Ataxin-3與相關疾病的分子機制的研究進展

王興枝子 龍喜帶

【摘要】?Ataxin-3 （AT3，ATXN3）是一種重要的去泛素化酶，正常情況下，它參與基因轉錄、蛋白代謝、磷酸化以及自身泛素化水平的調節(jié)。然而突變的Ataxin-3的表達可致轉錄失調，導致細胞毒性和神經退行性變疾病，如脊髓小腦共濟失調3（SCA3）。AT3的異常不僅能導致神經性病變，而且據最近世界各地的研究表明，AT3的失調可能涉及一些人類癌癥或者癌癥前期病變（如胃癌、乳腺癌、肺癌、睪丸癌、肝硬化等）的發(fā)病機制。雖然目前國內關于ATXN3的研究較少，但在國外已經有大量研究報道，該綜述主要總結它的功能與疾病的關系。

【關鍵詞】?Ataxin-3;泛素蛋白酶體系統(tǒng);聚谷氨酰胺;3型脊髓小腦共濟失調

中圖分類號：R392.12?文獻標志碼：A?DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.09.001

Ataxin-3（AT3，ATXN3）作為一種重要的去泛素化酶在國外已經廣泛研究，在國內受到的關注也越來越多，本文就AT3的機制和與它相關的疾病進行綜述，著重介紹它的基因表達水平和蛋白結構功能，以此更深入了解它與其他疾病潛在的機制。

1?Ataxin-3基因與表達

ATXN3基因位于染色體14q32.12上，包含了13個外顯子，并能選擇性剪接不同的蛋白亞型，在血液中已經鑒定出56種ATXN3的剪接體，其中20種可能被翻譯成功能性Ataxin-3蛋白[1]。最近研究指出三種結構不同的剪接體[2]，分別為Ataxin-3a和Ataxin-3c，還有一個是由Ataxin-3a的C端的外顯子10終止單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）造成的，導致過早終止密碼子突變，因此產生了兩個亞型：Ataxin-3aL（長）和Ataxin-3aS（短），這3種不同的剪接體的差異主要表現在羧基末端序列上的不同。

2?Ataxin-3蛋白結構與功能

人類Ataxin-3蛋白是在全身細胞中廣泛表達，據報道[2]最長的剪接體AT3有376個氨基酸，分子量約為42 kDa。在結構上，AT3由一個球狀的去泛素化N端Josephin結構域（JD）、一個的靈活的C端尾部、C端的兩個相互作用的泛素基序（Ubiquitin-interacting motifs，UIMs，也叫LALAL motifs和PUBs）和多谷氨酰胺（Polyglutamine，polyQ）區(qū)域構成。其中N端JD位于第1～170位氨基酸上，UIMs在第223～240和243～260位氨基酸上，多谷氨酰胺region在第296～317位氨基酸上。還有一種較短的AT3剪接變體含有373個氨基酸，不同的是在C端含有第三個UIM，這個UIM在第334～351位氨基酸上。此外，在polyQ伸展端（第283～285位氨基酸）的上游發(fā)現了一個高度保守的核酸的定位信號（nuclear localization signal，NLS），包含有17個殘基，位于第296～312位氨基酸。在這個NLS結構前有一個潛在的酪蛋白激酶Ⅱ（CK-Ⅱ）磷酸化位點（TSEE），位于第277～280位氨基酸，該位點可能與AT3進入細胞核的速度相關。而在JD之后有一個核酸輸出信號（a nuclear export signal，NES）位于第174～183位氨基酸上。除此之外，Ataxin-3還包含一些保守序列。這些區(qū)域有些已經被研究出具有重要的功能，有些區(qū)域可能具有潛在的功能還未被研究出。

不同的Ataxin-3亞型在生理水平上存在差異[2]，首先，這三種不同亞型的半衰期存在著差異，Ataxin-3aS的半衰期（12 h）比Ataxin-3c（24 h）和Ataxin-3aL（26 h）要短，降解更快。其次，這三種不同的亞型途徑降解存在著差異，Ataxin-3c和Ataxin-3aL是通過自噬（Bafilomycin A1）降解的，而Ataxin-3aS則是通過自噬和蛋白酶體途徑降解的，這一點也可以解釋Ataxin-3aS半衰期的差異。最后，各亞型的結構和定位不盡相同，Ataxin-3aL和-3aS的C端為疏水性，而Ataxin-3c的C端為親水性，含有第三個UIM。

從功能上來講，AT3是一種自發(fā)表達的去泛素化酶，在蛋白酶體蛋白降解途徑和轉錄調控中具有重要作用，直接調控泛素-蛋白酶體機制[3]。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）在真核細胞過程中起著關鍵的調節(jié)作用，包括細胞周期進展、應激反應、信號轉導、轉錄激活和DNA修復。泛素化蛋白水解途徑的作用機制是將蛋白導向蛋白酶體降解，清除多余蛋白，維持細胞蛋白正常水平。泛素活化酶（E1）、泛素偶聯(lián)酶（E2）、泛素連接酶（E3）三種蛋白串聯(lián)，共價將蛋白泛素連接到底物上，構建蛋白酶體識別所需的多聚泛素鏈。Parkin是一種環(huán)間E3連接酶，負責將泛素偶聯(lián)到底物蛋白上[4]。研究發(fā)現Ataxin-3 C端的三個UIMs（UIM1，UIM2，UIM3）可能與Parkin N端的Ubl相互作用，作為一種去泛素化酶發(fā)生相反的作用，可去除泛素[5]。最近的研究顯示，p53是ATX-3的一種新型底物，AT3通過泛素（Ub）-蛋白酶體途徑抑制p53降解，具有穩(wěn)定p53的作用，進而調節(jié)細胞凋亡的作用[6]，但是AT3調節(jié)p53的機制還未闡明。AT3能與人類同源酵母蛋白RAD23、hHR23A和hHR23BUBL相互作用，hHR23通過靶向蛋白酶體的泛素化核苷酸切除修復因子XPC/Rad4參與核苷酸切除修復通路，以及將泛素化底物向蛋白酶體遞送降解[7]。

AT3在細胞內是否必須存在可能還有爭議，在一項實驗中，培養(yǎng)的非神經元人和小鼠細胞中，使用小干擾RNA （small-interference RNA，siRNA）耗盡AT3可導致胞漿內泛素化物質積累、細胞骨架紊亂、細胞黏附喪失和細胞死亡增加[8]，同時研究發(fā)現在體外培養(yǎng)的細胞中，AT3與E3泛素連接酶芯片（E3 ubiquitin ligase CHIP）的協(xié)同作用下能輔助靶向降解芯片底物[9]。但不同的是[10]，果蠅CHIP對AT3在果蠅眼中的保護功能是不需要的，據此推斷CHIP可能不是唯一在體內泛素化Ataxin-3的E3泛素連接酶。而在另一項研究中，將編碼短發(fā)夾RNA （shRNA）的慢病毒注射入野生型大鼠的大腦，局部敲除內源性AT3并沒有顯示出任何毒性[11]。

AT3可能主要通過富含精氨酸的區(qū)域與纈氨酸蛋白（VCP）的N端部分結合[12]，參與錯誤折疊的內質網ER蛋白的降解以及應激反應，AT3-VCP/p97復合物參與協(xié)助將靶向蛋白運輸到蛋白酶體[13]。VCP將ATP水解過程中獲得的化學能轉化為機械能，對其底物施加作用力。它是一種重要的、普遍表達的蛋白，參與許多細胞過程，包括蛋白質降解[14]。研究發(fā)現干擾AT3與VCP的相互作用可延遲毒性蛋白在體內的聚集[15]。但是AT3與VCP結合能力對于其在果蠅中的作用不是必要的[16]。

AT3還可以與轉錄調控因子相互作用，參與轉錄調控，AT3可以通過與polyQ重復序列相互作用抑制組蛋白乙酰化，抑制體內轉錄。Araujo等人[17]發(fā)現在氧化應激下，ATXN3和Forkhead box O（FOXO4）轉移到細胞核，同時與Superoxide dismutase（SOD2）基因啟動子結合，增加抗氧化酶SOD2的表達。這表明Ataxin-3與轉錄因子FOXO4作為氧化應激反應的轉錄共激活因子參與氧化應激。

另外一項研究表明[18]AT3還具有保護DNA的功能，Chk1蛋白對真核細胞的基因組完整性維護和細胞存活至關重要，在DNA損傷的情況下，ATX3與Chk1相互作用，保護其不受DDB1/CUL4A或FBXO6/CUL1介導的聚泛素化和隨后退化的影響，具有促進DNA修復和檢查信號通路的作用。在長時間復制應激下，ATX3與Chk1分離，Chk1與E3連接酶結合，導致Chk1蛋白酶體降解。復制應激后，ATX3缺少會顯著降低DNA的豐度、削弱DNA的損傷反應、G2/M檢查點出現缺陷和降低細胞存活率?？傊?，這些發(fā)現揭示了ATX3可能作為Chk1的一種新泛素蛋白酶在基因組完整性維護和穩(wěn)定中有著重要作用。

AT3對維持神經元結構的穩(wěn)定是重要的，研究發(fā)現當細胞擴張時，AT3會導致培養(yǎng)神經元的樹突和突觸喪失。通過模擬AT3的磷酸化位點S12，發(fā)現此位點能逆轉這些作用[19]。Ataxin-3在體內的神經保護功能，還表現在賴氨酸殘基117（lysine residue 117，Lys-117）上，Lys-117的泛素化顯著增強了其在體外的蛋白酶活性，與僅存在Lys-117的Ataxin-3相比，未泛素化的Ataxin-3在抑制或延緩毒蛋白依賴性變性發(fā)病方面的效率明顯降低[10]。另外在亨廷頓舞蹈病的研究上也發(fā)現亨廷頓蛋白（huntingtin）新的磷酸化位點絲氨酸421（S421），抑制這個位點的磷酸化可改善polyQ誘導的毒性作用[20]。這可能說明，AT3的某些位點的功能可能具有很好的研究價值。

而AT3的病理生理特征主要表現有以下幾點[2]，突變的Ataxin-3毒性的分子機制主要表現在擴增的Ataxin-3蛋白核內堆積，誘導鈣離子釋放，使受損的蛋白降解，線粒體功能障礙、轉錄解除管制等和錯誤的折疊和聚集，引發(fā)一系列病理事件。

3?Ataxin-3基因與人類疾病

3.1?Ataxin-3與SCA3

3型脊髓小腦共濟失調（spinocerebellar ataxia，SCA3，又稱Machado-Joseph?。┦且环N常見的polyQ疾病，為常染色體顯性遺傳，逐漸發(fā)生神經退行性，最終死亡。SCA3是由ATXN3基因編碼區(qū)CAG三聯(lián)體擴增而成，CAG重復被翻譯成AT3蛋白中的polyQ牽張，經突變擴增至56～84谷氨酸后，可獲得毒性蛋白功能。這種蛋白毒性主要表現為對大腦的影響，SCA3的神經元丟失主要發(fā)生在腦干、小腦（脊髓小腦通路和齒狀核）、紋狀體、丘腦、黑質和橋核[21]。隨著時間的推移，神經細胞的丟失會導致SCA3患者的臨床癥狀，如進行性共濟失調、肌張力障礙、痙攣等各種癥狀。健康個體有10～51個CAG重復，并在疾病狀態(tài)下擴展到55～87個重復擴增的polyQ序列可以促進AT3聚集，是SCA3的致病原因。而且Ataxin-3 C端polyQ的擴張極有可能導致蛋白構象改變，進而導致結合特性改變、蛋白功能喪失、亞細胞定位、聚集改變，甚至蛋白水解裂解改變。

此外，AT3對大腦的不同分區(qū)可能功能不同，通過對大腦四個不同區(qū)域進行基因表達分析以及對小鼠的血樣樣本進行RNA測序，發(fā)現AT3在黑質的核定位最強烈，在紋狀體中突觸傳遞受到的影響最強烈，而腦干的PI-3k級聯(lián)變化最大[21]。以前的研究發(fā)現MJD中的疾病蛋白Ataxin-3被證明主要有兩種蛋白酶的底物：caspases和calpain[22]。已有研究發(fā)現calpain與Ataxin-3結合的位點可能在氨基酸D208和S256處，氨基酸在兩個裂解位點突變?yōu)樯彼?，AT3與calpain反應后被裂解，裂解產物具有聚集性和毒性[23]。這種產物的聚集性和毒性很有可能和Ataxin-3的polyQ氨基酸上的C端有關。僅過表達C端polyQ擴增的AT3導致泛素陽性聚集物大量聚集，明顯超過全長AT3的聚集，增加細胞死亡。

除此之外，其致病因素還可能與甲基化有關，研究發(fā)現[24]，與對照組相比，SCA3/MJD患者的ATXN3啟動子甲基化水平顯著升高。而且還發(fā)現早期發(fā)?。╝ge at onset，AAO）的SCA3/MJD患者和代際CAG重復不穩(wěn)定的家庭均檢測到較高的甲基化水平。而且ATXN3啟動子的第一個CpG島顯著增高的甲基化水平與代際CAG重復不穩(wěn)定性有關。最新研究顯示Karyopherin α-3（KPNA3，也稱為importin alpha-4，GeneID 3839）是脊髓小腦共濟失調的發(fā)病機制中的關鍵蛋白，它控制AT3的核定位，在SCA3小鼠中敲除KPNA3可以改善分子和行為障礙，如總活動、焦慮和步態(tài)，KPNA3在體內體外作為一個關鍵因子控制AT3的定位和聚集以及其毒性[25]。

3.2?AT3與乳腺癌

Ataxin 3與乳腺癌的增殖有關，其機制可能是作用于Krüppel-like factor 5 （KLF5）抑制p27和p21的表達[26]。這是因為先前的研究表明，在雌激素受體（ER）α-negative basal-type的乳腺癌中KLF5高度表達[27]。高KLF5 mRNA和蛋白水平對乳腺癌患者的臨床預后不利，并且KLF5通過調控p21、p27、Cyclin D1、FGF-BP、mPGES1等靶基因促進乳腺癌細胞增殖[28]。

3.3?AT3與肺癌

AT3可能還與肺癌有關[29]，在非小細胞肺癌細胞系A549中經an unbiased siRNA screen篩選后發(fā)現，有4個成員可能是參與調節(jié)tensin同源蛋白（PTEN）細胞水平的特定DUB，其中有3個是Josephin的亞家族：ATXN3、ATXN3L和Josephin domain containing 1 （JOSD1），ATXN3的缺失增加了PTEN的轉錄，進而導致細胞PTEN蛋白升高。雖然ATXN3的耗竭提高了PTEN的水平，但并不影響PTEN的轉化率，可能說明ATXN3參與的是PTEN轉錄，而與泛素化無關。而PTEN是最常見的沉默腫瘤抑制因子[30]，它的作用在于維持PI3K通路的穩(wěn)定，PI3K通路的失調是很多癌癥的致病機理。

3.4?Ataxin-3與睪丸癌

通過研究分析了53對睪丸癌（testicular cancer，TC）鄰近正常組織[31]，發(fā)現Ataxin-3的表達明顯升高。統(tǒng)計結果顯示，Ataxin-3的表達水平與疾病分期、轉移呈正相關。然后，TCam-2和Ⅰ-10細胞中過表達外源性Ataxin-3，發(fā)現Ataxin-3顯著促進細胞增殖。相反，Ataxin-3的下調抑制了TC細胞的增殖，提示Ataxin-3可能是TC中的致癌基因，Ataxin-3通過抑制抗癌基因PTEN促進睪丸癌細胞增殖。Ataxin-3抑制了PTEN的表達可能與抑制轉錄和PI3K/AKT/mTOR通路有關[29]。然而，他們發(fā)現這種效應不是通過改變PTEN蛋白的穩(wěn)定性來介導的，而是通過抑制其轉錄來介導的。Ataxin-3抑制磷酸酶和PTEN轉錄，這是一種經典的抗癌基因，可拮抗PI3K/AKT/mTOR通路。PI3K/AKT/mTOR通路被報道為調節(jié)細胞過程和腫瘤發(fā)生的重要細胞內信號通路，常因PTEN失活而被激活[30]。PTEN通過去磷酸化3-5-三磷酸肌醇（PIP3）和抑制AKT活化[32]來抑制這一通路。因此，PTEN功能的喪失將會解除這一通路的阻礙，使AKT信號通路的激活得以持續(xù)，從而導致細胞的存活和腫瘤的形成。

3.5?Ataxin-3與胃癌

AT3蛋白在胃癌中表達[33]，與突變p53的表達顯著相關，提示AT3可能與p53在胃癌發(fā)生過程中的作用有關，但其潛在的分子機制尚需進一步研究。

3.6?Ataxin-3與抗病毒

有研究報道[34]ATXN3可能是Ⅰ型IFN （IFN-Ⅰ）介導的小鼠肺原代細胞和人上皮細胞及成纖維細胞中抗病毒活性的重要陽性調節(jié)因子。然而ATXN3并不促進IFN-Ⅰ的產生，而是增強了IFN-Ⅰ介導的信號通路。ATXN3通過與組蛋白脫乙酰酶3（histone deacetylase 3，HDAC3）發(fā)生物理作用，上調HDAC3蛋白水平。ATXN3去泛素化HDAC3，從而增強HDAC3蛋白的穩(wěn)定性。ATXN3與HDAC3在物理上相互作用，去除HDAC3的多聚雙氮化鏈，從而提高細胞內HDAC3的水平和蛋白穩(wěn)定性。因此，ATXN3通過調節(jié)HDAC3促進IFN-Ⅰ介導的STAT1活化。這些發(fā)現清楚地表明，ATXN3促進IFN-Ⅰ信號通路的激活和IFN-Ⅰ介導的抗病毒防御。

3.7?Ataxin-3與肝硬化

在AT3基因（SNP數據庫PubMed）中已經發(fā)現了超過2000個SNPs， AT3 rs8021276多態(tài)性被研究出與AFB1暴露引起的肝硬化存在聯(lián)系[35]，AT3的遺傳變異通過影響AT3的表達可能參與了AFB1暴露引起的肝硬化發(fā)病的機制，據研究分析證明，AT3 rs8021276多態(tài)性與肝硬化的風險呈顯著正相關，在此基礎上排除了其他因素（如吸煙、性別、種族、飲酒、年齡等）的相互影響，且其他因素被證明并無關系。而且，AT3 rs8021276多態(tài)性與AFB1暴露相互作用能加大肝硬化風險，AT3 rs8021276能影響AFB1-DNA的數量。由此看來，AFB1-DNA作為一個重要因素可將AT3、AFB1和肝硬化這三者連接起來，雖然機制并未知曉，但從以往的研究中可以發(fā)現，這三者均與DNA的損傷有關。前期研究AT3具有抑制DNA損傷的作用[36]，并且p53作為AT3的一種新型的底物發(fā)揮著作用[34]，AFB1通過與DNA相互作用導致急性肝炎、慢性肝炎發(fā)展為肝硬化[37]，也參與p53基因的突變誘發(fā)肝癌[38]。將這兩者聯(lián)系起來，AT3 rs8021276可能作為一個調節(jié)點，通過抑制AT3蛋白的表達和它修復DNA的作用，這種機制可能與p53有關，從而加重肝損傷，導致肝硬化，但是這種可能的機制尚未被證明，只有AT3 rs8021276多態(tài)性與肝硬化的風險顯現出正相關。

4?展望

本文通過總結前期一些關于AT3的研究，淺談了它的潛在發(fā)病機制，Ataxin-3是一種重要的去泛素化酶，它參與蛋白酶體蛋白降解途徑、維持Ub循環(huán)、通過去泛素化功能調節(jié)轉錄。它的異常導致神經性病變和癌癥的發(fā)生，但與癌癥的確切機制尚不清楚。未來對于AT3的期望有三，第一，已有研究證明AT3上存在很多的底物，這種底物與AT3結合后發(fā)揮著生理上和病理上的功能，并且這些未知的底物可能導致疾病的發(fā)生，也有可能阻止疾病的進展，通過進一步研究AT3與底物水平的關系，具有重要意義。第二，AT3基因可能存在某些位點的突變，而這些突變可能與具體的疾病有關，通過逆轉AT3基因的異常突變能否阻止疾病的發(fā)生，具有重要的臨床研究價值。第三，AT3可能參與某些信號轉導通路，并作為一種重要的因子參與調控，進一步研究其上下游的調控機制具有生理學上的意義。綜上所述，AT3從蛋白和核酸水平上均具有重要的研究價值。

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（收稿日期：2019-04-11?修回日期：2019-04-25）

（編輯：潘明志）