杏鮑菇菌糠發(fā)酵條件優(yōu)化及飼料安全性評價

■周靜鵬 魏 濤 徐 崇 樊永亮 盧徐斌 陳 志 張慧敏 楊章平

（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇揚州225009）

菌糠，也稱菌渣，是食用菌收菌后的栽培廢料，含有食用菌菌絲殘體以及大量粗纖維，營養(yǎng)豐富。我國是食用菌第一生產(chǎn)大國，也是產(chǎn)生菌糠產(chǎn)量第一大國[1]，近年來，將菌糠應用于動物飼料國內(nèi)已有許多報道。宋漢英等[2]和龐思成[3]的研究表明用菌糠代替部分飼料配料不僅能滿足動物等生長營養(yǎng)需要，而且大大降低了飼料成本，顯著提高了經(jīng)濟效益。一些研究表明通過微生物發(fā)酵，可進一步提高菌糠的營養(yǎng)價值，解決其粗纖維含量高和消化吸收率低的問題。高旭紅等[4]和閆芳等[5]研究表明發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料與未發(fā)酵杏鮑菇菌糠相比，粗纖維、中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量均降低，粗蛋白質(zhì)和粗灰分含量均有所提高，發(fā)酵菌糠營養(yǎng)價值顯著提高。目前，菌糠發(fā)酵主要采用乳酸菌類、酵母菌類和霉菌類進行單菌發(fā)酵或混菌發(fā)酵，均能一定程度提升蛋白質(zhì)含量和改善飼料品質(zhì)[6]。然而對于菌糠發(fā)酵條件的研究還不夠深入，混菌發(fā)酵種類不多且影響因素考慮較少，導致菌糠利用率不高，許多研究僅用菌糠代替部分飼料配料，菌糠作為飼料原料的研究極少。本文通過全面試驗設計探究能夠較好提高杏鮑菇菌糠經(jīng)微生物發(fā)酵后的飼料營養(yǎng)水平并探索杏鮑菇菌糠的最佳發(fā)酵條件，以提高菌糠利用率，為菌糠作為飼料原料提供試驗支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌糠飼料購自江蘇省宿遷市沭陽縣永豐生態(tài)牧業(yè)有限公司。

黃曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素(OTA)、玉米赤酶烯酮(ZEN)、嘔吐毒素(DON)檢測試劑盒均購自深圳市寶安康生物技術有限公司。

菌落總數(shù)檢測試紙、霉菌總數(shù)檢測試紙、沙門氏菌檢測試紙均購自廣州達元綠洲食品安全科技有限公司。

1.2 試驗設計

1.2.1 杏鮑菇菌糠飼料安全性檢測

將菌糠樣品平鋪，取4 個角和中間共5 個部分混勻后，每種指標根據(jù)國標測3次取平均值。

1.2.2 杏鮑菇菌糠飼料發(fā)酵試驗

本試驗共分為12組。每組取5 kg杏鮑菇菌糠飼料，按照各發(fā)酵劑使用說明，分成25份，每份200 g，分別裝入塑封袋中，排掉空氣并封口，放入37 ℃的恒溫箱中進行發(fā)酵。每24 h從各組抽檢1份樣品，測定其pH值，當前后兩次pH值不再變化時，代表發(fā)酵結束。

每種發(fā)酵劑根據(jù)其商品使用說明進行使用，并按照商品使用說明的要求按比例與杏鮑菇菌糠飼料均勻混合，再噴灑水分調(diào)整其水分含量分別至50%、60%、70%。本文所用新鮮杏鮑菇菌糠飼料樣本經(jīng)測定初始水分含量為48.5%，參考青貯料發(fā)酵操作，青貯料的水分宜在65%～75%，半干青貯料可以在50%～55%。采用用手擠壓法，水分含量約70%時，水會從指縫間滴出。以此為依據(jù)，本文為杏鮑菇菌糠飼料的發(fā)酵設置3個水分梯度：50%、60%、70%。

3 種不同的發(fā)酵劑組合分別為：組Ⅰ：乳酸菌（LAB）、組Ⅱ：乳酸菌-酵母菌（SC）、組Ⅲ：乳酸菌-酵母菌-枯草芽孢桿菌（BS），組Ⅳ為對照組，不添加任何發(fā)酵劑，讓其自然厭氧發(fā)酵。霉菌毒素的測定結果與未發(fā)酵的杏鮑菇菌糠飼料水平（CK）進行對比。具體分組如表1所示。

表1 試驗分組

1.3 測定方法

1.3.1 重金屬含量的測定

As、Pb、Hg、Cr、Cd、F 含量的測定參照GB/T 5009中的方法進行測定。

1.3.2 霉菌毒素的測定

黃曲霉毒素B1含量的測定參照GB/T 17480—2008進行測定；

赭曲霉毒素含量的測定參照GB/T 19539—2004進行測定；

玉米赤酶烯酮含量的測定參照GB/T 19540—2004進行測定；

嘔吐毒素含量的測定參照GB/T 19539—2004 進行測定；

游離棉酚含量的測定參照GB/T 13086—1991 進行測定。

1.3.3 農(nóng)藥殘留的測定

使用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術測定滴滴涕（DDT）、六六六（HCH）、百菌清、氯氰菊酯、毒死蜱、多菌靈的殘留量。

1.3.4 有害微生物的測定

霉菌總數(shù)、細菌總數(shù)、沙門氏菌的測定參照GB 4789進行測定。

1.3.5 概略養(yǎng)分的測定

干物質(zhì)（DM）測定參照GB/T 6435—2014；

粗蛋白質(zhì)（CP）測定參照GB/T 6432—1994；

粗脂肪（EF）測定參照GB/T 6433—2006；

粗纖維（CF）測定參照GB/T 6434—2006。

1.3.6 有氧穩(wěn)定性的測定發(fā)酵結束后，分別取各組待測樣本5 份，打開塑封袋封口，分別暴露于空氣中12、24、48、72、96、120 h。至每個時間節(jié)點，將每份待測試樣混合均勻，然后用四分法取20 g放入錐形瓶中，加入180 ml蒸餾水并震蕩2 min，放入冰箱中4 ℃靜置24 h，再用4 層紗布和定性濾紙過濾，濾出菌糠渣得到浸出液，再用pH儀測定發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料浸出液的pH值。

2 結果

2.1 杏鮑菇菌糠飼料重金屬含量的測定結果與分析

杏鮑菇菌糠作為飼料原料應采用GB 13078—2017中的飼料原料規(guī)定限量值，根據(jù)表2 可看出，Pb、As、Hg、Cr、Cd、F 各項含量分別占各自限量值的10.44%、7.50%、24.00%、31.84%、2.95%、23.20%?？梢娦吁U菇菌糠飼料中的重金屬含量均遠低于國家飼料安全標準的限量值。

表2 杏鮑菇菌糠飼料重金屬含量(mg/kg)

2.2 杏鮑菇菌糠飼料生物毒素的測定結果與分析

杏鮑菇菌糠飼料作為飼料原料應采用GB 13078—2017中的飼料原料規(guī)定限量值。根據(jù)表3可以看出，F(xiàn)GP 檢測值為0，OTA 含量占其限量值的53.73%，其他三項遠遠低于限量值，AFB1、ZEN、DON分別占各自限量值的2.56%、0.55%、0.04%?？梢娦吁U菇菌糠中的各種霉菌毒素含量均低于國家飼料安全標準的限量值，符合我國現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標準。

表3 杏鮑菇菌糠飼料霉菌毒素含量(μg/kg)

2.3 杏鮑菇菌糠飼料農(nóng)藥殘留的測定結果與分析

根據(jù)前人研究和食用菌栽培過程中常用農(nóng)藥分析，挑選了滴滴涕（DDT）、六六六（HCH）、百菌清、氯氰菊酯、毒死蜱、多菌靈六種農(nóng)藥交由青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司進行農(nóng)藥殘留測定，結果均未檢出(見表4)。

表4 杏鮑菇菌糠飼料農(nóng)藥殘留含量(mg/kg)

2.4 杏鮑菇菌糠飼料有害微生物的測定結果與分析

杏鮑菇菌糠霉菌總數(shù)限量值應參考GB 13078—2017飼料原料條目限定值。結果如表5所示，杏鮑菇菌糠的霉菌總數(shù)測定值占其限量值的12%，細菌總數(shù)測定值占其限量值的6.5%，均遠遠低于限量值，沙門氏菌未被檢出。

表5 杏鮑菇菌糠飼料有害微生物含量(CFU/g)

2.5 發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料概略養(yǎng)分的測定結果與分析

發(fā)酵結束后，對試驗各組分別進行粗蛋白質(zhì)（CP）、粗纖維（CF）、粗脂肪（EF）以及干物質(zhì)（DM）測定，結果見表6，表6可見組Ⅲ營養(yǎng)水平最高，CP、EF含量最高，CF含量最低。組Ⅰ與組Ⅱ次之，相差無幾。

表6 不同發(fā)酵處理對杏鮑菇菌糠飼料營養(yǎng)水平的影響(%)

2.6 發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料有氧穩(wěn)定性的測定結果與分析

由表7 可知，各組在暴露于有氧環(huán)境12 h 之內(nèi)，pH值上升相差無幾，上升趨勢緩慢。但在12 h至24 h之間，各組pH值迅速上升。組Ⅲ樣品的pH值上升最慢，其他各組24 h 時pH 值即達到6.0，組Ⅲ在48 h 后pH值達6.0。尤其是Ⅲ2組（含水量60%）pH值上升最為緩慢。因此，Ⅲ2有氧穩(wěn)定性最好。

表7 不同發(fā)酵處理對杏鮑菇菌糠飼料有氧穩(wěn)定性的影響(pH值)

2.7 發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料霉菌毒素的測定結果與分析

根據(jù)概略養(yǎng)分測定結果和有氧穩(wěn)定性測定結果，選取組Ⅲ進行霉菌毒素測定，各測定項目的限量值與未發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料相同。測定結果如表8所示，三組各項測定值均遠低于限量值。組Ⅲ1、組Ⅲ2、組Ⅲ3 同沒有發(fā)酵前相比AFB1 大幅度降低，分別降低了3.89%、7.79%、2.59%，OTA 和DON 也有所降低，OTA 分別降低了49.67%、37.04%、34.56%，DON 分別降低了7.00%、4.50%、2.50%。因此，發(fā)酵后的杏鮑菇菌糠飼料符合國家飼料安全標準。

表8 發(fā)酵杏鮑菇菌糠飼料中生物毒素的含量(μg/kg)

3 討論

杏鮑菇菌糠飼料發(fā)酵前后經(jīng)過安全性測定均符合我國當前現(xiàn)行飼料衛(wèi)生標準，這與前人的研究一致。雷雪芹等[7]在稻草菌糠的提取物中發(fā)現(xiàn)其不含有黃曲霉素B1 等霉菌毒素；李莉[8]研究表明，棉籽殼菌糠中游離棉酚的含量在0.010 3%～0.023 5%之間，黃曲霉毒素也在限量值以下，且未檢出沙門氏菌和志賀氏菌。

本研究發(fā)現(xiàn)，杏鮑菇菌糠飼料經(jīng)過微生物發(fā)酵后營養(yǎng)水平提高，霉菌毒素下降。與自然發(fā)酵組Ⅳ相比，微生物發(fā)酵組CP、EF 含量均提高，CF、DM 下降，其中組Ⅲ（乳酸菌-酵母菌-枯草芽孢桿菌）發(fā)酵水平最優(yōu)，發(fā)酵后CP 含量平均提升27.12%，CF 平均降低19.52%，EF 平均提升38.92%，DM 平均下降3.41%。鄭有坤等[9]發(fā)現(xiàn)用酵母菌和乳酸菌的混菌發(fā)酵能夠明顯降低香菇菌糠各種纖維素含量，增加粗蛋白質(zhì)含量，與本研究結果一致。Kwak等[10]利用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵秸稈菌糠也得到了類似結果。相關資料表明，微生物發(fā)酵處理會降低菌糠的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和可溶性碳水化合物的含量，提高粗蛋白質(zhì)含量。此外，組Ⅰ（乳酸菌）、組Ⅱ（乳酸菌-酵母菌）和組Ⅳ粗蛋白質(zhì)水平較發(fā)酵前均有不同程度的降低，尤以不加任何發(fā)酵劑的自然發(fā)酵組組Ⅳ降幅最高，這可能是由于組Ⅳ在自然發(fā)酵過程中有氧好氣性階段最長，有害菌對養(yǎng)分的消耗較大所致。

本研究中組Ⅲ營養(yǎng)水平最高，其中以50%含水量Ⅲ1 最為突出，組Ⅲ2 次之。此外，在有氧穩(wěn)定性方面，組Ⅲ有氧穩(wěn)定性高于其他組，這可能是因為其發(fā)酵劑中含有枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌是我國允許直接飼喂動物的益生菌菌種之一，可產(chǎn)生多種消化酶和營養(yǎng)物質(zhì)，能降解飼料中的抗營養(yǎng)因子，對一些沙門氏菌等致病菌具有明顯拮抗作用。同時枯草芽孢桿菌為需氧菌，可消耗大量的游離氧，抑制病原菌生長[11]。組Ⅲ三個水分梯度的pH 值上升最慢，在暴露于有氧環(huán)境48 h之時，尤其以60%水分的Ⅲ2組pH值上升最慢，其有氧穩(wěn)定性遠勝過其它組。

本研究選取了營養(yǎng)水平最高的組Ⅲ進行安全性測定，結果顯示各組霉菌毒素水平均有所降低，其中AFB1 和DON 降低4.77%和4.65%，OTA 降低40.42%，說明發(fā)酵過程對霉菌毒素具有一定的降解作用。張秀江等[12]研究發(fā)現(xiàn)酵母菌對飼料中黃曲霉毒素B1 的降解和脫除作用顯著，張高娜等[13]研究表明酵母在發(fā)酵過程可能對霉菌毒素有直接的降解作用，與本研究結果基本一致。此外，對于各毒素的降低幅度不同，可能由于發(fā)酵過程對不同毒素的降解能力不同，一些研究也顯示枯草芽孢桿菌對AFB1菌絲生長也有一定的抑制作用[14-15]。

4 結語

本研究結果表明，杏鮑菇菌糠飼料含水量為60%時，采用乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌的發(fā)酵型菌糠能夠有效提高菌糠飼料價值。因此，將此發(fā)酵型菌糠作為飼料原料進行飼喂試驗檢測其飼喂效果將是下一步研究方向。