超高效液相色譜法同時測定生脈顆粒中3種皂苷類成分含量

蔣燕霞，林榜建，原歡歡，冉亞東，禹奇男

（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，重慶 涪陵 408000）

生脈顆粒為生脈飲改劑型的中藥品種，由紅參、麥冬、五味子3味藥材組方，有生脈、養(yǎng)陰生津功效，能改善冠狀動脈循環(huán)，降低心肌耗氧量，用于治療氣陰兩虧、心悸氣短、脈微自汗等癥。目前，生脈飲的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對五味子醇甲進行含量測定，而無此方君藥紅參活性成分的含量測定項[1-2]。本試驗中采用超高效液相色譜（UPLC）法測定生脈顆粒中3種人參皂苷成分含量，為該制劑的質(zhì)量評價提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200 Infinity Series型超高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；AE2400型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器＜上海＞有限公司）。

1.2 試藥

生脈顆粒（太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司，批號分別為 17090002，17090003，17090004，18110001，18120002，18120003）；人參皂苷 Rg1對照品（批號為110703-201832，含量 92.4% ），人參皂苷 Re 對照品（批號為 110754-201827，含量 93.4% ），人參皂苷 Rb1對照品（批號為 110704-201726，含量 92.7%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果[3-15]

2.1 色譜條件

色譜柱：AgilentZorbaxSB-C18柱（100mm ×2.1mm，1.8 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 ～14 min時 19%A，14～17 min時 19%A→28%A，17～37 min時28%A，37～40 min時 28%A→40%A，40～42 min時40%A→100%A）；流速：0.35 mL／min；檢驗波長：203nm；柱溫：25 ℃；進樣量：1 μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取干燥至恒重的3種人參皂苷對照品各適量，精密稱定，置同一容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成人參皂苷 Rg1，Re，Rb1質(zhì)量濃度分別為199.88，141.52，264.20 μg ／mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品適量，研細(xì)，取5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇100 mL，超聲（功率250 W，頻率40kHz）提取30min，放冷至室溫，濾過，取續(xù)濾液75mL，蒸干，殘渣用水30 mL使溶解，并轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次30 mL，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：取2.2項下供試品溶液及混合對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按人參皂苷Rg1，Re，Rb1計均大于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。

圖1 超高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下混合對照品溶液，用甲醇稀釋，制成系列混合對照品溶液，取1 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg／mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸，得人參皂苷Rg1，Re，Rb1的回歸方程分別為Y1=6.2843X1-53.687，Y2=3.652 5X2+79.816，Y3=4.614 6X3-65.957（r＞0.9990）。結(jié)果表明，人參皂苷 Rg1，Re，Rb1質(zhì)量濃度在 19.99 ～199.88 μg／mL、14.15 ～141.52 μg／mL、26.42～264.20 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：取2.2項下混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷 Rg1，Re，Rb1峰面積的RSD分別為 1.3%，0.9% ，0.8% （n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取2.2項下供試品（批號為18110001）溶液，分別于室溫下放置 0，2，4，6，8，16，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1，Re，Rb1峰面積的RSD分別為 1.6% ，1.1% ，1.5%（n=7），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取樣品（批號為18110001）適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果人參皂苷Rg1，Re，Rb1峰面積的RSD分別為 2.1% ，2.0% ，1.8%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為18110001）適量，共 6 份，各約 2.5 g，精密稱定，分別加入一定量人參皂苷 Rg1，Re，Rb1對照品，按 2.2 項下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

樣品含量測定：取6批樣品各適量，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算樣品含量。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（mg／g，n=3）

3 討論

預(yù)試驗中，對提取方法（超聲提取、回流提取）、提取溶劑（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、20%甲醇）、正丁醇萃取次數(shù)（2次、3次、4次、5次）進行了考察，結(jié)果確定最優(yōu)的樣品前處理方法為甲醇超聲提取30 min，正丁醇萃取3次。對乙腈-水、乙腈 -0.1%磷酸溶液、乙腈 -0.1%冰醋酸溶液進行了預(yù)試驗，結(jié)果各洗脫系統(tǒng)對峰形的影響均不大，為避免損壞色譜柱，故選擇乙腈-水作為流動相。由于所測人參皂苷類成分在低波長下末端有吸收，故選擇203 nm作為檢測波長。

綜上所述，本研究中建立的方法簡便可靠、重復(fù)性好，可用于同時測定生脈顆粒中人參皂苷Rg1，Re，Rb1的含量。