藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及表達(dá)分析

時(shí)丕彪 何 冰 費(fèi)月躍 王 軍 王偉義 魏福友 呂遠(yuǎn)大 顧閩峰,*

藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定及表達(dá)分析

時(shí)丕彪1何 冰2費(fèi)月躍1王 軍1王偉義1魏福友1呂遠(yuǎn)大2顧閩峰1,*

1鹽城市新洋農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站, 江蘇鹽城 224049;2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究所, 江蘇南京 210014

生長(zhǎng)調(diào)控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起重要的調(diào)控作用。藜麥?zhǔn)且环N單體植物即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物, 也是未來(lái)最具潛力的農(nóng)作物之一。但是關(guān)于藜麥GRF基因家族的研究至今尚缺乏報(bào)道。因此, 本研究利用生物信息學(xué)方法, 對(duì)藜麥GRF基因進(jìn)行全基因組鑒定, 并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及組織表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明, 藜麥中共有18個(gè)GRF轉(zhuǎn)錄因子, 蛋白長(zhǎng)度77~621 aa, 分子量8.81~67.38 kD, 等電點(diǎn)5.23~9.37; 每個(gè)成員含有1~4個(gè)內(nèi)含子及2~5個(gè)外顯子, 這些GRF蛋白都具有由31~35個(gè)氨基酸組成的QLQ保守結(jié)構(gòu)域或由25~43個(gè)氨基酸組成的WRC保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明, 藜麥與擬南芥的GRF轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系比水稻更近。表達(dá)圖譜顯示, 藜麥GRF基因具有明顯的組織表達(dá)特異性, 總體在種子中的表達(dá)量較高, 其次是在花序和根中, 在其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較低。

藜麥; GRF轉(zhuǎn)錄因子; 進(jìn)化分析; 表達(dá)分析

轉(zhuǎn)錄因子是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因, 參與植物生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝、繁殖、分化等多種生物學(xué)過(guò)程[1-3]。目前在植物中已發(fā)現(xiàn)60多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族[4], 其中生長(zhǎng)調(diào)控因子(growth-regulating factor, GRF)是植物特有的一類蛋白, 對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起重要的調(diào)控作用[5-7]。GRF轉(zhuǎn)錄因子在N端區(qū)域含有QLQ和WRC兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[8-9], QLQ結(jié)構(gòu)域與GRF互作因子GIF (GRF interacting factors)相互作用形成轉(zhuǎn)錄激活因子[10], WRC結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)功能核定位信號(hào)NLS (nuclear localization signal)區(qū)域和一個(gè)與DNA結(jié)合的鋅指基序[8], 均與GRF轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮生物學(xué)功能密切相關(guān)。

在水稻中首次發(fā)現(xiàn)了GRF基因, 該基因能夠調(diào)控赤霉素誘導(dǎo)的水稻莖的伸長(zhǎng)[11]。近年來(lái), 隨著基因組測(cè)序的完成, 越來(lái)越多物種中的GRF基因被鑒定和研究[12], 其中, 雙子葉模式植物擬南芥中共有9個(gè)GRF成員[8], 單子葉植物模式植物水稻中共有12個(gè)GRF成員[13]。相關(guān)研究表明, 這些GRF基因在生長(zhǎng)發(fā)育活躍的組織中表達(dá)水平較高, 如莖尖、花芽、未成熟的葉片等, 但在成熟的組織或器官中表達(dá)量相對(duì)較低, 其中多種GRF基因參與了葉片原基細(xì)胞增殖的調(diào)控和莖尖分生組織器官的分離[14-19]。在擬南芥[20-21]和毛果楊[22]中發(fā)現(xiàn)GRF基因?qū)ǖ陌l(fā)育起重要的調(diào)控作用; 有些GRF基因還參與擬南芥雌性生殖器官的發(fā)育和胚珠的形成[23],說(shuō)明它們可能與種子的發(fā)育有關(guān)。在油菜中,基因能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞數(shù)目和光合作用來(lái)增加油菜籽產(chǎn)油量[24]。

GRF蛋白主要是通過(guò)與GIF互作形成蛋白復(fù)合體參與這些生物學(xué)過(guò)程[25-28], 而GRF的功能有時(shí)又會(huì)受miR396的調(diào)控, 比如擬南芥中有7個(gè)基因是miR396的靶基因, 其表達(dá)受到miR396的調(diào)控, 進(jìn)而對(duì)擬南芥根、莖、葉的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生影響[14]。GRF的表達(dá)量越高, 并不是越利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育, 如水稻過(guò)量表達(dá)引起植株多種生理缺陷, 包括葉片卷曲、開(kāi)花延遲和心皮發(fā)育不完善[11]; 玉米過(guò)表達(dá)雖能增加葉片大小, 但降低了玉米可育性[29],過(guò)表達(dá)減小了葉片面積[30]; 擬南芥超表達(dá)植株的葉片生長(zhǎng)受到明顯抑制[31]。

藜麥(Willd.)是一種全營(yíng)養(yǎng)谷物, 富含人體必需的9種氨基酸[32], 被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為一種單體植物即可滿足人體基本營(yíng)養(yǎng)需求的食物[33], 并且藜麥對(duì)多種非生物脅迫如鹽堿、干旱、霜凍等具有一定的耐受性[34-36]。因此, 藜麥已引起了研究人員和消費(fèi)者的廣泛關(guān)注。2017年公布了藜麥高質(zhì)量參考基因組, 促進(jìn)了藜麥功能基因組學(xué)的研究[37]。本研究利用生物信息學(xué)手段, 以擬南芥GRF基因家族成員的蛋白質(zhì)序列為參考, 在藜麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)BlastP序列比對(duì), 獲得藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子家族全部成員, 并對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及根據(jù)RNA-seq數(shù)據(jù)對(duì)藜麥GRF基因在不同組織的表達(dá)模式進(jìn)行分析, 旨在為進(jìn)一步研究藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子的功能及GRF影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 基因組數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的來(lái)源

藜麥全基因組數(shù)據(jù)從Phytozome v12 (http:// phytozome.jgi.doe.gov/pz/)中的v1.0獲得、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從NCBI獲得, 擬南芥GRF蛋白序列下載于擬南芥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR (https://www.arabidopsis.org/),水稻GRF蛋白序列下載于水稻全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://rapdb.dna.affrc. go.jp/)。

1.2 藜麥GRF基因家族成員的鑒定及分析

從擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)獲取基因家族成員的蛋白序列, 并以此為查詢對(duì)象在藜麥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp比對(duì), 設(shè)E值為10-5, 將得到的藜麥蛋白序列在Pfam (http://pfam.xfam.org/)和CDD (https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)上檢測(cè)其結(jié)構(gòu)域, 去除沒(méi)有QLQ或WRC結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。

將獲取的藜麥GRF基因的氨基酸序列輸入ExPasy網(wǎng)站(http://au.expasy.org/tool.html), 采用Compute pI/MW工具分析, 得到GRF蛋白的多種理化性質(zhì), 包括氨基酸長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)等。

1.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用ClustalW對(duì)藜麥、擬南芥、水稻GRF的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 使用MEGA 5.05軟件及鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)(bootstrap = 1000)構(gòu)建無(wú)根進(jìn)化樹。

1.4 藜麥GRF基因結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)藜麥GRF基因家族成員的基因組DNA序列及CDS序列, 利用GSDS 2.0 (http://gsds.cbi.pku. edu.cn/)分析其基因結(jié)構(gòu)。

1.5 藜麥GRF家族成員保守結(jié)構(gòu)域分析

在Pfam分析得到藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列起始位置, 利用IBS 1.0繪制結(jié)構(gòu)域位置圖, 并利用ClustalX 2.0軟件對(duì)結(jié)構(gòu)域氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。

1.6 藜麥GRF基因的組織表達(dá)分析

從NCBI下載藜麥生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中各組織器官的RNA-Seq數(shù)據(jù), 包括苗齡為6周的藜麥植株的根、莖、葉片、花序和幼苗以及0周齡的成熟干種子, 以此來(lái)分析藜麥GRF基因的表達(dá)情況。對(duì)各成員的表達(dá)量取log2TPM, 然后用R繪制藜麥GRF基因家族的組織表達(dá)熱圖。

1.7 基因的熒光定量表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步確定從表達(dá)圖譜中篩選出來(lái)的組織表達(dá)特異性較為明顯的6個(gè)GRF基因的表達(dá)模式, 所取樣品與RNA-Seq所選樣品一致。使用TIANGEN試劑盒提取RNA, 用Takara的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第1條鏈, 以各樣品的cDNA為模板, 濃度統(tǒng)一稀釋為100 ng μL-1, 進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,為內(nèi)參基因[38], 各基因特異引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL SYBR green supermix、5.5 μL ddH2O、正反向引物各1 μL、2.5 μL cDNA。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性10 s, 60℃退火30 s, 40個(gè)循環(huán)。采用2–ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥GRF基因家族成員的鑒定及分析

把擬南芥GRF蛋白序列在藜麥數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blastp比對(duì), 對(duì)所獲得的蛋白序列在Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析, 篩選出具有QLQ或WRC保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列, 最終鑒定出18個(gè)藜麥GRF候選基因(表2)。

利用ExPasy對(duì)藜麥GRF基因的理化性質(zhì)分析表明, 不同GRF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列存在較大差異, 氨基酸長(zhǎng)度77~621 aa, 蛋白分子量8.81~67.38 kDa, 其中均以AUR62007538最大, AUR62009885最小。等電點(diǎn)以AUR62013612最大, 為9.37, AUR62006018最小, 為5.23; 其中等電點(diǎn)小于7的GRF蛋白有6個(gè), 偏酸性; 其余的12個(gè)GRF蛋白等電點(diǎn)均大于7, 偏堿性。

表1 定量PCR引物序列

表2 藜麥GRF基因家族成員基本信息

(續(xù)表2)

aa: 氨基酸; MW: 分子量; pI: 等電點(diǎn)。

aa: amino acid; MW: molecular weight; pI: isoelectric point.

2.2 藜麥GRF基因家族系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析

為了更好地了解藜麥GRF基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系, 將藜麥(18個(gè)GRF基因)、擬南芥(9個(gè)GRF基因)和水稻(12個(gè)GRF基因)的GRF蛋白序列進(jìn)行多重比對(duì), 構(gòu)建無(wú)根進(jìn)化樹(圖1)。根據(jù)進(jìn)化樹分支, 將39個(gè)GRF轉(zhuǎn)錄因子劃分為Class I、II、III、IV四類, 其中Class I和Class IV均有6個(gè)藜麥GRF基因, Class II有4個(gè)藜麥GRF基因, Class III存在2個(gè)藜麥GRF基因。Class III和Class IV只有藜麥和擬南芥GRF分布, 不存在水稻GRF基因, 并且在其他兩類中表現(xiàn)出擬南芥與藜麥GRF進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近一些, 說(shuō)明藜麥與擬南芥的GRF轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系比水稻更近。Class III只有3個(gè)基因、和, 說(shuō)明這2個(gè)藜麥GRF基因與擬南芥具有較高的同源性, 在功能上可能也具有相似性。

圖1 藜麥、擬南芥和水稻GRF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 藜麥GRF基因結(jié)構(gòu)分析

如圖2所示, 不同GRF基因的結(jié)構(gòu)存在一定的差異, 除、和具有2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子外, 其他成員均含有2~4個(gè)內(nèi)含子及3~5個(gè)外顯子; 根據(jù)目前藜麥基因組注釋檢測(cè)到, 6個(gè)GRF基因同時(shí)具有5￠-UTR(非翻譯區(qū))和3￠-UTR, 4個(gè)GRF基因只含有3￠-UTR, 其余8個(gè)GRF基因沒(méi)有非翻譯區(qū)。

圖2 藜麥GRF基因家族進(jìn)化樹與基因結(jié)構(gòu)

18個(gè)GRF基因形成了8個(gè)旁系同源基因, 同源基因的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性(圖2)。如和為一對(duì)同源基因, 都含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子, 基因長(zhǎng)度也相似;和為一對(duì)同源基因, 均具有4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子、5￠-UTR及3￠-UTR, 但第2個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)度差異較大。

2.4 藜麥GRF基因家族保守結(jié)構(gòu)域分析

藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列在Pfam上分析結(jié)果顯示, 18個(gè)GRF蛋白均含有QLQ或WRC結(jié)構(gòu)域, 并且兩結(jié)構(gòu)域均位于蛋白的N端(圖3)。其中, AUR62009885、AUR62025191、AUR62028983和AUR62006018只具有QLQ結(jié)構(gòu)域, AUR62035608、AUR62019933、AUR62004236和AUR62013612只具有WRC結(jié)構(gòu)域, 其他10個(gè)GRF轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)具有QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域。從圖3可以看出, 藜麥GRF同源基因?qū)Φ牡鞍组L(zhǎng)度及結(jié)構(gòu)域位置有很高的相似性。

為了進(jìn)一步分析藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域的保守性, 對(duì)2個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 發(fā)現(xiàn)QLQ結(jié)構(gòu)域由31~35個(gè)氨基酸組成, WRC結(jié)構(gòu)域由25~43個(gè)氨基酸組成, 并且兩結(jié)構(gòu)域中均有多個(gè)氨基酸位點(diǎn)是保守不變的(圖4)。QLQ結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列為QX3LX2Q; WRC結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)跨越3個(gè)半胱氨酸C和1個(gè)組氨酸H的C3H模體, 其氨基酸序列為CX9CX10CX2H; 在藜麥中, WRC結(jié)構(gòu)域的保守性比QLQ結(jié)構(gòu)域更高一些。QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域中這些氨基酸保守區(qū)域可能通過(guò)與其他因子相互結(jié)合或相互作用, 從而影響藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子的激活與抑制。

2.5 藜麥GRF基因家族的組織表達(dá)分析

為初步分析藜麥GRF基因的功能, 利用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對(duì)18個(gè)GRF基因在6個(gè)不同組織器官的表達(dá)情況進(jìn)行分析, 包括6周齡的根、莖、葉片、花序和幼苗以及0周齡的成熟干種子。結(jié)果表明, 不同GRF基因在藜麥不同組織器官中的表達(dá)量存在明顯差異(圖5)。除在種子中不表達(dá)外, 其他GRF基因均在種子中有較高的表達(dá)量, 說(shuō)明這些基因可能與藜麥種子的發(fā)育有重要關(guān)系; 各GRF基因在花序中均有表達(dá), 表明它們可能在花序的發(fā)育過(guò)程中起著重要作用; 有9個(gè)GRF基因在根中不表達(dá), 說(shuō)明它們可能沒(méi)有參與藜麥根系的發(fā)育過(guò)程; 所有GRF基因在葉片中均不表達(dá), 可能是因?yàn)镚RF基因與藜麥葉片的發(fā)育關(guān)系不大; 除和外, 其他GRF基因均在莖中不表達(dá), 說(shuō)明這2個(gè)基因可能參與了藜麥莖的發(fā)育過(guò)程; 只有、、和在幼苗中有一定的表達(dá)量, 它們可能調(diào)控著藜麥幼苗的生長(zhǎng)。綜上所述, 藜麥GRF基因具有明顯的組織表達(dá)特異性, 在種子中的表達(dá)量相對(duì)較高, 其次是花序和根, 在其他組織中的表達(dá)量相對(duì)較低, 揭示它們?cè)谵见湶煌M織中可能具有不同的生物學(xué)功能。

圖3 藜麥GRF蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖4 藜麥GRF蛋白QLQ (A)和WRC (B)結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列比對(duì)

為了進(jìn)一步確定GRF基因在藜麥不同組織器官中具有明顯的表達(dá)特異性, 從表達(dá)圖譜中挑選6個(gè)GRF基因并對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析以確定其相應(yīng)的表達(dá)模式。由圖6可知,在種子中的表達(dá)量顯著高于其他組織, 其次是花序, 在根、莖、葉和幼苗中幾乎不表達(dá);和有著相同的組織表達(dá)模式, 在種子中的表達(dá)量相對(duì)較高, 其次是幼苗和花序, 在根、莖、葉中的表達(dá)量相對(duì)較低;和有著相似的組織表達(dá)模式, 在根中的表達(dá)量最高, 其次是幼苗, 在其他組織中表達(dá)量相對(duì)較低甚至不表達(dá);在花序中的表達(dá)量最高, 其次是根和幼苗但表達(dá)量均相對(duì)較低, 在莖、葉和種子中幾乎不表達(dá)。定量PCR分析結(jié)果與上述表達(dá)圖譜結(jié)果基本一致。

圖5 GRF基因在藜麥不同組織中的表達(dá)模式分析

(圖6)

3 討論

隨著基因組測(cè)序技術(shù)的逐漸完善和分子生物學(xué)研究的不斷深入, 大量植物全基因組測(cè)序已經(jīng)完成并陸續(xù)公布了其基因組數(shù)據(jù)庫(kù), 這為鑒定植物基因家族、挖掘功能基因及研究基因功能等提供了極為有利的條件。GRF轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。目前, GRF基因家族在擬南芥[8]、玉米[39]、水稻[13]、番茄[40]、大白菜[5]、大豆[41]等多種植物中已有研究。藜麥作為未來(lái)最具潛力的農(nóng)作物之一, 富含極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 但關(guān)于其GRF基因家族的研究至今仍缺乏報(bào)道。關(guān)于模式植物擬南芥和水稻GRF基因功能的研究較為深入。基因通過(guò)調(diào)控葉綠體的分裂來(lái)增加葉片面積和葉綠素含量, 從而增強(qiáng)植物的光合作用以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[42];是多種滲透脅迫響應(yīng)基因的抑制因子, 通過(guò)與脫水反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合, 從而抑制該基因及其下游一系列滲透應(yīng)激反應(yīng)基因的表達(dá), 可在正常生長(zhǎng)條件下防止植物生長(zhǎng)抑制[43]。過(guò)表達(dá)、、、的轉(zhuǎn)基因水稻植株均增強(qiáng)稻瘟病的抗性, 但各自生長(zhǎng)變化不同,過(guò)表達(dá)導(dǎo)致植株生長(zhǎng)缺陷, 而、、過(guò)表達(dá)則導(dǎo)致水稻產(chǎn)量性狀發(fā)生較好變化[44]。研究表明,能夠調(diào)控2種細(xì)胞分裂素脫氫酶前體基因和的表達(dá), 導(dǎo)致細(xì)胞分裂素水平升高, 從而增加穗長(zhǎng)度, 此外,過(guò)量表達(dá)可增加籽粒硬度[45],與、互作, 從而調(diào)控水稻籽粒大小[46], 對(duì)水稻高產(chǎn)育種和機(jī)械化收獲具有重要意義。

本研究利用生物信息學(xué)手段, 從藜麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共鑒定出18個(gè)GRF基因家族成員, 比擬南芥(9個(gè))和水稻(12個(gè))成員數(shù)目更多, 這可能是由于異源四倍體植物藜麥在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了全基因組復(fù)制和串聯(lián)復(fù)制而導(dǎo)致GRF基因數(shù)目增加[47], 基因擴(kuò)張同時(shí)也增強(qiáng)了藜麥對(duì)外界復(fù)雜多變環(huán)境的適應(yīng)能力。藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子的蛋白長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)等基本特性存在較大差異; 由于內(nèi)含子的不斷插入使其基因結(jié)構(gòu)也發(fā)生一定程度的變化, 每個(gè)成員含有1~4個(gè)內(nèi)含子和2~5個(gè)外顯子, 部分GRF基因含有非翻譯區(qū)。氨基酸序列分析表明, 大部分成員同時(shí)具有QLQ和WRC兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域, 少部分成員只具有其中一種結(jié)構(gòu)域, 其中, QLQ結(jié)構(gòu)域的基序?yàn)镼X3LX2Q, WRC結(jié)構(gòu)域的基序?yàn)镃X9CX10CX2H, WRC結(jié)構(gòu)域的保守性比QLQ結(jié)構(gòu)域更高; QLQ和WRC結(jié)構(gòu)域中這些氨基酸保守區(qū)域可能通過(guò)與其他因子相互結(jié)合或相互作用, 從而影響藜麥GRF蛋白的轉(zhuǎn)錄激活與抑制。對(duì)藜麥、擬南芥與水稻GRF基因家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, 可將其分為4個(gè)亞家族, 其中藜麥和擬南芥的GRF廣泛分布于每個(gè)亞家族, 水稻的GRF基因只存在于Class I和Class II, 表明GRF基因的進(jìn)化在雙子葉植物和單子葉植物中存在差異, 藜麥與擬南芥GRF轉(zhuǎn)錄因子的親緣關(guān)系比水稻更為密切。

藜麥GRF基因主要在特定的組織和器官中表達(dá), 可能在這些組織或器官的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn),、、、和在藜麥種子中的表達(dá)量均顯著高于其他檢測(cè)組織, 說(shuō)明這些基因主要參與了藜麥種子的生長(zhǎng)發(fā)育, 因此, 提高這些基因的表達(dá)水平可能有利于增加藜麥的產(chǎn)量。同源性越高的基因, 其功能越相似。例如,與擬南芥花的發(fā)育有關(guān)[48],和均與的同源性較高, 2個(gè)基因在藜麥花序中的表達(dá)量又相對(duì)較高, 說(shuō)明和可能參與了藜麥花序的發(fā)育過(guò)程。水稻的基因與籽粒大小和籽粒硬度有關(guān)[45-46],其在藜麥中同源性較高的基因?yàn)楹? 二者在種子中的表達(dá)量均顯著高于其他組織, 說(shuō)明這2個(gè)基因可能與藜麥產(chǎn)量性狀有關(guān)。在后續(xù)的研究中還需要利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或基因沉默技術(shù)對(duì)這些基因的功能和作用機(jī)制進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

通過(guò)對(duì)藜麥GRF轉(zhuǎn)錄因子家族全基因組鑒定, 共獲得18個(gè)成員, 分屬4個(gè)不同亞家族, 具有典型的QLQ或WRC保守結(jié)構(gòu)域, 基因表達(dá)具有明顯的組織表達(dá)特異性, 在種子和花序中表達(dá)量較高, 與藜麥籽實(shí)產(chǎn)量緊密相關(guān)。

[1] Schwechheimer C, Bevan M W. The regulation of transcription factor activity in plants., 1998, 3: 378–383.

[2] Chen Y, Cao J. Comparative analysis oftranscription factor family in maize., 2015, 33: 1245–1258.

[3] Kim J H, Tsukaya H. Regulation of plant growth and development by the GROWTH-REGULATING FACTOR and GRF- INTERACTING FACTOR duo., 2015, 66: 6093–6107.

[4] Jin J P, Tian F, Yang D C, Meng Y Q, Kong L, Luo J C, Gao G. PlantTFDB 4.0: toward a central hub for transcription factors and regulatory interactions in plants., 2017, 45: 1040–1045.

[5] Wang F D, Qiu N W, Ding Q, Li J J, Zhang Y H, Li H Y, Gao J W. Genome-wide identification and analysis of the growth-regulating factor family in Chinese cabbage (L. ssp.)., 2014, 15: 807. doi: 10.1186/1471- 2164-15-807.

[6] Debernardi J M, Mecchia M A, Vercruyssen L, Smaczniak C, Kaufmann K, Inze D, Rodriguez R E, Palatnik J F. Post-transcriptional control of GRF transcription factors by microRNA miR396 and GIF co-activator affects leaf size and longevity., 2014, 79: 413–426.

[7] Omidbakhshfard M A, Proost S, Fujikura U, Mueller-Roeber B. Growth-regulating factors (GRFs): a small transcription factor family with important functions in plant biology., 2015, 8: 998–1010.

[8] Kim J H, Choi D, Kende H. Thefamily of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in., 2003, 36: 94–104.

[9] Rodriguez R E, Ercoli M F, Debernardi J M, Breakfield N W, Mecchia M A, Sabatini M, Cools T, De Veylder L, Benfey P N, Palatnik J F. MicroRNA miR396 regulates the switch between stem cells and transit-amplifying cells inroots., 2015, 27: 3354–3366.

[10] Kim J H, Kende H. A transcriptional coactivator,, is involved in regulated leaf growth and morphology in., 2004, 101: 13374–13379.

[11] van der Knaap E, Kim J H, Kende H. A novel gibberellin-induced gene from rice and its potential regulatory role in stem growth., 2000, 122: 695–704.

[12] Cao Y P, Han Y H, Jin Q, Lin Y, Cai Y P. Comparative genomic analysis of the GRF genes in Chinese pear (Rehd), poplar (), grape (),and rice ()., 2016, 7: 1750. doi:10.3389/ fpls.2016.01750.

[13] Choi D, Kim J H, Kende H. Whole genome analysis of thegene family encoding plant-specific putative transcription activators in rice (L.)., 2004, 45: 897–904.

[14] Rodriguez R E, Mecchia M A, Debernardi J M, Schommer C, Weigel D, Palatnik J F. Control of cell proliferation inby microRNA., 2010, 137: 103–112.

[15] Horiguchi G, Kim G T, Tsukaya H. The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of., 2005, 43: 68–78.

[16] Kim J H, Lee B H.ofis required for development of leaves, cotyledons, and shoot apical meristem., 2006, 49: 463–468.

[17] Liu D M, Song Y, Chen Z X, Yu D Q. Ectopic expression of miR396 suppresses GRF target gene expression and alters leaf growth in., 2009, 136: 223–236.

[18] Ercoli M F, Rojas A M, Debernardi J M, Palatnik J F, Rodriguez R E. Control of cell proliferation and elongation by miR396., 2016, 11: e1184809

[19] Lee B H, Jeon J O, Lee M M, Kim J H. Genetic interaction between GROWTH-REGULATING FACTOR and CUP-SHAPED COTYLEDON in organ separation., 2015, 10: e988071

[20] Yang F, Liang G, Liu D, Yu D Q.miR396 mediates the development of leaves and flowers in transgenic tobacco., 2009, 52: 475–481.

[21] Liang G, He H, Li Y, Wang F, Yu D Q. Molecular mechanism of miR396 mediating pistil development in., 2014, 164: 249–258.

[22] Baucher M, Moussawi J, Vandeputte O M, Monteyne D, Mol A, Pérez-Morga D, Jaziri M E I. A role for the miR396/GRF network in specification of organ type during flower development, as supported by ectopic expression ofmiR396c in transgenic tobacco., 2013, 15: 892–898.

[23] Wynn A N, Rueschhoff E E, Franks R G. Transcriptomic characterization of a synergistic genetic interaction during carpel margin meristem development in., 2011, 6: e26231

[24] Liu J, Hua W, Yang H L, Zhan G M, Li R J, Deng L B, Wang X F, Liu G H, Wang H Z. Thegene (GRF2-like gene from) enhances seed oil production through regulating cell number and plant photosynthesis., 2012, 63: 3727–3740.

[25] Lee B H, Ko J H, Lee S, Lee Y, Pak J H, Kim J H. Thegene family performs an overlapping function in determining organ size as well as multiple developmental properties., 2009, 151: 655–668.

[26] Lee B H, Kim J H. Spatio-temporal distribution patterns ofexpression and leaf size control., 2014, 9: 1–4.

[27] Vercruyssen L, Verkest A, Gonzalez N, Heyndrickx K S, Eeckhout D, Han S K, Jégu T, Archacki R, Leene J V, Andriankaja M, De Bodt S, Abeel T, Coppens F, Dhondt S, De Milde L, Vermeersch M, Maleux K, Gevaert K, Jerzmanowski A, Benhamed M, Wagner D, Vandepoele K, De Jaeger G, Inzé D. ANGUSTIFOLIA3 binds to SWI/SNF chromatin remodeling complexes to regulate transcription duringleaf development., 2014, 26: 210–229.

[28] Wu L, Zhang D F, Xue M, Qian J J, He Y, Wang S C. Overexpression of the maize GRF10, an endogenous truncated GROWTH- REGULATING FACTOR protein, leads to reduction in leaf size and plant height., 2014, 56: 1053–1063.

[29] Nelissen H, Eeckhout D, Demuynck K, Persiau G, Walton A, van Bel M, Vervoort M, Candaele J, De Block J, Aesaert S, Van Lijsebettens M, Goormachtig S, Vandepoele K, Van Leene J, Muszynski M, Gevaert K, Inzé D, De Jaeger G. Dynamic changes in ANGUSTIFOLIA3 complex composition reveal a growth regulatory mechanism in the maize leaf., 2015, 27: 1605–1619.

[30] Wu L, Zhang D F, Xue M, Qian J J, He Y, Wang S C. Overexpression of the maize GRF10, an endogenous truncated GROWTH-REGULATING FACTOR protein, leads to reduction in leaf size and plant height., 2014, 56: 1053–1063.

[31] Omidbakhshfard M A, Fujikura U, Olas J J, Xue G P, Balazadeh S, Mueller-Roeber B. GROWTH-REGULATING FACTOR 9 negatively regulates Arabidopsis leaf growth by controlling ORG3 and restricting cell proliferation in leaf primordia., 2018, 14: e1007484.

[32] Ng S C, Anderson A, Coker J, Ondrus M. Characterization of lipid oxidation products in quinoa ()., 2006, 101: 185–192.

[33] Ogungbenle H N. Nutritional evaluation and functional properties of quinoa () flour., 2009, 54: 153–158.

[34] Razzaghi F, Ahmadi S H, Adolf V I, Jensen C R, Jacobsen S E, Andersen M N. Water relations and transpiration of quinoa (Willd.) under salinity and soil drying., 2011, 197: 348–360.

[35] Jacobsen S E, Monteros C, Christiansen J L, Bravo L A, Corcuera L J, Mujica A. Plant responses of quinoa (Willd.) to frost at various phenological stages., 2005, 22: 131–139.

[36] Hariadi Y, Marandon K, Tian Y, Jacobsen S E, Shabala S. Ionic and osmotic relations in quinoa (Willd.) plants grown at various salinity levels., 2011, 62: 185–193.

[37] Jarvis D E, Ho Y S, Lightfoot D J, Schmockel S M, Li B, Borm T J A, Ohyanagi H, Mineta K, Michell C T, Saber N, Kharbatia N M, Rupper R R, Sharp A R, Dally N, Boughton B A, Woo Y H, Gao G, Schijlen E G W M, Guo X J, Momin A A, Negr?o S, Al-Babili S, Gehring C, Roessner U, Jung C, Murphy K, Arold S T, Gojobori T, van der Linden C G, van Loo E N, Jellen E N, Maughan P J, Tester M. The genome of., 2017, 542: 307–312.

[38] Liu J X, Wang R M, Liu W Y, Zhang H L, Guo Y D, Wen R Y. Genome-wide characterization of heat-shock protein 70S fromand expression analyses ofin response to drought stress., 2018, 9: 35. doi: 10.3390/ genes9020035.

[39] Zhang D F, Li B, Jia G Q, Zhang T F, Dai J R, Li J S, Wang S C. Isolation and characterization of genes encoding GRF transcription factors and GIF transcriptional coactivators in maize (L.)., 2008, 175: 809–817.

[40] Khatun K, Robin A H K, Park J I, Nath U K, Kim C K, Lim K B, Nou I S, Chung M Y. Molecular characterization and expression profiling of tomato GRF transcription factor family genes in response to abiotic stresses and phytohormones., 2017, 18: 1056. doi:10.3390/ijms18051056.

[41] Noon J B, Hewezi T, Baum T J. Homeostasis in the soybean miRNA396-GRF network is essential for productive soybean cyst nematode infections., 2019, 70: 1653–1668.

[42] Vercruyssen L, Tognetti V B, Gonzalez N, Van Dingenen J, De Milde L, Bielach A, De Rycke R, Van Breusegem F, Inzé D. GROWTH REGULATING FACTOR5 stimulateschloroplast division, photosynthesis, and leaf longevity., 2015, 167: 817–832.

[43] Kim J S, Mizoi J, Kidokoro S, Maruyama K, Nakajima J, Nakashima K, Mitsuda N, Takiguchi Y, Ohme-Takagi M, Kondou Y, Yoshizumi T, Matsui M, Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K.growth-regulating factor7 functions as a transcriptional repressor of abscisic acid- and osmotic stress-responsive genes, including DREB2A., 2012, 24: 3393–3405.

[44] Chandran V, Wang H, Gao F, Cao X L, Chen Y P, Li G B, Zhu Y, Yang X M, Zhang L L, Zhao Z X, Zhao J H, Wang Y G, Li S, Fan J, Li Y, Zhao J Q, Li S Q, Wang W M. miR396-OsGRFs module balances growth and rice blast disease-resistance., 2019, 14: 1999. doi: 10.3389/fpls.2018.01999.

[45] Sun P Y, Zhang W H, Wang Y H, He Q, Shu F, Liu H, Wang J, Wang J M, Yuan L P, Deng H F.controls grain shape, panicle length and seed shattering in rice., 2016, 58: 836–847.

[46] Li S C, Gao F Y, Xie K L, Zeng X H, Cao Y, Zeng J, He Z S, Ren Y, Li W B, Deng Q M, Wang S Q, Zheng A P, Zhu J, Liu H N, Wang L X, Li P. The OsmiR396c-OsGRF4-OsGIF1 regulatory module determines grain size and yield in rice., 2016, 14: 2134–2146.

[47] Panchy N, Lehti-Shiu M, Shiu S H. Evolution of gene duplication in plants., 2016, 171: 2294–2316.

[48] Yang C Y, Huang Y H, Lin C P, Lin Y Y, Hsu H C, Wang C N, Liu L Y, Shen B N, Lin S S. MicroRNA396-targeted SHORT VEGETATIVE PHASE is required to repress flowering and is related to the development of abnormal flower symptoms by the phyllody symptoms1 effector., 2015, 168: 1702–1716.

Identification and expression analysis of GRF transcription factor family of

SHI Pi-Biao1, HE Bing2, FEI Yue-Yue1, WANG Jun1, WANG Wei-Yi1, WEI Fu-You1, LYU Yuan-Da2, and GU Min-Feng1,*

1Xinyang Agricultural Experiment Station of Yancheng City, Yancheng 224049, Jiangsu, China;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, Jiangsu, China

Growth-regulating factors (GRFs) are plant-specific proteins which play an important role in regulating plant growth and development. Quinoa is one of the plant sources that can meet human daily nutritional needs and is also considered as one of the most promising crops in the future. However, no systematical study about GRF gene family has been performed in quinoa to date. In this study, the GRFs in the whole genome of quinoa were identified by bioinformatics method, and their physicochemical properties, gene structure, conserved domain, phylogenetic relationship and tissue expression were analyzed. There were 18 GRF transcription factors in quinoa, with the protein length from 77 to 621 aa, the molecular weight from 8.81 to 67.38 kD and the isoelectric point from 5.23 to 9.37. Each member contained 1–4 introns and 2–5 exons. And all 18 GRF proteins possessed highly conserved QLQ domain composed of 31–35 aa or WRC domain composed of 25–43 aa. Phylogenetic analysis showed that the GRF transcription factors were more closely related between quinoa andthan between quinoa and rice. The expression level of GRFs was higher in seed, moderate in inflorescence and root, and relatively lower in other tissues, showing obvious tissue expression specificity.

; GRF transcription factor; phylogenetic analysis; expression analysis

本研究由江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蔬菜)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(鹽城)推廣示范基地項(xiàng)目(JATS(2018)137)和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院探索性顛覆性創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(ZX(17)2015)資助。

This study was supported by the Promotion Demonstration Base Program (Yancheng) of Jiangsu Modern Agriculture (Vegetable) Industry Technology System (JATS(2018)137) and Exploratory and Disruptive Innovation Program of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences (ZX(17)2015).

顧閩峰, E-mail: ycgmf@126.com

E-mail: 1032175660@qq.com

2019-03-22;

2019-06-22;

2019-07-13.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190712.0844.002.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94049