富馬酸及魚(yú)油對(duì)瘤胃微生物體外培養(yǎng)中亞油酸代謝生成甲烷及CLA的影響

■閆 研 張軍芳 孫 斌 王 英 崔 巖 孫建富 李香子

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院肉牛科學(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，吉林省延吉市133000)

隨著人類(lèi)生活水平的不斷提高，飲食與健康問(wèn)題受到了廣泛的關(guān)注。而動(dòng)物脂肪酸與健康密切相關(guān)，人類(lèi)如果攝食過(guò)多飽和脂肪酸容易引發(fā)各類(lèi)疾病，而共軛亞油酸（CLA）是國(guó)際上公認(rèn)的唯一動(dòng)物源性功能性脂肪酸，是反芻動(dòng)物脂肪中含有的一種具有特異性生物活性作用的微量不飽和脂肪酸，具有重要的生物學(xué)功能。Pariza等人發(fā)現(xiàn)牛肉含有一種由一系列共軛亞油酸異構(gòu)體組成的抗致癌因子[1]。“共軛亞油酸（CLA）是唯一明確顯示能抑制實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的致癌作用的脂肪酸”(NRC, 1996)。最近，發(fā)現(xiàn)了另一種有益人體健康的共軛異構(gòu)體順9，反11，順15 亞麻酸，據(jù)報(bào)道，化學(xué)制備的天然CLnA 的異構(gòu)體溶解腫瘤細(xì)胞的作用優(yōu)于CLA，抑制各種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[2-5]，并且已研究表明可以顯著減低總膽固醇，載脂蛋白B-100和肝臟甘油三酯[6-7]。

在全球變暖的危害中，甲烷潛在威力卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了二氧化碳。甲烷是在反芻動(dòng)物瘤胃微生物分解、發(fā)酵植物纖維過(guò)程中產(chǎn)生的。而丙酸是一種生成甲烷的重要物質(zhì)，并且在瘤胃中由丙酸前體物合成。故調(diào)控瘤胃發(fā)酵以減低甲烷的產(chǎn)生和增加CLA或CLnA的產(chǎn)量將有利于畜牧業(yè)發(fā)展、環(huán)境和人類(lèi)的健康。理論上來(lái)講，通過(guò)選擇性的電子代謝途徑降低電子能夠降低甲烷生成[8]。在瘤胃中使用丙酸鹽生成前體轉(zhuǎn)變瘤胃發(fā)酵的丙酸鹽生成途徑將是理想的方法[9], 因?yàn)樗那绑w利用代謝氫生成丙酸，并且在瘤胃發(fā)酵過(guò)程中改變代謝氫利用效率而引起其他中間代謝產(chǎn)物和終產(chǎn)物的分配[10]。而富馬酸已被確認(rèn)可以改變氫傳遞的路徑，通過(guò)減少甲烷排放量增加丙酸的含量[11-12]。也有報(bào)道魚(yú)油也能增加瘤胃丙酸（C3）的含量[13-14]，并被作為一種有效的瘤胃甲烷抑制劑[15]。對(duì)植物油，丙酸前體物（fumarate, FA）及魚(yú)油對(duì)共軛亞油酸和甲烷生產(chǎn)在瘤胃微生物發(fā)酵中的關(guān)聯(lián)效應(yīng)的研究，至今尚未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本試驗(yàn)旨在研究富馬酸及PMUF（C20:5，C22:6）在瘤胃微生物的作用下對(duì)亞油酸的代謝機(jī)制及其調(diào)控脂肪酸代謝過(guò)程中對(duì)甲烷合成效率的影響。

1 材料與方法

1.1 瘤胃液采集

3 頭體重為650 kg 左右，安裝有瘤胃瘺管的荷斯坦母牛，采食以稻草（40%）、玉米、豆粕等為精飼料（60%），苜蓿草為粗飼料，每天早晚飼喂2 次（5 kg/d，6：00 和18：00），自由飲水，瘤胃液于晨飼2 h（8：00）后進(jìn)行采集。將從3 頭牛瘤胃中等量采集的樣本在混合器內(nèi)混合20 s，分離飼料顆粒中的細(xì)菌，用12 層紗布過(guò)濾，通入二氧化碳（CO2）30 s，期置于39 ℃水浴鍋，充入N2。

1.2 人工唾液的組成

人工唾液制備后，進(jìn)行全自動(dòng)高壓滅菌，最后調(diào)整pH值至6.5。人工唾液成分見(jiàn)表1。

表1 人工唾液成分

1.3 試驗(yàn)處理與培養(yǎng)方法

45 ml瘤胃液濾液與45 ml McDougall's 人工唾液1:1 混合于150 ml 培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。試驗(yàn)分五組：一組為對(duì)照組（CON 組）不添加任何物質(zhì)；其他四組為試驗(yàn)組，分別是(SO 組)120 mg 紅花油、（SO-FO 組)120 mg 紅花油+24 mg 魚(yú)油,；（SO-FA 組）120 mg 紅花油+24 mmol/l 富馬酸；（SO-FO-FA 組）24 mg 魚(yú)油+24 mmol/l富馬酸。將1.2 g飼料(精:粗=7:3)作為營(yíng)養(yǎng)底物加入到各處理中，用安裝3相閥丁基橡膠塞封住培養(yǎng)瓶，在39 ℃下自動(dòng)控溫震蕩培養(yǎng)箱內(nèi)以135 r/min速率厭氧培養(yǎng)12 h。在同樣條件下，每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)平行樣，試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

飼料中的化學(xué)成分列于表2 中，瘤胃中脂肪酸、飼料和油脂中的添加量列于表3中。

表2 培養(yǎng)液中飼料成分（%，以DM為基礎(chǔ)）

表3 添加到培養(yǎng)液中瘤胃液、混合飼料和油中的C18脂肪酸的濃度(%)

1.4 分析方法

pH值：用pH測(cè)定儀測(cè)定。

銨態(tài)氮的測(cè)定：參照Fawcett和Scott(1960)方法用紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)（DU-650）進(jìn)行測(cè)定[16]。

揮發(fā)性脂肪酸VFA（乙酸、丙酸、丁酸）濃度的測(cè)定：利用氣相色譜法，用已知濃度的VFA 標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，再利用內(nèi)標(biāo)（三甲基乙酸）定量分析。

甲烷（CH4）的測(cè)定與計(jì)算：利用氣相色譜法，以甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線再進(jìn)行分析。計(jì)算方法CH4產(chǎn)量參照Lopez和Newbold(2007)方法。

培養(yǎng)液脂肪分離與甲酯化方法：

培養(yǎng)液的脂肪提取液參照Folch's 溶液進(jìn)行配制，氯仿:甲醇=2:1混合均勻后，取30 ml倒入混合培養(yǎng)液中低溫震蕩24 h，加入C13:0 作為脂肪酸分析內(nèi)標(biāo)；在2 000 r/min離心20 min，取下層液體，利用氮吹儀使有機(jī)溶劑等揮發(fā)，從而萃取脂肪。脂肪酸甲酯化按Lepage和Roy (1986)方法進(jìn)行[17]。

氣相色譜檢測(cè)條件：脂肪酸甲酯（FAME）的檢測(cè)利用氣相色譜（安捷倫6890N，自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)）定量檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)C13:0。脂肪酸計(jì)算根據(jù)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量計(jì)算。已知濃度富馬酸和乳酸作為定性與定量分析標(biāo)準(zhǔn)品。

瘤胃微生物RNA 提取與分析：為測(cè)定培養(yǎng)液中甲烷生成菌mRNA的表達(dá)量，在3 h和6 h的時(shí)候取培養(yǎng)液1 ml 于2 ml 小離心管，并立放置在冰塊上以防止微生物的活動(dòng)，然后分別低速離心（800 r/min，4 ℃，10 min）去除飼料顆粒。收集上清液并再次高速離心30 min 分離出細(xì)菌（2 000 r/min，4 ℃）。分離出的細(xì)菌沉淀，然后根據(jù)多物種RNA 及原核生物RNA 試劑盒說(shuō)明書(shū)中提取方法進(jìn)行提取與分離，合成cDNA,使用特異性引物來(lái)進(jìn)行熒光定量PCR 分析。基因表達(dá)的相對(duì)定量分析采用2-△△ct方法分析[18]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用最小二乘方差分析，根據(jù)SAS 的線性模型分析，不同處理組之間的顯著性分析按照以下S-N-K`s Test 線性模型分析[19]。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)酵參數(shù)和甲烷的產(chǎn)生

如圖1 所示，各處理pH 與培養(yǎng)時(shí)間負(fù)相關(guān)。在3h 時(shí),與其他組相比，SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中pH 顯著增加(P＜0.05)。紅花油和魚(yú)油對(duì)培養(yǎng)液的pH值影響無(wú)顯著差異（P＞0.05）。從圖2 結(jié)果顯示，所有處理組中的NH3-N隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。在3 h時(shí),與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組甲烷菌的mRNA 表達(dá)無(wú)顯著差異（P＞0.05）（圖3），在6 h時(shí)低于對(duì)照組，SO-FO,SO-FA，SO-FA-FO處理組的mRNA表達(dá)要比SO處理組的低（圖4）。從表4 可以看出，與其他組相比，SOFA 和SO-FO-FA 兩組丙酸增加顯著，丁酸降低最顯著(P＜0.05)，在12 h 時(shí)，與對(duì)照組相比，SO-FO, SOFA，SO-FA-FO 處理組丙酸比例下降，其中SO-FA，SO-FA-FO 處理組C2/C3 值降低顯著（P＜0.05）（表4）。與對(duì)照組相比，所有處理組總VFA量也與培養(yǎng)時(shí)間正相關(guān)。3 h 時(shí)，SO-FA 和SO-FO-FA 兩個(gè)處理組總VFA 產(chǎn)氣量比其他兩處理組產(chǎn)氣量多(P＜0.05)（見(jiàn)表4），并且試驗(yàn)組中氣甲烷體總量少，且試驗(yàn)組甲烷的降低量差異顯著(P＜0.05），其中SO-FA-FO 組最少(見(jiàn)表5)，SO 組甲烷量高于SO-FO 和SO-FA，SO-FO和SO-FA 高于SO-FO-FA 組。在12 h 后，SO-FA 和SO-FA-FO 的氣體總量高于SO 組和SO-FO 組(表5)。從表6 中可以看出硬脂酸，反式11，油酸和反式9，油酸的濃度與培養(yǎng)時(shí)間正相關(guān)，而亞油酸和總共軛亞油酸（CLA），順9，反11-共軛亞油酸和反10，順12-共軛亞油酸與培養(yǎng)時(shí)間負(fù)相關(guān)。與SO 組比較，SO-FO、SO-FA、SO-FA-FO 處理組中硬脂酸和順式11，油酸濃度下降，同時(shí)總共軛亞油酸（CLA），順9，反11-共軛亞油酸和反10，順12-共軛亞油酸濃度上升顯著（P＜0.05），其中SO-FA-FO的總共軛亞油酸（CLA）濃度最高，SO-FA-FO 中的順9，反11-共軛亞油酸的濃度高于其他三組（P＜0.05）。

圖1 以紅花油為底物在不同時(shí)間內(nèi)添加魚(yú)油和富馬酸對(duì)培養(yǎng)液pH值的影響

圖2 以紅花油為底物在不同時(shí)間內(nèi)添加魚(yú)油和富馬酸對(duì)培養(yǎng)液NH3-N濃度(mg/100 ml)影響

圖3 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油在3 h時(shí)對(duì)甲烷菌mRNA表達(dá)的影響

圖4 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油在6 h時(shí)對(duì)甲烷菌mRNA表達(dá)的影響

表4 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油對(duì)培養(yǎng)液中主要VFA濃度和成分的影響

表5 以紅花油為底物在培養(yǎng)12 h內(nèi)添加富馬酸和魚(yú)油對(duì)總產(chǎn)氣量和甲烷的影響

2.2 培養(yǎng)液中的富馬酸和乳酸濃度的測(cè)定

從圖5 表中可以看出，與其他組相比，在SO-FA和SO-FO-FA 中富馬酸的濃度明顯快速下降（P＜0.05），在3 h后保持平穩(wěn)。并且在3 h時(shí)，與其它處理組相比，SO-FA和SO-FO-FA組中的富馬酸顯著的降低了乳酸的含量（P＜0.05）(圖6)。

3 討論

在本試驗(yàn)中，在各處理組中補(bǔ)充混合飼料（1.2 g，DM），避免因營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)短缺而影響瘤胃微生物的正常發(fā)酵。從奶牛瘤胃中提取瘤胃液的所有程序確保準(zhǔn)確，盡量減少實(shí)驗(yàn)誤差。因此，才能夠正確反映瘤胃微生物的發(fā)酵參數(shù)，由圖中培養(yǎng)液中隨著時(shí)間的增加pH 的降低，氨氮、總揮發(fā)性脂肪酸的增加來(lái)看，體外發(fā)酵是正常的。

從圖1 SO-FA 和SO-FO-FA 中pH 值的增加，可以推斷出富馬酸對(duì)瘤胃發(fā)酵有積極作用，這與Martin、Streeter(1995)和Li 等(2009)的觀測(cè)一致[20-21]。pH值的增加，可能是富馬酸通過(guò)瘤胃微生物增加了乳酸的利用率(Nisbet 等，1991，1993)[22-23]，從而降低了乳酸的濃度。SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中乳酸的濃度比其它處理組要低，這也與Nisbet 和Martin(1990)研究表明：四倍劑量的富馬酸能夠刺激瘤胃微生物吸收乳酸從而來(lái)抑制pH的降低[24]保持一致。

SO-FA 和SO-FO-FA 處理組中總VFA 的濃度增加不顯著，這與Martin(1995)和Li等(2009)研究的添加富馬酸能夠增加VFA 的濃度的結(jié)果相似。富馬酸是二元酸丙酸途徑的關(guān)鍵前體之一，同時(shí)也參與丙酸的代謝途徑。在本試驗(yàn)中，從表4 可以看出SO-FA 與SO-FO-FA 處理組中C3 比例明顯增加，在培養(yǎng)液發(fā)酵3 h后，C3比例的增加與富馬酸濃度的降低密切相關(guān)，這表明補(bǔ)充富馬酸有助于瘤胃微生物丙酸的代謝。這與Callaway 等（1996）在體外培養(yǎng)中所得到的結(jié)果相似[25]。C3 比例的增加是由于富馬酸的添加影響了H2的代謝途徑，并與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)利用H2。從表4可以看出，添加油能夠增加C3的比例，而添加魚(yú)油的效果比添加紅花油的效果好。Keady 和Mayne 等(2000)研究發(fā)現(xiàn)，添加魚(yú)油能夠增加瘤胃丙酸的濃度，Van Nevel 等(1974)的研究表明，添加魚(yú)油能夠減少甲烷的產(chǎn)生[26]。Demeyer 等報(bào)道也證明了甲烷產(chǎn)生的減少往往伴隨著丙酸產(chǎn)量的增加[27]。

表6 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油對(duì)培養(yǎng)液中主要C18脂肪酸濃度影響（mg）

從表5 中可以看出，單個(gè)添加、或者聯(lián)合添加都極大的抑制了甲烷的產(chǎn)生，SO，SO-FO，SO-FA和SOFO-FA 處理組與空白對(duì)照組中甲烷量相比分別降低了19.68%、42.58%、39.27%和51.90%。甲烷產(chǎn)生的降低與添加的油和富馬酸有關(guān)系。當(dāng)在日糧中添加脂質(zhì)，會(huì)使瘤胃發(fā)酵速度減慢，從而使甲烷的生成量減少，這是很常見(jiàn)的。Fievez 等研究表明魚(yú)油能夠被作為一種有效地甲烷抑制劑。Czerkawski 等也指出，不飽和脂肪酸可以利用氫進(jìn)行氫化，從而可以與甲烷的產(chǎn)生形成競(jìng)爭(zhēng)來(lái)抑制甲烷的生成[28]。在本實(shí)驗(yàn)中，紅花油含有大量的亞油酸(C18:2)(占總脂肪酸的61.98%，見(jiàn)表2)。先前也有研究表明，無(wú)論在體內(nèi)還是體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中富馬酸都表現(xiàn)出了很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)性，與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)利用氫[29-31]。在本實(shí)驗(yàn)中富馬酸用來(lái)減少甲烷產(chǎn)生效果比較好。從圖3 和圖4 中甲烷菌mRNA 的表達(dá)可以得出：添加魚(yú)油和富馬酸能夠降低甲烷的產(chǎn)生。從圖5 可以看出，富馬酸在瘤胃微生物中代謝速率很快。在發(fā)酵1 h 時(shí)SO-FA 和SO-FO-FA 中富馬酸的回收率達(dá)到84.63%和86.25%，但是12 h 時(shí)幾乎所有的富馬酸被微生物所發(fā)酵（99.38%到99.29%）。

圖5 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油對(duì)培養(yǎng)液中富馬酸濃度（mM）的影響

圖6 以紅花油為底物添加富馬酸和魚(yú)油對(duì)培養(yǎng)液中乳酸濃度（mM）的影響

在培養(yǎng)1 h 時(shí)所有處理中硬脂酸（C18:0）和共軛亞油酸（CLA）及同分異構(gòu)體(順9，反式11-共軛亞油酸和反10，順式12-共軛亞油酸)濃度成上升趨勢(shì)，然而，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，生物氫化逐漸穩(wěn)步（見(jiàn)表6）。最高濃度可能表明異構(gòu)化迅速的發(fā)生，此后，生物氫化加速了異構(gòu)化進(jìn)程，從而CLA得濃度大大降低了(表6)。油的添加增加了CLA 產(chǎn)生，可能是由于紅花油中含有大量的順9，反11-亞油酸。SO-FO 中順9，反11-共軛亞油酸的濃度比SO 中高，是由于油改變了不飽和脂肪酸氫化的途徑。Wang等人在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)魚(yú)油和紅花油能夠增加CLA的產(chǎn)生[32]。SO-FA-FO 中c 順9，反11-共軛亞油酸比SO-FO 和SO-FA 中的高，這表明：魚(yú)油和富馬酸單獨(dú)影響C18:2（亞油酸）氫化過(guò)程的能力比兩者聯(lián)合的效果差。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)的條件下研究表明，富馬酸和PMUF不影響瘤胃微生物的發(fā)酵作用，PMUF 含有多個(gè)不飽和雙鍵，而雙鍵的氧化飽和作用又能夠影響亞油酸的生物氫化作用，可以進(jìn)一步提高CLA 的生成效率，降低甲烷的產(chǎn)量以及甲烷生成菌的mRNA 表達(dá)量。富馬酸和魚(yú)油能夠改變電子的傳遞途徑，也能夠與甲烷菌競(jìng)爭(zhēng)性利用氫，同時(shí)也能夠影響不飽和脂肪酸氫化的代謝途徑，在培養(yǎng)中CLA 的增加同時(shí)也伴隨著甲烷產(chǎn)生的減少。故而，二者協(xié)同作用，可以大幅度提高共軛亞油酸（CLA）生成量，大幅度降低甲烷的產(chǎn)量。