黃酒貯藏過程中生物胺變化規(guī)律的研究

何晨怡，童琳娜，王楠，*，王偉，謝廣發(fā)，金建昌

（1.浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州310015；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所，浙江杭州320021）

生物胺是一類低分子量含氨基化合物的總稱，可看作是氨分子中1 個至3 個氫原子被烷基或芳基取代后而生成的物質(zhì)，是脂環(huán)族或雜環(huán)族的低分子量有機(jī)堿。當(dāng)人體攝入過量時，會引起頭疼、惡心、心悸、血壓變化、呼吸紊亂等過敏反應(yīng)，嚴(yán)重時可能危及生命[1]。生物胺主要有兩種合成途徑：一是通過機(jī)體細(xì)胞代謝，二是通過脫羧酶對游離氨基酸的脫羧作用[2]。食品中的生物胺主要來源于游離氨基酸在氨基酸脫羧酶作用下脫去羧基形成的產(chǎn)物，部分生物胺可經(jīng)過醛酮的胺化作用形成[1-2]。生物胺廣泛存在于富含氨基酸、蛋白質(zhì)的水產(chǎn)品[3]、肉制品[4]，尤其是發(fā)酵香腸[5]、火腿[6]、干酪[7]、黃酒、葡萄酒、啤酒等發(fā)酵加工食品[8-11]。單胺氧化酶的活性因酒精和乙醛的抑制，從而提高人體對生物胺的敏感性，降低了組胺等生物胺產(chǎn)生危害作用的劑量，因此，發(fā)酵型酒中生物胺安全性尤其是組胺限量問題備受關(guān)注。李妍等[12]研究生物胺和氨基酸含量對黃酒產(chǎn)地判別的影響，證實組胺與氨基酸密切正相關(guān)，并建立了可以區(qū)分不同產(chǎn)地黃酒的模型。王瑞等[13]研究不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中生物胺含量，發(fā)現(xiàn)各產(chǎn)區(qū)酒中腐胺和尸胺含量穩(wěn)定，亞精胺在部分樣品中未檢出。李志軍等[14]對250 種國產(chǎn)葡萄酒中8 種生物胺的組成與并分析其含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)干紅葡萄酒樣品中生物胺含量較高。

黃酒也是發(fā)酵酒之一，由于發(fā)酵酒釀造工藝的特殊性，在加工過程中氨基酸極易脫羧形成生物胺，生物胺過量尤其是組胺會危害人體健康，因此對于發(fā)酵食品有著嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)。部分國家已制定了葡萄酒中組胺限量：如澳大利亞、匈牙利和瑞士限量為10 mg/L，法國限量為8 mg/L，比利時限量為5 mg/L～6 mg/L，荷蘭限量為3 mg/L，德國限量為2 mg/L[15]?，F(xiàn)今中國對發(fā)酵食品的中生物胺均未有國家限量標(biāo)準(zhǔn)[16]，黃酒中生物胺的限量也還未有明確規(guī)定。關(guān)于不同產(chǎn)地類型的成品黃酒貯藏過程中生物胺的動態(tài)變化研究鮮見報道。因此，本試驗針對貯藏過程中黃酒中的生物胺的變化規(guī)律進(jìn)行研究，在確定黃酒中生物胺檢測方法[17-18]的基礎(chǔ)上，研究了不同類型黃酒，不同貯藏條件下5 種生物胺含量的變化規(guī)律，并利用反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（back propagation neural network，BPNN）建立黃酒貯藏過程中生物胺含量的動態(tài)模型，闡釋了黃酒貯藏過程中生物胺含量的動態(tài)變化規(guī)律，對保障黃酒的優(yōu)質(zhì)和安全具有重要的現(xiàn)實意義。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

女兒紅、西塘、香雪、上海、善釀5 種成品黃酒（各酒樣生產(chǎn)日期一致）：市售；尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺、丹磺酰氯：SIGMA-ALDRICH 試劑公司；乙腈（色譜純）：美國 TEDIA 公司；氨水（NH4OH）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜儀（FL2000）：浙江溫嶺福立分析儀器有限公司；電子分析天平（PL303）：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；智能人工氣候箱（RXM-80A）：寧波江南儀器廠；臺式高速冷凍離心機(jī)（Biofuge Prino R）：德國賀利氏公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-4）：常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；超聲波清洗儀（KQ3200E）：上海珂淮儀器有限公司；Symmetry Shield RP18 色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）：美國沃特世公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 成品黃酒取樣

5 種成品酒分別置于25、37 ℃貯存條件下，前10 d每2 d 取樣一次，后20 d 每5 d 取樣一次，共30 d。

1.3.2 高效液相法定量分析生物胺

參照陸永梅等[17]的方法，樣品以丹磺酰氯[18]衍生，流動相采用水和乙腈，高壓梯度洗脫，流速0.8 mL/min，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用MATLAB R2017b 軟件的Neural Net Fitting來建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，并驗驗證其準(zhǔn)確性。Origin Pro 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率試驗

以5 種生物胺混標(biāo)溶液進(jìn)行線性試驗，濃度分別為 2、5、10、20、40 g/mL，衍生、測定并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性回歸計算，結(jié)果見表1。

表1 HPLC 法測生物胺的線性方程、相關(guān)系數(shù)、回收率結(jié)果Table 1 Linear equation，goodness of fit and recovery of BA determined by HPLC

由表 1 可見，5 種生物胺在 2.00 mg/L～40.00 mg/L線性范圍內(nèi)呈良好線性相關(guān)，擬合優(yōu)度均大于0.995。5 種生物胺的平均回收率均在96%～104%之間，可見該方法回收率較高，可靠性強。整個貯藏過程中亞精胺和精胺均低于檢出限。

2.2 25℃貯藏過程中生物胺的含量變化規(guī)律

25 ℃貯藏條件下，5 種成品黃酒中5 種生物胺含量的變化規(guī)律見圖1～圖5。

圖1 25 ℃貯藏條件女兒紅黃酒中生物胺變化情況Fig.1 Changes of BA in Nüerhong yellow rice wine stored at 25 ℃

圖2 25 ℃貯藏條件西塘黃酒中生物胺變化情況Fig.2 Changes of BA in Xitang yellow rice wine stored at 25 ℃

圖3 25 ℃貯藏條件上海黃酒中生物胺變化情況Fig.3 Changes of BA in Shanghai yellow rice wine stored at 25 ℃

圖4 25 ℃貯藏條件香雪黃酒中生物胺變化情況Fig.4 Changes of BA in Xiangxue yellow rice wine stored at 25 ℃

圖5 25 ℃貯藏條件善釀黃酒中生物胺變化情況Fig.5 Changes of BA in Shanniang yellow rice wine stored at 25 ℃

如圖1 所示，女兒紅黃酒中檢出酪胺、尸胺、組胺，25 ℃貯藏條件下貯藏4 d 后，生物胺總含量高達(dá)28.86 mg/L，主要生物胺為酪胺，占生物胺總量85.83%；其次為尸胺，占總含量7.80%。隨貯藏時間的延長，生物胺總量呈先上升后下降復(fù)上升的趨勢。如圖2 所示，西塘黃酒中檢出生物胺為酪胺和尸胺，生物胺總含量變化不顯著，在6.51 mg/L～8.11 mg/L 范圍內(nèi)。如圖3 所示，上海黃酒檢出生物胺為酪胺和尸胺，酪胺含量在前10 d 貯藏過程中由0 mg/L 迅速升至4.00 mg/L，隨后趨于穩(wěn)定，酪胺占生物胺總量85.47%。如圖4 所示，香雪黃酒檢測中主要生物胺為尸胺，生物胺總含量變化不明顯，在0.65 mg/L～1.01 mg/L 范圍內(nèi)，貯藏至8 d 時出現(xiàn)峰值1.01 mg/L，隨后緩慢下降，30 d 時降至0.65mg/L。如圖5 所示，善釀黃酒中檢出生物胺，主要為尸胺，生物胺總含量不明顯，在0.68 mg/L～1.02 mg/L范圍內(nèi)。

25 ℃貯藏條件黃酒中生物胺總含量變化情況見圖6。

圖6 25 ℃貯藏條件黃酒中生物胺總含量變化情況Fig.6 Changes of total BA content in yellow rice wine stored at 25 ℃

如圖6 所示，女兒紅、西塘、上海黃酒生物胺總含量相對香雪、善釀黃酒中生物胺總量較高，并隨著貯藏時間的延長，呈上升趨勢。女兒紅黃酒生物胺總含量最大達(dá)28.86 mg/L。香雪、善釀黃酒中生物胺總量在0.67 mg/L～4.68 mg/L 范圍內(nèi)。

25 ℃條件下貯藏，尸胺的含量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，女兒紅黃酒中尤其顯著；酪胺在香雪、善釀黃酒中未檢出，在女兒紅、西塘、上海黃酒中的含量隨貯藏時間逐漸上升，尤其是女兒紅黃酒中的酪胺含量最高達(dá)23.35 mg/L；組胺僅在女兒紅黃酒中檢出，含量變化不顯著，在1.63 mg/L～4.03 mg/L 范圍之間。

2.3 37℃貯藏過程中生物胺的含量變化規(guī)律

37 ℃貯藏條件下，5 種成品黃酒中5 種生物胺含量的變化規(guī)律見圖7～圖11。

圖7 37 ℃貯藏條件女兒紅黃酒中生物胺變化情況Fig.7 Changes of BA in Nüerhong yellow rice wine stored at 37 ℃

圖8 37 ℃貯藏條件西塘黃酒中生物胺變化情況Fig.8 Changes of BA in Xitang yellow rice wine stored at 37 ℃

圖9 37 ℃貯藏條件上海黃酒中生物胺變化情況Fig.9 Changes of BA in Shanghai yellow rice wine stored at 37 ℃

圖10 37 ℃貯藏條件香雪黃酒中生物胺變化情況Fig.10 Changes of BA in Xiangxue yellow rice wine stored at 37 ℃

圖11 37 ℃貯藏條件善釀黃酒中生物胺變化情況Fig.11 Changes of BA in Shanniang yellow rice wine stored at 37 ℃

如圖7 所示，女兒紅黃酒主要檢出酪胺、尸胺、組胺，均隨貯藏時間的延長而上升，在貯藏30 d，生物胺總量高達(dá)18.63 mg/L，主要生物胺為酪胺，占生物胺總量71.18%；其次為尸胺，占總含量20.56%。如圖8 所示，西塘黃酒中檢出生物胺為酪胺和尸胺，酪胺含量隨貯藏時間的延長而上升，尸胺含量隨著貯藏時間的延長而下降，在貯藏25 d，生物胺總量出現(xiàn)峰值3.64 mg/L，主要生物胺酪胺占總量82.42%。30 d 時生物胺總量降低至3.56 mg/L。如圖9 所示，上海黃酒檢出生物胺為尸胺，酪胺未檢出。尸胺的初始含量為0.95 mg/L，隨貯藏時間的延長而含量減少。如圖10 所示，香雪黃酒檢出主要生物胺為尸胺，生物胺總含量變化不顯著，在0.67 mg/L～0.90 mg/L 范圍內(nèi)波動。如圖11 所示，善釀黃酒檢出主要生物胺為尸胺，生物胺總含量變化不顯著，在0.65 mg/L～0.82 mg/L 范圍內(nèi)波動。

37 ℃貯藏條件黃酒中生物胺總含量變化情況見圖12。

圖12 37 ℃貯藏條件黃酒中生物胺總含量變化情況Fig.12 Changes of total BA content in yellow rice wine stored at 37 ℃

如圖12 所示，女兒紅、西塘黃酒中生物胺總含量呈上升趨勢，其中女兒紅黃酒生物胺總含量上升顯著，檢出最大值為18.63 mg/L。香雪、善釀黃酒中生物胺總含量較低，但均存在上升趨勢。隨著貯藏時間的延長，女兒紅黃酒中尸胺在貯藏15 d 時由1.22 mg/L上升至3.53 mg/L，其余黃酒不顯著下降；酪胺在香雪、上海、善釀黃酒中未檢出，在女兒紅、西塘黃酒中上升趨勢明顯，尤其是女兒紅黃酒中由1.94 mg/L 上升至13.26 mg/L；組胺僅在女兒紅黃酒中檢出，含量變化不顯著，在0.04 mg/L～1.55 mg/L 范圍之間。

黃酒釀造是一個開放式的多菌種參與過程，各黃酒釀造工藝存在差異，其中微生物可能含有氨基酸脫羧酶基因，這些脫羧酶即使在細(xì)胞死亡后仍具有活性，可以作用于氨基酸從而生成生物胺[19]。由于各類黃酒中微生物的差異，致使不同黃酒的生物胺含量有所差別。黃酒滅菌主要采用柜式滅菌器、薄板式熱交換器、列管式熱交換器[20]。酒種不同，加熱方式各有不同，殺菌溫度過高會導(dǎo)致黃酒酒精度下降、口感破壞，故滅菌溫度集中在80 ℃～100 ℃，殺菌時間控制在8 s 左右，因此在煎酒過程很難做到完全滅菌。

由于黃酒的釀造工藝存在差異[21]，所以不同黃酒中生物胺的種類有很大不同[22]。參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 13662-2018《黃酒》[23]依據(jù)含糖量對黃酒的分類，女兒紅、西塘、上海屬于半干型黃酒，善釀為半甜型黃酒，香雪為甜型黃酒。善釀、香雪黃酒的制作工藝類似，在釀造中均使用其他成品酒代替水作為原料。目的都是為了抑制微生物的糖化發(fā)酵，故兩種黃酒生物胺含量隨時間變化趨勢相似。女兒紅、西塘、上海黃酒為半干型黃酒，糖分大都已經(jīng)轉(zhuǎn)化為酒精，只含有少量糖分，但由于其原料、釀造曲種不同[24-25]，其在貯藏過程中生物胺含量變化趨勢存在差異。說明，黃酒的生產(chǎn)工藝及貯藏條件均會影響產(chǎn)品生物胺的含量。

2.4 基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)對黃酒中生物胺含量預(yù)測研究

本研究旨在使用MATLAB R2017b 仿真APP 中的Neural Net Fitting 建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)來預(yù)測黃酒貯存中的生物胺含量。由于不同種類酒的糖度不同，進(jìn)而導(dǎo)致的生物胺的含量存在不同，構(gòu)建時按酒的分類進(jìn)行擬合，采用的是糖度為15 g/L～40 g/L 的半干酒樣：西塘、上海、女兒紅黃酒。

經(jīng)測試得隱層神經(jīng)元個數(shù)為23 時，相對誤差能達(dá)到10-10，個別樣本相對誤差達(dá)到150%，故選用23 個神經(jīng)元來設(shè)置隱藏層。半干酒樣預(yù)測誤差分析與對比驗證見圖13～圖14。

圖13 誤差分析Fig.13 Error analysis

如圖13～圖14 所示，通過誤差分析和比對驗證可知，此神經(jīng)曲線適用于本試驗且準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

圖14 比對驗證Fig.14 Contrast verification

本試驗探究了不同貯藏條件下黃酒中生物胺的變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明，37 ℃與25 ℃貯藏條件下，黃酒中生物胺的變化趨勢一致。成品酒在25 ℃條件下貯藏，尸胺的含量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢，女兒紅黃酒中尤其顯著；酪胺在香雪、善釀黃酒中未檢出，在女兒紅、西塘、上海黃酒中的含量隨貯藏時間逐漸上升，尤其是女兒紅黃酒中酪胺含量最高達(dá)23.35 mg/L；組胺僅在女兒紅黃酒中檢出，含量變化不顯著，在1.63 mg/L～4.03 mg/L 范圍之間。37 ℃貯藏條件下，尸胺的含量隨著貯藏時間的延長呈下降趨勢；酪胺在香雪、上海、善釀黃酒中未檢出，在女兒紅、西塘黃酒中上升趨勢明顯，尤其是女兒紅黃酒中由1.94 mg/L上升至13.26 mg/L；組胺僅在女兒紅黃酒中檢出，含量變化不顯著，在0.04 mg/L～1.55 mg/L 范圍之間。本試驗檢測的生物胺總量范圍在0.54 mg/L～28.86 mg/L，研究結(jié)果對黃酒生物胺含量的安全評價提供數(shù)據(jù)支持。本試驗所得BP 神經(jīng)擬合曲線準(zhǔn)確性與精準(zhǔn)性較高，線性回歸相關(guān)系數(shù)R2為0.962 58，所得曲線對黃酒釀造貯藏過程中生物胺的預(yù)測有一定的輔助意義。