基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序分析市售咸鰳魚中微生物多樣性

毛海萍，袁開，金仁耀，3，馮俊麗，3，戴志遠(yuǎn)，3，吳佳佳，3，*

（1.浙江工商大學(xué)海洋食品研究院，浙江杭州310012；2.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310018；3.浙江省水產(chǎn)品加工技術(shù)研究聯(lián)合重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州310012）

咸鰳魚是浙東地區(qū)的傳統(tǒng)腌魚制品，因其肉質(zhì)鮮美且具獨(dú)特的“霉”香味而備受當(dāng)?shù)鼐用竦南矏?。其加工是以新鮮鰳魚為原料，不去除魚鱗、魚鰓及內(nèi)臟，經(jīng)3 次加鹽腌制而成，加鹽量通常在30%～50%。腌魚生產(chǎn)過程實(shí)質(zhì)上是一個(gè)復(fù)雜微生態(tài)體系在人為控制鹽度、發(fā)酵溫度、濕度條件下，使微生物群落結(jié)構(gòu)及功能趨于人們期望的方向演化的過程。來自魚體的內(nèi)源酶加之微生物分泌的各類外源蛋白酶、脂肪酶等將魚體內(nèi)大分子逐級(jí)降解，形成了腌魚產(chǎn)品獨(dú)特的風(fēng)味[1-2]。與此同時(shí)，腌制水產(chǎn)品中的生物胺的積累也主要是由微生物引起的游離氨基酸脫羧而產(chǎn)生[3]。復(fù)雜的微生物活動(dòng)與生化反應(yīng)既決定了產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)，同時(shí)也直接影響著產(chǎn)品的安全[4]。明確咸鰳魚產(chǎn)品中微生物群落構(gòu)成對(duì)揭示其風(fēng)味形成機(jī)理和評(píng)價(jià)產(chǎn)品安全性都有重要意義。

研究人員基于傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)，乳酸菌是許多低鹽腌制發(fā)酵水產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)菌；葡萄球菌則在高鹽腌制水產(chǎn)品中是優(yōu)勢(shì)菌；在添加大米等淀粉質(zhì)原料或其他輔料的發(fā)酵魚生產(chǎn)中，芽孢桿菌、酵母菌或霉菌也可能成為數(shù)量較多的優(yōu)勢(shì)菌[5-6]。例如，Dai 等[7]從臭鱖魚中分離到61 株乳酸菌，其中清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）是優(yōu)勢(shì)菌株。Guan 等[8]發(fā)現(xiàn)韓國傳統(tǒng)發(fā)酵水產(chǎn)品Saeu-jeot 中葡萄球菌是優(yōu)勢(shì)菌。Zhang等[9]對(duì)高鹽腌制大黃魚中微生物進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)，葡萄球菌是其發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌。酸魚發(fā)酵過程中，植物乳桿菌、戊糖片球菌、木糖葡萄球菌、釀酒酵母是重要的優(yōu)勢(shì)菌[10]。

然而，基于分離培養(yǎng)的研究技術(shù)對(duì)不可培養(yǎng)菌及苛求菌的探究存在較大的局限性，免培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)恰能彌補(bǔ)這一缺陷、更加全面地揭示腌制水產(chǎn)品中微生物的群落結(jié)構(gòu)。Roh 等[11]借助條形碼焦磷酸測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)海產(chǎn)品腌制過程中，微生物多樣性和復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出預(yù)期，嗜鹽古生菌和泉古門細(xì)菌等古細(xì)菌，魏斯氏菌、乳桿菌等厚壁菌門細(xì)菌、γ-變形菌綱及-變形菌綱細(xì)菌是高鹽腌制海洋發(fā)酵水產(chǎn)品中的優(yōu)勢(shì)微生物。Song[12]基于16S rDNA V1/V2 可變區(qū)測(cè)序，對(duì)不同原料生產(chǎn)的韓國腌制水產(chǎn)品jeotgal 中的微生物群落結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門細(xì)菌占據(jù)比例高達(dá)67.7%，其余則以變形菌門細(xì)菌為主。在以鳀魚為原料腌制的 jeotgal 中嗜鹽四鏈球菌（Tetragenococcus halophilus）和鹽水四聯(lián)球菌（T.muriaticus）是優(yōu)勢(shì)微生物；彎曲乳桿菌（Lactobacillus sakei）和高麗魏斯氏菌（Weissella koreensis）則是以海鞘為原料腌制jeotgal 中的優(yōu)勢(shì)菌。隨著測(cè)序技術(shù)成本降低，高通量測(cè)序已在干酪、泡菜、豆醬等多種傳統(tǒng)發(fā)酵食品微生物群落研究中得到應(yīng)用。

本研究基于分離培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)市售咸鰳魚中可培養(yǎng)微生物進(jìn)行分離鑒定，并評(píng)估可培養(yǎng)微生物產(chǎn)生物胺基因及抗生素抗性基因攜帶情況。同時(shí)，采用Illu mina MiSeq 平臺(tái)對(duì)不同來源市售咸鰳魚細(xì)菌16S rDNA V4 可變區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序，以期更加全面地揭示咸鰳魚產(chǎn)品中微生物多樣性及菌相結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果將對(duì)科學(xué)評(píng)價(jià)自然發(fā)酵咸鰳魚發(fā)酵微生物安全性、進(jìn)一步揭示發(fā)酵微生物對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味形成的貢獻(xiàn)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咸鰳魚：購于舟山、寧波、杭州蕭山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，各采集2 種樣品，依次編號(hào)為A（腌制 90 d，25 ℃開放腌制）、B（-18 ℃凍藏）、C（室溫 22 ℃攤放）、D（室溫22 ℃攤放）、E（室溫 22 ℃攤放）、F（室溫 22 ℃攤放）。除舟山市場(chǎng)采集的A 樣品為商販自制咸鰳魚外，其余產(chǎn)品均為東南亞進(jìn)口咸鰳魚。

2216E 培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒：北京莊盟生物科技有限公司；E.Z.N.A.Stool DNA Kit、Taq DNA 聚合酶、DL2000 Marker：TaKaRa寶成試劑有限公司。

1.2 主要儀器

超凈工作臺(tái)SW-CJ-1CU、蒸汽壓力滅菌鍋YXQSG46-280SA：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；高速冷凍離心機(jī)5810R：英國艾本德公司；超微量分光光度計(jì)MN-913、高速聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀A24811：美國賽默飛世爾公司；凝膠電泳系統(tǒng)Tanon EPS600、凝膠成像系統(tǒng)Tanon 4200：上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 微生物的計(jì)數(shù)、分離與鑒定

采集鰳魚鰓后部、背部及腹部肉，剪碎混勻。同種樣品挑選體態(tài)大小一致、個(gè)體完整的3 尾魚，將其魚肉混勻，稱取25 g 魚肉樣品至含225 mL 生理鹽水的錐形瓶中，震蕩混勻后制備梯度稀釋液，并涂布于2216E培養(yǎng)基。選擇適宜的稀釋度進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，并隨機(jī)挑取40 個(gè)菌落，純化2 次～3 次后，接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)24 h～48 h，制備30 %的甘油菌液，-80 ℃凍藏備用。

取2216E 肉湯活化好的菌液2 mL，按照試劑盒說明書操作，提取菌株基因組DNA。參考袁開等[13]方法，對(duì)分離菌株16S rDNA 序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列于GenBank 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析，部分序列結(jié)果提交至NCBI Genebank 數(shù)據(jù)庫。

1.3.2 氨基酸脫羧酶基因擴(kuò)增

以分離菌株基因組DNA 為模板，對(duì)組氨酸脫羧酶（hdc）基因、鳥氨酸脫羧酶（odc）基因及賴氨酸脫羧酶基因（ldc）進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列如表1 所示。

擴(kuò)增體系及條件參考Jaw[14]、De[15]。1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

表1 氨基酸脫羧酶基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers of amino acid decarboxylase gene

1.3.3 耐藥基因擴(kuò)增

以分離菌株基因組DNA 為模板，對(duì)耐藥基因sul1、gryA、tetA 及 int1 進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表2。

擴(kuò)增體系及條件參考袁開等[13]。1%瓊脂糖凝膠凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.3.4 16S rDNAV4 區(qū)PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

稱取10 g 混勻的魚肉樣品，加入90 mL 無菌生理鹽水，充分震蕩均勻后，2 000 r/min，離心10 min，收集上清；10 000 r/min，離心10 min 收集菌體沉淀。

表2 耐藥基因擴(kuò)增引物Table 1 Primers of antibiotic resistance gene

根據(jù)barcode 信息對(duì)測(cè)序獲得的雙端數(shù)據(jù)進(jìn)行拆分；根據(jù)雙端序列的overlap 關(guān)系，將序列拼接（merge）成長的tag，去除barcode 和引物序列，過濾嵌合體，獲得clean data。通過操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）聚類分析，獲得不同樣品中OTU 豐度，評(píng)估每個(gè)樣品中微生物的多樣性，包括對(duì)樣品中含有OTU 數(shù)目（豐富度）和群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（均勻度）計(jì)算和評(píng)估。根據(jù)每個(gè)OTU 代表序列與16S rRNA數(shù)據(jù)庫（RDP 和NT-16S）比對(duì)結(jié)果，對(duì)OTU 進(jìn)行物種分類統(tǒng)計(jì)，獲得不同分類水平物種豐度，討論市售咸鰳魚中微生物多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

PCR 試驗(yàn)均重復(fù)3 次。使用Origin 8.5 軟件繪制咸鰳魚樣品中優(yōu)勢(shì)菌門水平及屬水平柱狀圖，并用R 語言依據(jù)屬水平差異對(duì)不同樣品進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 咸鰳魚樣品微生物分離及分離菌株16S rDNA測(cè)序鑒定

采用2216E 培養(yǎng)基對(duì)各樣品中可培養(yǎng)微生物進(jìn)行了計(jì)數(shù)與分離，咸鰳魚樣品在2216E 培養(yǎng)基上的菌落數(shù)量集中分布于4.9 log CFU/100 g～5.2 log CFU/100 g。每組樣品隨機(jī)挑取40 個(gè)菌落，經(jīng)兩次純化后，從A、C、D、E、F 組樣品中共分離到151 株可培養(yǎng)菌（B 組樣品微生物傳代后均未生長）。分離菌株經(jīng)過提取基因組、擴(kuò)增獲得16S rDNA 序列，測(cè)序結(jié)果經(jīng)與美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫比對(duì)分析，將其鑒定至種、屬水平，具體結(jié)果見表3。將部分序列提交至Genebank數(shù)據(jù)庫，獲取序列編號(hào)為MK205156～MK205178。

本研究從咸鰳魚分離到的微生物，包括14 個(gè)屬和23 個(gè)種，根據(jù)NCBI 比對(duì)的結(jié)果，19 株被鑒定至屬水平，其余132 株均被鑒定至種水平，其中150 株為細(xì)菌，1 株為放線菌。分離菌株中數(shù)量最多的3 種屬分別是：芽孢桿菌屬，98 株，占比64.90%；其次為葡萄球菌屬，20 株，占比 13.25%；嗜冷桿菌屬細(xì)菌，13 株，占比8.61%。A、D、E、F 組樣品中可培養(yǎng)菌群均以芽孢桿菌屬菌為主，其中A 組和F 組的芽胞桿菌屬占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，分別占其分離菌株總數(shù)的96.30%和97.14%，微生物多樣性較之其他組單一；D 組以芽孢桿菌分離菌株為主共18 株，占66.67%，葡萄球菌共5 株，占18.52%；E 組樣品中除11 株屬于芽孢桿菌外，其余15 株菌隸屬于8 個(gè)不同的屬，微生物種類多樣性豐富。C 組樣品分離菌株以葡萄球菌屬和嗜冷桿菌屬細(xì)菌為主，兩者分別為14 株和12 株，共占該組分離菌株總數(shù)的72.22%。

表3 咸鰳魚可培養(yǎng)細(xì)菌分布情況Table 3 Distribution of culturable bacteria in salted Chinese herring

芽孢桿菌屬是一類廣泛分布在土壤和水圈中的細(xì)菌，在海洋環(huán)境中有大量分布。市售咸鰳魚中的芽孢桿菌屬細(xì)菌，可能來源于鰳魚自身的生存環(huán)境，也可能在加工或保藏中混入。通常情況下，添加米飯等淀粉質(zhì)原料的發(fā)酵魚制品生產(chǎn)中，芽孢桿菌屬細(xì)菌會(huì)成為優(yōu)勢(shì)菌，并且具有較為豐富的多樣性[10，19]。在高鹽腌制海產(chǎn)品中，枯草芽孢桿菌僅可能少量存在于產(chǎn)品中[8]。A、D、E、F 組樣品中，枯草芽孢桿菌數(shù)量占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。咸鰳魚加工原料中未加入淀粉質(zhì)原料，且加鹽量達(dá)魚體重的30%～50%，因此，大量的芽孢桿菌可能來源于生產(chǎn)后的貯藏或運(yùn)輸中。

通常情況下，魚體攜帶的葡萄球菌數(shù)量非常有限，但在腌魚生產(chǎn)過程中，高鹽環(huán)境和優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)底物成為了葡萄球菌良好的棲息地。本研究從市售咸鰳魚中共分離出11 株腐生葡萄球菌、1 株木糖葡萄球菌、5 株松鼠葡萄球菌和3 株尼泊爾葡萄球菌。這些凝固酶陰性（coagulase-negative staphylococci，CNS）的葡萄球菌屬成員能夠代謝產(chǎn)生大量的蛋白酶和脂肪酶，在肉品發(fā)酵過程中對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味形成起重要作用。其中，馬胃葡萄球菌（S.equorum）、木糖葡萄球菌和腐生性葡萄球菌是地中海地區(qū)自然發(fā)酵香腸中常見優(yōu)勢(shì)凝固酶陰性葡萄球菌[20-21]。木糖葡萄球菌也是酸魚發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)葡萄球菌，許多菌株具備工業(yè)化發(fā)酵肉制品生產(chǎn)發(fā)酵劑的許多特性[19]。

除上述數(shù)量較多的種屬外，嗜冷菌屬、鹽水球菌屬、橙色鯊魚球菌、副球菌、微黃短桿菌等棲息于水體環(huán)境中的微生物也存在于市售咸鰳魚中。此外，咸鰳魚體內(nèi)還分布有少量的機(jī)會(huì)致病菌，如克氏庫克菌屬細(xì)菌，以及致病力較低但耐藥性強(qiáng)的綠膿桿菌。

2.2 氨基酸脫羧酶基因擴(kuò)增結(jié)果分析

為了更好的評(píng)價(jià)咸鰳魚攜帶微生物的安全性，研究小組分析了分離微生物對(duì)與組胺、腐胺和尸胺3 種常見生物胺產(chǎn)生相關(guān)的氨基酸脫羧酶基因——組氨酸脫羧酶基因（hdc），鳥氨酸脫羧酶基因（odc）和賴氨酸脫羧酶基因（ldc）的攜帶情況。

分別對(duì)151 株菌進(jìn)行氨基酸脫羧酶基因擴(kuò)增，其中，132 株攜帶組氨酸脫羧酶基因（hdc），70 株菌攜帶鳥氨酸脫羧酶基因（odc）、68 株攜帶賴氨酸脫羧酶基因（ldc）。3 種氨基酸脫羧酶基因均獲得單一并且與目標(biāo)條帶大小相符的條帶，部分結(jié)果見圖1。5 種咸鰳魚分離微生物的氨基酸脫羧酶基因分布情況見表4。

圖1 部分菌株氨基酸脫羧酶基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amino acid decarboxylase gene amplicons

表4 分離菌株氨基酸脫羧酶基因分布情況Table 4 Distribution of amino acid decarboxylase gene in the isolates

咸鰳魚中132 株分離菌株攜帶組氨酸脫羧酶基因，占比高達(dá)87.42%；鳥氨酸脫羧酶基因和賴氨酸脫羧酶基因的攜帶菌株量基本一致，占比分別為46.36%和45.03%。氨基酸脫羧酶催化脫去其對(duì)應(yīng)氨基酸上的羧基，生成相應(yīng)的生物胺。組胺、尸胺和腐胺分別是組氨酸、賴氨酸和鳥氨酸在其相應(yīng)脫羧酶作用下生成的生物胺，是魚類腐敗過程中常見的幾種生物胺，也是發(fā)酵魚制品中容易超標(biāo)的幾種生物胺。其中，組胺是常見生物胺當(dāng)中毒性最強(qiáng)的一種，當(dāng)機(jī)體攝入組胺超過100 mg/kg 時(shí)，即可引起過敏性食物中毒[22]。盡管腐胺，精胺，亞精胺和尸胺對(duì)人體健康沒有嚴(yán)重的不良影響，但它們可與亞硝酸鹽反應(yīng)形成致癌物亞硝胺；同時(shí)，腐胺和尸胺能夠通過抑制組胺代謝酶如單胺或二胺氧化酶和組胺甲基轉(zhuǎn)移酶來增強(qiáng)組胺毒性[21]。

盡管細(xì)菌基因組中攜帶氨基酸脫羧酶基因與其表達(dá)沒有直接的聯(lián)系，但市售咸鰳魚分離菌株中較高比例氨基酸脫羧酶基因的存在是其生產(chǎn)或貯藏過程中的一種潛在風(fēng)險(xiǎn)。本研究小組前期對(duì)腌制咸鰳魚過程中產(chǎn)組胺菌進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)71.88%發(fā)酵菌株具有產(chǎn)生物胺的能力，其攜帶組氨酸脫羧酶的基因型和產(chǎn)組胺代謝表型基本一致[23]。

2.3 耐藥基因擴(kuò)增結(jié)果分析

對(duì)分離菌株基因組進(jìn)行耐藥基因（sul1、gryA、tetA及int1）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示有18 株菌含有磺胺類耐藥基因sul1，16 株菌含有諾氟沙星類耐藥基因gryA，未檢測(cè)到含有四環(huán)素類耐藥基因tetA 或整合子基因int1 的菌株。咸鰳魚中可培養(yǎng)微生物的耐藥基因分布處于較低的水平。

2.4 16S rDNA V4高通量測(cè)序的咸鰳魚細(xì)菌菌群分析

按照97%序列相似度將測(cè)序序列聚類成為OTUs，得到每個(gè)cluster 的序列百分比及其代表序列（即為OTU），去冗余后，用于統(tǒng)計(jì)每個(gè)OTU 序列和豐度進(jìn)行下游分析。根據(jù)物種豐度表和物種注釋表，選取豐度最高的20 個(gè)物種分類進(jìn)行相對(duì)豐度計(jì)算，獲得相對(duì)豐度文件，繪制樣品豐度比較的堆疊柱狀圖。本研究中樣品的物種在門和屬水平（含量前20）的分類見圖2及圖3。

圖2 咸鰳魚微生物門水平樣品物種豐度柱狀圖Fig.2 Relative abundance of bacterial community in salted Chinese herring at the phylum level

圖3 咸鰳魚微生物屬水平樣品物種豐度柱狀圖Fig.3 Relative abundance of bacterial community in salted Chinese herring at the genus level

由圖2 可見，在門水平上，厚壁菌門（Firmicutes）是市售咸鰳魚中主要優(yōu)勢(shì)微生物，除樣品A 外，其余樣品厚壁菌門細(xì)菌相對(duì)含量均高于75%，而B、E 組樣品中，厚壁菌門的相對(duì)含量均高達(dá)95%以上。變形菌門（Proteobacteria）是厚壁菌門外另一類數(shù)量相對(duì)較多的微生物，樣品C、D、F 組的微生物種類分布較為相似，厚壁菌門微生物在80%～90%之間，變形菌門微生物在10%～20%之間。Park 等[24]用宏基因組測(cè)序技術(shù)，研究了不同發(fā)酵食品中的微生物群落，其中在蝦類發(fā)酵水產(chǎn)品中，主要微生物群落同樣為厚壁菌和變形菌門。

樣品A 中微生物雖然同樣以厚壁菌門（50.33%）和變形菌門（28%）微生物為主，但該組中還含有比例較高的寬廣古細(xì)菌門微生物（21.67%），與其他樣品組微生物組成存在明顯的差異。A 組樣品為商家自行腌制90 d 的咸鰳魚，腌制成熟后于25℃條件下存放，未經(jīng)長時(shí)間的冷凍貯藏，與其他樣本本身存在較大的差異。除此以外，少量的擬桿菌門（Bacteroidtes）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）及未分類細(xì)菌（Bacteria unclassified）也存在于各類市售咸鰳魚樣品中。

采用Bray-Curtis 比較樣品間屬水平細(xì)菌多樣性差異，由圖3 可知，各組樣品中微生物分布在屬水平上差異較大，其中C、D 組樣品的微生物分布較為相似，E、F 組樣品微生物分布較為相似，A、B 組樣品各自呈現(xiàn)出不同的多樣性，且與其他樣品組差異較大，且樣品A 中微生物多樣性最為豐富。

A 組樣品中主要以堿桿菌屬（Alkalibacillus）、嗜鹽古生菌（Natrinema）、嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）、Halanaerobaculum、希瓦氏菌屬（Shewanella）及芽孢桿菌科（Bacillaceae unclassified）細(xì)菌為主，分別占43.50%、18.36%、9.32%、6.43%和5.19%。除此之外還包括少量的嗜冷單細(xì)胞菌屬（Psychromonas）、嗜鹽菌屬（Halobacterium）、發(fā)光桿菌屬（Photobacterium）及其他菌屬。

B 組樣品中主要以慢性芽孢桿菌屬（Lentibacilus）及未分類芽孢桿菌科細(xì)菌（Bacillaceae unclassified）為主，分別占64.73%、32.83%。

C、D 組樣品菌相結(jié)構(gòu)相似度較高，聚類分析中能夠較好地聚為一類。其微生物菌相組成中均以狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）為主，分別占82.15 %、74.10%；希瓦氏菌屬（Shewanella）其次，分別占8.70%和19.12%。梭菌屬細(xì)菌可以增加發(fā)酵食品中的亞硝酸的含量，在蒸煮及未蒸煮的肉制品中，均有發(fā)現(xiàn)梭菌屬[25]，因此其數(shù)量在發(fā)酵食品中被控制。Diana Di Gioia 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，從實(shí)驗(yàn)室分離的兩株乳酸菌均能有效抑制梭菌屬菌的生長，其形成的抑菌圈大小為2.5 cm～3.5 cm。因此，在發(fā)酵過程中加入一些乳酸菌（益生菌）等菌，是降低咸鰳魚中梭菌屬菌含量的一個(gè)比較可行的方案。希瓦氏菌屬（Shewanella）是海水魚類體表?xiàng)⒌恼＞?，同時(shí)也是引起水產(chǎn)品腐敗及組胺積累的主要微生物類群[27]。咸鰳魚中希瓦氏菌的存在可能會(huì)引起蛋白質(zhì)降解、小分子胺類積累，推測(cè)其存在與咸鰳魚中的“霉臭”味的形成有一定關(guān)聯(lián)。

E、F 組樣品菌相結(jié)構(gòu)相似度較高，聚類分析中能夠較好地聚為一類。未分類梭菌科（Clostridiaceae un classified）微生物數(shù)量最多，分別占93.52%和85.21%。狹義梭菌屬（Clostridium sensu stricto）分別占4.66%和4.15%。F 樣品中希瓦氏菌屬（Shewanella）占7.5%。同時(shí)，有少量（1.23%）耐鹽的四聯(lián)球菌（Tetragenococcus）檢出，該屬微生物也是發(fā)酵水產(chǎn)品生產(chǎn)中常見微生物[8]。

由上述結(jié)果可初步看出，來源相同的樣品其微生物菌相構(gòu)成具有較高的相似性。C、D 樣品均來源于寧波水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，25 ℃攤放，東南亞進(jìn)口；E、F 樣品則來源于杭州蕭山水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，25 ℃攤放，東南亞進(jìn)口。A 組樣品為市場(chǎng)銷售人員自制咸鰳魚，腌制時(shí)間90 d 左右。B 組為長時(shí)間冷凍咸鰳魚樣品，產(chǎn)地不詳。A、B 兩類樣品中的微生物菌相結(jié)構(gòu)與其他樣品差異較大。

3 討論

基于分離培養(yǎng)研究技術(shù)從市售咸鰳魚中獲得151株可培養(yǎng)微生物，16S rDNA 序列分析顯示，分離菌株可歸至14 個(gè)屬和23 個(gè)種。芽孢桿菌屬細(xì)菌是A、D、E、F 組樣品中優(yōu)勢(shì)微生物；C 組樣品中葡萄球菌為優(yōu)勢(shì)菌，嗜冷桿菌和芽孢桿菌數(shù)量次之。上述3 個(gè)屬以外的其他種屬細(xì)菌在各類樣品中均呈零星分布的狀態(tài)。然而，免培養(yǎng)高通量測(cè)序結(jié)果在屬水平上反映出的微生物種類與分離培養(yǎng)方法不盡相同。Illumina MiSeq 測(cè)序結(jié)果顯示，C、D、E、F 組中狹義梭菌 屬（Clostridium sensu stricto）和分類梭菌科（Clostridiaceae unclassified）微生物數(shù)量最多是其中的主要優(yōu)勢(shì)菌，而A 組樣品中堿桿菌屬（Alkalibacillus）、嗜鹽古生菌（Natrinema）幾乎占據(jù)了主導(dǎo)地位，B 組樣品則以慢性芽孢桿菌屬（Lentibacilus）為主。

造成兩種方法結(jié)果差異較大的原因主要有以下兩方面：首先，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)只能對(duì)自然界5%的微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)，同時(shí)，每類培養(yǎng)基只能針對(duì)有限種類的微生物進(jìn)行分離，因此，環(huán)境或復(fù)雜生境樣品中大多微生物的信息不能夠較為完備的呈現(xiàn)[8]。為了借助純培養(yǎng)技術(shù)更為全面地揭示樣品中微生物信息，必須選擇多種培養(yǎng)基對(duì)樣品中可能存在的微生物類群進(jìn)行分離。其次，由于高通量測(cè)序是以樣品中全部微生物的基因組為模板進(jìn)行PCR 和測(cè)序分析，因此，一些曾經(jīng)存在于腌制體系以及儲(chǔ)運(yùn)中后續(xù)滋生微生物的信息均能夠被呈現(xiàn)出來，但無法據(jù)此判斷各類微生物的存在時(shí)期及其存活情況[2，11]。B 組樣品系長期冷凍保藏樣品，采用分離培養(yǎng)方法未能成功從其中獲得可培養(yǎng)微生物，推測(cè)可能是長時(shí)間的冷凍保藏后，可培養(yǎng)微生物數(shù)量較低，且在本研究實(shí)驗(yàn)條件下難于復(fù)蘇，但基于免培養(yǎng)的高通量測(cè)序技術(shù)，其中微生物信息仍能夠有效被揭示。

分離培養(yǎng)研究方法揭示了市售咸鰳魚成品中仍存活的微生物種類和數(shù)量，這些菌株可能來源于生產(chǎn)過程，也可能源自運(yùn)輸和貯藏環(huán)境。盡管，市售咸鰳魚攜帶微生物中大多數(shù)均為非致病菌，但分離菌株攜帶與生物胺積累相關(guān)的氨基酸酸脫羧酶基因比例較高，組氨酸脫羧酶基因攜帶率高達(dá)87.42%，鳥氨酸脫羧酶基因和賴氨酸脫羧酶基因的檢出率也均在45%及以上。從基因水平評(píng)估，這可能是成為產(chǎn)品中生物胺積累的潛在因素。因此，市售咸鰳魚攜帶微生物的數(shù)量應(yīng)該予以控制，并且對(duì)其安全性有待進(jìn)一步全面評(píng)估。