響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌MX-6產(chǎn)納豆激酶發(fā)酵條件

滿麗莉，向殿軍

（1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042；2.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼028042）

2008年世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示，每年有1730萬人死于心血管疾病，占全球年死亡總數(shù)的30%。血栓形成是導(dǎo)致心血管疾病的主要原因，其發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，目前臨床使用的纖溶酶（如尿激酶、鏈激酶、組織纖溶酶原激活劑）具有成本過高和不良副作用等限制，因此開發(fā)有效性和特異性高的纖溶藥物亟待解決[1-3]。納豆激酶是一種具有廣闊發(fā)展前景的絲氨酸蛋白酶，主要原因在于：①纖溶活性強(qiáng)，活性是纖溶酶的4 倍；②具有激活纖溶酶原活性和直接降解纖維蛋白的雙重功能；③成本低、安全性高；④來源廣泛。因此，納豆激酶的研究備受國內(nèi)外研究人員的關(guān)注[4-6]。

發(fā)酵條件優(yōu)化對(duì)生物工藝開發(fā)、性能改善和工業(yè)化應(yīng)用發(fā)揮至關(guān)重要的作用。發(fā)酵條件可通過傳統(tǒng)或統(tǒng)計(jì)方法來優(yōu)化，傳統(tǒng)方法通常一次改變一個(gè)自變量，而將其他變量固定在一個(gè)水平上，此方法較為耗時(shí)，往往不易獲得最優(yōu)條件，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)方法可消除傳統(tǒng)方法的局限性，能降低試驗(yàn)次數(shù)，節(jié)省時(shí)間和資源，同時(shí)有利于分析變量之間的交互作用[7]。近年來，響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）在生物過程優(yōu)化方面得到了廣泛地應(yīng)用，RSM 是一種有效用于設(shè)計(jì)試驗(yàn)、建立模型、評(píng)估因素影響、交互作用及獲得最佳條件的統(tǒng)計(jì)方法[8]。納豆激酶的微生物發(fā)酵過程較為復(fù)雜，理解、控制和優(yōu)化發(fā)酵過程是一個(gè)關(guān)鍵步驟，通過響應(yīng)面法建模為發(fā)酵過程的分析、設(shè)計(jì)和操作提供有用的信息，建立發(fā)酵動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型成為發(fā)酵行為的首要目標(biāo)。本研究首先通過單因素試驗(yàn)，檢測(cè)溫度、初始pH 值、接種量、裝液量及搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 納豆激酶合成量的影響，再以溶圈直徑為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面法中的Box-Benhnken 設(shè)計(jì)建模，確定最佳產(chǎn)酶條件，旨在為更合理地應(yīng)用和開發(fā)納豆激酶提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌MX-6（Bacillus subtilis MX-6）由豆豉中篩選鑒定獲得。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

凝血酶（1 000 U）：中國藥品生物制品檢定所；纖維蛋白原、瓊脂糖：美國Sigma 公司；其它藥品均為國產(chǎn)分析純。

基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨2%，NaCl 0.5%，pH 7.2。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

SW-CT 型超凈工作臺(tái)：鄭州南北儀器設(shè)備有限公司；MJ-54A/MJ-78A 型STIK 滅菌鍋：北京天賜科儀商貿(mào)有限公司；BPH-9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱：濟(jì)南來寶醫(yī)療器械有限公司；Microfuge16 型離心機(jī)：美國貝克曼公司；WS-600 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：德國Wiggens 公司；DHP-600 恒溫培養(yǎng)箱：常州中捷試驗(yàn)儀器制造有限公司；110-801 型三量ip67 防水原點(diǎn)數(shù)顯卡尺不銹鋼零點(diǎn)電子游標(biāo)尺：東莞市景有模具五金有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法及優(yōu)化前發(fā)酵條件

培養(yǎng)方法：挑取枯草芽孢桿菌MX-6 接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)種子培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，37 ℃，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 12 h（OD600=1.5～1.6）。

優(yōu)化前發(fā)酵條件：將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.2 納豆激酶活力的測(cè)定

發(fā)酵液以 5 000 r/min 離心 10 min，取 10 μL 上清液用于納豆激酶活性的測(cè)定。納豆激酶活力的測(cè)定采用纖維蛋白平板法[9]，溶圈直徑采用電子游標(biāo)尺測(cè)定。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，發(fā)酵溫度分別為22、27、32、37、42 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測(cè)定納豆激酶活性。

1.2.3.2 初始pH 值對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始pH 值分別為4、5、6、7、8，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測(cè)定納豆激酶活性。

1.2.3.3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液分別按1%、2%、3%、4%、5 %接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測(cè)定納豆激酶活性。

1.2.3.4 裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于分別裝有25、50、75、100、125 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，160 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測(cè)定納豆激酶活性。

1.2.3.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響

將培養(yǎng)的菌液按5%接種于裝有50 mL 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的 250 mL 錐形瓶中，30 ℃，初始 pH 7.2，分別在 160、170、180、190、200 r/min 條件下振蕩培養(yǎng) 72 h，獲得粗酶液，按照1.2.2 的方法測(cè)定納豆激酶活性。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶發(fā)酵條件

應(yīng)用Design-Expert 軟件中的Box-Benhnken 設(shè)計(jì)構(gòu)建模型，響應(yīng)面法尋找最佳發(fā)酵條件。以溫度（A）、初始 pH 值（B）、接種量（C）、裝液量（D）、搖床轉(zhuǎn)數(shù)（E）5 個(gè)因素為自變量，溶圈直徑（mm）為響應(yīng)值，運(yùn)用五因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，共46 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中40 個(gè)為析因子，6 個(gè)為中心試驗(yàn)。試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面因素水平表Table 1 Factors and levels of the response surface methodology

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件中的One-way analysis of variance 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差。采用Design-Expert 8.0.6 軟件中Box-Benhnken 設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)納豆激酶活力的影響

溫度對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響見圖1。

圖1 溫度對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.1 Effect of temperature on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

溫度為37 ℃時(shí)，納豆激酶活性最大，溶圈直徑可達(dá)（18.23±0.17）mm。溫度為22 ℃或42 ℃產(chǎn)酶活性均較低，22 ℃菌體生長(zhǎng)較緩慢，42 ℃菌體生長(zhǎng)迅速，但提早進(jìn)入衰亡期，近而影響納豆激酶的合成量。

2.2 初始pH值對(duì)納豆激酶活力的影響

初始pH 值對(duì)枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖2。

圖2 初始pH 對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.2 Effect of initial pH on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

初始pH 值為7.0 時(shí)，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達(dá)（18.19±0.32）mm，表明枯草芽孢桿菌MX-6適宜產(chǎn)酶條件為近中性。當(dāng)初始pH 值為4 或8 時(shí)產(chǎn)酶活性均較低，說明酸性或堿性條件不利于納豆激酶的合成，可能是培養(yǎng)基中的H+或OH-會(huì)改變菌體內(nèi)納豆激酶的活力和結(jié)構(gòu)所導(dǎo)致的。

2.3 接種量對(duì)納豆激酶活力的影響

接種量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖3。

圖3 接種量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由圖3 可知，接種量為3%時(shí)，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達(dá)（17.57±0.14）mm。接種量過大（5%）會(huì)使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)快速消耗，接種量過小（1%）會(huì)影響菌體內(nèi)某些輔酶和維生素的擴(kuò)散，均不利于酶的合成。

2.4 裝液量對(duì)納豆激酶活力的影響

裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖4。

由圖4 可知，裝液量為50 mL 時(shí)，納豆激酶的活性最大?？莶菅挎邨U菌MX-6 為需氧菌，裝液量過大（125 mL）會(huì)使溶氧量過低，裝液量過小（25 mL），由于發(fā)酵中水分蒸發(fā)易導(dǎo)致菌體提早衰亡，不利于納豆激酶的工業(yè)化生產(chǎn)。

圖4 裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.4 Effect of liquid medium volume on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

2.5 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)納豆激酶活力的影響

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)枯草芽孢桿菌MX-產(chǎn)納豆激酶的影響見圖5。

圖5 搖床轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 產(chǎn)納豆激酶的影響Fig.5 Effect of shaker speed on nattokinase production in Bacillus subtilis MX-6

由圖5 可知，搖床轉(zhuǎn)速為170 r/min 時(shí)，納豆激酶的活性最大，溶圈直徑可達(dá)（16.37±0.18）mm。適宜的搖床轉(zhuǎn)速能提高溶氧量，有利于枯草芽孢桿菌MX-6的生長(zhǎng)及納豆激酶合成。

2.6 響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶的發(fā)酵條件

2.6.1 模型建立及顯著性分析

以溶圈直徑為響應(yīng)值，運(yùn)用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)46 組試驗(yàn)。Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiment design and results of BBD

續(xù)表2 Box-Benhnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 2 Experiment design and results of BBD

二次回歸模型為：Y=-450.691 52+4.272 02A+16.533 75B+5.890 37C+0.116 07D+3.808 16E+7.500 00×103AB-5.000 00×104AC+ 1.000 00×104AD-5.000 00×105AE+1.293 41×1014BC+2.000 00×104BD-2.500 00×104BE-2.700 00×103CD+2.500 00×104CE+1.200 00×104DE-0.058 858A2-1.208 13B2-0.953 96C2-1.367 67×103D2-0.011 206E2。

對(duì)二次回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

表3 二次模型的方差分析Table 3 Analysis of variance（ANOVA）for the quadratic model

該模型的P＜0.01，表明試驗(yàn)所采取的二次模型極顯著。失擬項(xiàng)的P=0.087 8＞0.05，模型失擬項(xiàng)不顯著，決定系數(shù)=0.999 5，表明模型與實(shí)際情況擬合較好，可應(yīng)用該模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)和分析。模型中A、B、C、D、AB、CD、A2、B2、C2、D2、E2的 P＜0.01，表明對(duì)納豆激酶合成量的影響極顯著。DE 的P＜0.05，表明對(duì)納豆激酶合成量的影響顯著。交互項(xiàng) AC、AD、AE、BC、BD、BE、CE 的P＞0.05，說明這些交互作用對(duì)納豆激酶合成量無顯著性影響。

2.6.2 響應(yīng)面分析

優(yōu)化條件下的3D 響應(yīng)面圖見圖6。

圖6 優(yōu)化發(fā)酵條件下的3D 響應(yīng)面圖Fig.6 3D response surface curve under optimal fermentation conditions

各因素的變化范圍分別為溫度（32 ℃～42 ℃），初始pH 值（6～8），接種量（2%～4%），裝液量（25 mL～75 mL），搖床轉(zhuǎn)速（160 r/min～180 r/min）。在分析兩因素之間的交互作用時(shí)，其中一個(gè)因素固定，隨著另一個(gè)因素的增加，納豆激酶的合成量均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)。優(yōu)化發(fā)酵條件為溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03%、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min。預(yù)測(cè)的溶圈直徑為20.62 mm。

2.6.3 回歸模型的驗(yàn)證試驗(yàn)

為檢驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性，采用優(yōu)化發(fā)酵條件（溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03 %、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。實(shí)際溶圈直徑為（20.71±0.18）mm，與預(yù)測(cè)的溶圈直徑20.62 mm 相比較差異不顯著（P＞0.05），表明該模型可靠性好。與優(yōu)化前的溶圈直徑（15.28±0.13）mm 相比，溶圈直徑提高了35.54%，可見該模型能較好地預(yù)測(cè)納豆激酶的合成情況。

3 結(jié)論

納豆激酶具有成本低、活性高、安全無毒等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)[10-11]。增加納豆激酶合成量的主要方法包括：篩選納豆激酶高產(chǎn)菌株；優(yōu)化發(fā)酵條件或培養(yǎng)基；誘變育種。由于枯草芽孢桿菌在非適宜條件下極易形成休眠體-芽孢，導(dǎo)致納豆激酶的合成終止，優(yōu)化發(fā)酵條件是顯著提高納豆激酶合成量的有效方法之一[3，12]。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法綜合分析發(fā)酵條件對(duì)枯草芽孢桿菌MX-6 合成納豆激酶的影響，優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為：溫度36.69 ℃、初始pH 6.94、接種量3.03%、裝液量48.77 mL、搖床轉(zhuǎn)速170.05 r/min。優(yōu)化發(fā)酵條件下溶圈直徑可高達(dá)20.71 mm，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值相比差異不顯著，表明構(gòu)建模型的可行性和可靠性，通過響應(yīng)面法優(yōu)化納豆激酶最佳發(fā)酵條件具有科學(xué)性和準(zhǔn)確性，有利于納豆激酶作為新型溶栓藥物和功能性食品添加劑的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。