互識(shí)別、相互作用的分子機(jī)制。本研究初步構(gòu)建的CEF cDNA的T7 噬菌體表達(dá)文庫(kù)，為今后利用文庫(kù)篩選不同病毒在CEF上的細(xì)胞受體和研究其功能提供了材料來(lái)源，也為研究CEF 的基因及功能，以及病毒與CEF 的相互作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉永清，孫浩. 雞胚成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)與純化的初探[J].豬與禽，2008 ，2（1）：72-73.

[2]冀霞，趙瑞君，劉美德，等. 白紋伊蟻T7噬菌體展示cDNA文庫(kù)的構(gòu)建[J].寄生蟲(chóng)與醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)，2012，19（2）：78-82.

作者簡(jiǎn)介：殷玉瑾（1995-），女，河南周口人，本科學(xué)歷。

王臣（1979-），男，安徽六安人，博士學(xué)歷，副教授，研究方向：動(dòng)物分子病原學(xué)與研究學(xué)