驢腸道微生物多樣性及代謝功能差異分析的研究

■劉桂芹 格日樂其木格 邢敬亞 蘇少鋒 張心壯 曲洪磊 趙一萍 芒 來*

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實驗站內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特010018；2.聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)院山東省黑毛驢高效繁育與生態(tài)飼養(yǎng)工程技術(shù)研究中心山東省驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，山東聊城252059；3.國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心東阿阿膠股份有限公司，山東東阿252201）

近幾年，隨著阿膠產(chǎn)業(yè)發(fā)展及農(nóng)業(yè)機(jī)械化，毛驢役用功能逐漸喪失，養(yǎng)殖模式也由原來的散養(yǎng)轉(zhuǎn)為規(guī)?；B(yǎng)殖[1]。毛驢營養(yǎng)需要量研究目前參考馬的75%進(jìn)行估算，而有報道指出兔腸道產(chǎn)生的VFA可滿足供維持能量的12%～40%[2]，驢作為單胃草食動物，腸道微生物對機(jī)體營養(yǎng)代謝有重要作用。草食動物利用消化道內(nèi)龐大的微生物群體進(jìn)行纖維素的消化，因此微生物被看作是草食動物的“消化器官”。草食動物依據(jù)消化道結(jié)構(gòu)不同可分為單胃草食動物和反芻草食動物。近幾年，利用高通量的宏基因組技術(shù)研究胃腸道微生物一直是熱點領(lǐng)域，但前人研究主要集中在瘤胃[3]、盲腸[4]、糞便[5]等領(lǐng)域，趙文靜等[6]用小鼠證明糞便微生物不能完全代表動物宿主腸道微生物的真實情況。迄今為止，對于健康驢的腸道微生物研究，只有Liu X F等(2014)[7]對糞便、方雷等[8]對盲腸和結(jié)腸固相食糜、劉宇等[9]對德州驢盲腸微生物等進(jìn)行了多樣性研究，這些研究均聚焦在驢的后腸環(huán)境。在馬[10]、鼠[11]、鵝[12]、奶牛[13]、中國狍子等動物研究[14]中發(fā)現(xiàn)不同消化道微生物的多樣性和豐富度存在著極顯著差異。曾燕等[15]報道綿羊瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃中微生物菌群多樣性呈先升后降的趨勢。因此，結(jié)合驢單胃、草食的消化特性，本研究以驢前腸和后腸內(nèi)容物中微生物的α-多樣性、不同分類水平的優(yōu)勢菌群和FAPROTAX 功能預(yù)測進(jìn)行研究，為了解驢消化道微生物對精飼料和飼草的消化和吸收作用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗選用2 歲左右的德州公驢5 頭，屠宰后取消化道各部位內(nèi)容，具體部位確定如下：胃-幽門部；十二指腸-胃結(jié)合部后10 cm；空腸-十二指腸結(jié)合部后10 cm；回腸-回盲口向前10 cm 處；盲腸-在盲腸蚓部；腹結(jié)腸-腹結(jié)腸中間部位；背結(jié)腸-背結(jié)腸中間部位；直腸-靠近肛門端。取樣后在潔凈條件下，取等量的胃、十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物，，混合后定義為前腸內(nèi)容物（LG）；等量盲腸、背結(jié)腸、腹結(jié)腸和直腸內(nèi)容物，混合后定義為后腸內(nèi)容物（UG）。將內(nèi)容物放于50 ml無菌無酶凍存管封口，立即投于液氮中，運輸至實驗室-80 ℃保存待測。

1.2 總DNA的提取、純化和構(gòu)建文庫

總DNA提取、PCR擴(kuò)增及Ion S5TMXL 測序均由北京諾禾致源生物信息科技有限公司協(xié)助完成。

1.3 生物信息分析及數(shù)據(jù)處理

根據(jù)北京諾禾致源股份有限公司給出的原始序列、有效序列等信息，利用測序公司提供平臺分析https：//magic.novogene.com/public/進(jìn)行OTU 聚類與注釋、微生物多樣性及功能預(yù)測分析。

α多樣性結(jié)果用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”方式表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 前后消化道內(nèi)容物測序深度和OTU數(shù)量分析

所有樣品共得到3 106 234 條有效序列，平均每個樣品含（77 656±7 582）條。在不同分類水平對所得有效序列進(jìn)行物種注釋，共得到7 459 個OTU，屬35 個門、55 個綱、118 個目、222 個科、512 個屬。前腸和后腸核心OTU數(shù)為2 960個，前腸獨有OUT個數(shù)為996 個，后腸獨有OUT 個數(shù)為2 059 個，如圖1 所示。由核心OTU 及各自特有OUT 的數(shù)量可以看出，后腸微生物的數(shù)量遠(yuǎn)高于前腸，為驢后腸消化利用飼草提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.2 前后消化道內(nèi)容物稀釋曲線(見圖2)

由圖2 樣品稀釋曲線可見，各曲線均趨于平緩，說明在本試驗測序深度（reads=43 384）條件下，可以覆蓋各樣品的絕大多數(shù)微生物。由曲線的差異可以看出，前后腸達(dá)到平穩(wěn)狀態(tài)所需要測序深度明顯不同，且前腸和后腸的分界非常明顯。

圖1 OTU韋恩圖

2.3 前后消化道微生物群落α-多樣性分析(見表1)

細(xì)菌物種的豐富度指數(shù)（Chao1、ACE、Observed species）、多樣性指數(shù)（Shannon，Simpson）、系統(tǒng)發(fā)育多樣性指數(shù)（PD_Whole_tree）等在驢前腸和后腸之間存在極顯著差異（P＜0.01）；測序覆蓋率指數(shù)（Goods_coverage）均達(dá)到99%，且前后腸之間沒有差異。其中LG 各指數(shù)的平均數(shù)及區(qū)間如下：Chao1（989，437～2 393）、Observed species（765，338～2 014）、Shannon（4.5，2.7～8.9）、Simpson（0.85，0.5～0.99）、ACE（1 105，478-3 007)、PD_Whole_Tree（89，49～167)；UG各指數(shù)的平均數(shù)及區(qū)間如下：Chao1（1 768，377～2 299）、Observed species（1 580，257～2 118）、Shannon（8.2，3.1～9.0）、Simpson（0.98，0.78～0.99）、ACE（1 824，452～2 427)、PD_Whole_Tree（139，41～184)。

圖2 樣品的稀釋曲線

2.4 門分類水平驢前后消化道物種相對豐度

根據(jù)物種注釋的結(jié)果，為了直觀的查看各消化道部位在門分類水平上最大豐度排名前10的物種及其比例，形成物種相對豐度柱形累加圖見圖3。由圖3可以看出，在門水平上，驢前、后腸內(nèi)容物均以厚壁菌門(Firmicutes)為主（占比＞50%），前腸優(yōu)勢菌門順序為厚壁菌門（92.4%）、變形菌門(Proteobacteria)（3.5%）、擬桿菌門(Bacteroidetes)（2.7%）和放線菌門（Actinobacteria）（0.8%）；后腸優(yōu)勢菌門順序為厚壁菌門（55.7%）、擬桿菌門（34.2%）、螺旋體門（Spirochaetes）（3.7%）和變形菌門（3.1%）。前腸和后腸厚壁菌門和擬桿菌門的比例分別為34.2:1和1.3:1。

表1 在取樣深度43 384時前后腸菌群α-多樣性指數(shù)分析

圖3 驢門水平的腔內(nèi)容物物種相對豐度圖（最大豐度排名前10的物種）

2.5 屬分類水平物種相對豐度

將結(jié)果中的512個屬中相對豐度低于1%的菌屬聚為一類，用其他表示，則前后消化道內(nèi)容物微生物在屬水平上的相對豐度前10物種用累積柱形表示如圖4。由圖4可見，在屬水平上，前、后腸菌群屬水平相對豐度顯著不同。前腸中乳酸桿菌屬（Lactobacillus）為優(yōu)勢菌群，約占50.1%，其次為鏈球菌屬（Streptococcus）占21.2%、未分類的梭菌屬（Clostridiales）占10.4%、放線桿菌屬（Actinobacillus）占2.0%。后腸中乳桿菌屬仍然為優(yōu)勢菌屬，但占比約為5.7%，其次為鏈球菌屬約為4.4%、未分類的旋體屬（Unidentified-Spirochaetaceae）約為2.2%、未分類的梭菌屬約為1.1%。相對豐度小于1%的其他菌屬（Others）占比高達(dá)85.5%，這說明后腸菌群多樣性非常高。

2.6 前后腸FAPROTAX功能預(yù)測

由圖5功能預(yù)測PCA聚類可以清楚的發(fā)現(xiàn)，前腸和后腸分別聚集并區(qū)分為2類。圖6揭示前腸內(nèi)容物微生物功能較為簡單，主要為化能異養(yǎng)和發(fā)酵作用，兩者約占70%，后消化道也以化能異養(yǎng)和發(fā)酵作用為主，兩者約占25%；前消化道與人和哺乳動物類似功能占比遠(yuǎn)高于后消化道。圖7功能預(yù)測聚類熱圖可以看出，前腸和后腸的微生物功能差別明顯，氮代謝、哺乳動物和人腸道功能、動物寄生蟲和共生體清除功能、發(fā)酵作用、化能異養(yǎng)等主要集中在前腸，后腸主要為厭氧和好氧作用、氮呼吸、硫細(xì)菌、好氧復(fù)合體降解、人類傳染疾病等功能。

圖4 驢屬水平的腔內(nèi)容物物種相對豐度圖（最大豐度排名前10的物種）

圖6 驢前后消化道FAPROTAX功能預(yù)測柱形累積圖

圖7 FAPROTAX功能預(yù)測熱圖

3 討論

動物腸道內(nèi)的微生物不僅可以幫助機(jī)體消耗食物、抵御感染和刺激機(jī)體免疫疾病，減少患病風(fēng)險。Godoy-Vitorino 等(2011)[16]等通過麝雉、牛胃及后腸微生物群落對比也發(fā)現(xiàn)，消化道部位(胃或后腸)是影響微生物群落的首要因素，該結(jié)論與本試驗結(jié)果一致。驢具有單胃動物的消化道結(jié)構(gòu)，但以草食為主，其消化道微生物與其生產(chǎn)生長關(guān)系密切。微生物與動物的生產(chǎn)性能存在密切關(guān)系，何貝貝等[17]用PCR-DEEG技術(shù)研究腸道菌群與豬的生長性能發(fā)現(xiàn)，DEEG 條帶數(shù)量隨著生長性能的提高而增多，由此也說明豬的生長性能與其腸道微生物的構(gòu)成具有一定的相關(guān)性[18]，這些結(jié)果對本試驗的后腸獨有OUT 數(shù)量遠(yuǎn)高于前腸的結(jié)果解釋后腸消化利用粗飼料奠定了基礎(chǔ)。

本研究發(fā)現(xiàn)，在菌門和菌屬水平上均表明后腸樣品間的菌群相似性大于前腸樣品間的相似性，其α-多樣性的shannon指數(shù)與Ericsson等(2016)[19]對健康馬的研究結(jié)果基本相符，后腸的多樣性指數(shù)極顯著的高于前腸。這可能是在胃酸的作用下，前腸環(huán)境不穩(wěn)定；而后腸結(jié)構(gòu)比較封閉，在功能上也更類似，所以其相似性也更高。Ley E等（2008）[20]報道人胃與腸內(nèi)微生物不同，包括細(xì)菌、古細(xì)菌、真菌等，其中細(xì)菌占主導(dǎo)地位，優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門，兩者占比超過98%。同時，也有報道指出馬[21]、牛[22]、豬[23]等中其胃腸道優(yōu)勢菌群均為厚壁菌門、擬桿菌門，兔盲腸優(yōu)勢菌門順序依次為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門[24]，劉宇等（2019）[9]發(fā)現(xiàn)德州驢盲腸菌群優(yōu)勢順序為厚壁菌門、擬桿菌門、微疣菌門和螺旋體門。本研究發(fā)現(xiàn)驢前腸優(yōu)勢菌門順序為厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門；后腸為厚壁菌門、擬桿菌門、螺旋體門和變形菌門。報道發(fā)現(xiàn)草食動物利用碳水化合物的主要菌群為厚壁菌門微生物[25]，而擬桿菌門則是草食動物分解纖維素的主要菌群[26]，這兩種菌在前后腸微生物中的相對豐度占比，很好的說明后腸是驢耐粗飼的基礎(chǔ)[27]。

菌屬水平上，本研究發(fā)現(xiàn)前腸中以乳桿菌屬為主；后腸主要為豐度小于1%的菌屬，豐度最高菌屬為瘤胃疣微菌屬（盲腸以螺旋體屬為主）。乳桿菌屬多為有益菌，對酸的耐受強(qiáng)，可以選擇的殺死病源微生物。瘤胃疣微菌屬與纖維降解密切相關(guān)，可產(chǎn)生纖維酶降解纖維二糖等纖維類物質(zhì)，屬于典型的纖維降解菌[28-29]。Patra等[30]和Zhao等[31]均證明瘤胃菌科微生物的數(shù)量與纖維素消化利用存在密切關(guān)系。由此可以看出，驢后腸具有極強(qiáng)的纖維素分解微生物基礎(chǔ)，可以很好的解釋其耐粗飼的原因。

FAPROTAX 是基于目前對可培養(yǎng)菌的文獻(xiàn)資料手動整理的原核功能注釋數(shù)據(jù)庫。本試驗發(fā)現(xiàn)，前腸內(nèi)容物微生物功能主要為化能異養(yǎng)和發(fā)酵作用，而后消化道亦以化能異養(yǎng)和發(fā)酵作用為主，但占比由75%下降至25%，同時，氮代謝、哺乳動物和人腸道功能、動物寄生蟲和共生體清除功能、發(fā)酵作用、化能異養(yǎng)等主要集中在前腸，后腸主要為厭氧和好氧作用、氮呼吸、硫細(xì)菌、好氧復(fù)合體降解、人類傳染疾病等功能。這一結(jié)論與Dibaise 等（2008）[32]報道前消化道部位主要依靠機(jī)體消化酶進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，而消化道尤其是盲腸和結(jié)腸與微生物發(fā)酵有關(guān)的結(jié)論一致。同時，這一結(jié)論與微生物類群分布及其功能完全吻合。

4 結(jié)論

本研究基于16S rRNA高通量測序技術(shù)對驢前后腸內(nèi)容物腸道菌群組成多樣性和功能預(yù)測進(jìn)行了分析。本研究得到如下結(jié)論：①驢前后腸部位菌群多樣性和豐富度差別極顯著；②后腸部位內(nèi)容物菌群豐富度和多樣性高于前腸，具有發(fā)酵纖維素的疣微菌屬等菌群基礎(chǔ)；③前腸微生物主要具有氮代謝、動物寄生蟲和共生體清除功能、發(fā)酵作用等功能，后腸主要為厭氧和好氧作用、氮呼吸、硫細(xì)菌等功能。這一結(jié)果從微生物方面，為驢營養(yǎng)代謝及科學(xué)的飼養(yǎng)管理提供理論支持。