甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測(cè)

李陽(yáng)陽(yáng) 荊蓉蓉 呂蓉蓉 石鵬程 李 欣 王 芹 吳 丹 周清元 李加納 唐章林,*

甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析及候選基因預(yù)測(cè)

李陽(yáng)陽(yáng)1,2,3,**荊蓉蓉1,3,**呂蓉蓉1,2,3石鵬程1,2,3李 欣1,2,3王 芹1,2,3吳 丹1,2,3周清元1,3李加納1,2,3唐章林1,2,3,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715;3重慶市油菜工程技術(shù)研究中心, 重慶 400715

濕害嚴(yán)重影響油菜的產(chǎn)量和品質(zhì), 前人在耐濕機(jī)制和生理響應(yīng)等方面已經(jīng)做了許多研究, 但涉及油菜耐濕相關(guān)基因的研究相對(duì)較少。本研究以248份甘藍(lán)型油菜品種(系)為材料, 進(jìn)行濕害脅迫處理, 調(diào)查了8個(gè)濕害響應(yīng)的相關(guān)性狀, 基于60K Illumina Infinium SNP芯片基因型數(shù)據(jù)對(duì)各性狀耐濕系數(shù)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析和濕害響應(yīng)候選基因預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示, 濕害脅迫較正常灌溉油菜幼苗綠葉數(shù)減少, 地上部干重和鮮重以及葉片可溶性蛋白含量降低, 葉片POD酶活性和MDA含量略有升高。地下部干重和鮮重在多數(shù)材料中降低, 而在有些材料中升高, 變化幅度均較小。經(jīng)全基因組關(guān)聯(lián)分析共檢測(cè)到與耐濕系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記36個(gè), 可解釋表型變異8.28%~12.95%, 其中17個(gè)所關(guān)聯(lián)的耐濕系數(shù)在基因型間具有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)差異, 其所在的Blocks共覆蓋了71個(gè)候選基因, 包括Blast到同源擬南芥基因64個(gè), 主要編碼轉(zhuǎn)錄因子(如Transcription initiation factor IIF、bZIP68、myb-like HTH transcriptional regulator family protein)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如SUC2)、生長(zhǎng)抑制子(如ING2)、蛋白磷酸酶(如Protein phosphatase 2C family protein)、DNA/RNA結(jié)合蛋白[如bHLH DNA-binding superfamily protein、RNA-binding (RRM/RBD/RNP motifs) family protein]、激素響應(yīng)蛋白(如ARF8、ADC2、ERD6、NF-YC9)以及氧化脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫或水分剝奪響應(yīng)蛋白(如ERD6、NP1、TIR-NBS-LRR、CRT1b)等。本研究可為揭示甘藍(lán)型油菜耐濕機(jī)理和培育耐濕新品種奠定基礎(chǔ)。

甘藍(lán)型油菜; 濕害脅迫響應(yīng)性狀; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 候選基因

水分是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的重要非生物因子, 水分過(guò)多或過(guò)少均會(huì)對(duì)作物產(chǎn)生不同程度的危害。濕害是由于土壤水分超過(guò)田間最大持水量并長(zhǎng)期處于飽和狀態(tài), 對(duì)作物生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生的危害[1], 主要是對(duì)作物產(chǎn)生次生脅迫[2], 導(dǎo)致作物根系缺氧, 出現(xiàn)生理失水, 嚴(yán)重時(shí)會(huì)使根系腐爛發(fā)臭[3]。濕害可造成細(xì)胞質(zhì)膜過(guò)氧化, 離子滲漏量增加, 無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)吸收在植株體內(nèi)重新分布, 丙二醛含量升高, 總糖量和淀粉酶活性降低, 保護(hù)酶系統(tǒng)受損, 嚴(yán)重時(shí)會(huì)使蛋白質(zhì)分解、原生質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞而致死[4]。濕害會(huì)使植株變矮, 生長(zhǎng)緩慢, 生育期延長(zhǎng), 葉片由下至上逐漸黃化, 綠葉面積減少, 與光合作用相關(guān)的酶活性降低, 光合作用減弱, 光合產(chǎn)物減少且運(yùn)輸減慢, 從而影響植株生長(zhǎng)發(fā)育和作物產(chǎn)量、品質(zhì)[5-8]。

油菜是我國(guó)重要的油料作物之一, 也是我國(guó)食用植物油的主要來(lái)源, 其種植面積和總產(chǎn)量均占全球的30%左右[9]。長(zhǎng)江流域是我國(guó)冬油菜主要種植區(qū)域, 其種植面積和產(chǎn)量均占全國(guó)90%以上[10]。該區(qū)域秋季多陰雨且實(shí)行水旱輪作制度, 土壤黏重、透氣性差、排水困難、地下水位高[11], 是油菜濕澇災(zāi)害的多發(fā)地和重災(zāi)區(qū)。

作物的耐濕能力取決于形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝上對(duì)缺氧的適應(yīng)能力。作物對(duì)濕害脅迫的響應(yīng)極其復(fù)雜, 不僅表現(xiàn)出長(zhǎng)期適應(yīng)性[12], 在細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織和形態(tài), 甚至線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體等亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面也表現(xiàn)出適應(yīng)反應(yīng)[13], 同時(shí)還通過(guò)基因表達(dá)調(diào)控調(diào)節(jié)自身的內(nèi)環(huán)境和代謝途徑[14]。油菜的不同類型、品種或品系的耐濕性不同, 張學(xué)昆等[15]研究甘藍(lán)型油菜耐濕性發(fā)現(xiàn), 缺氧脅迫下, 耐濕品種的活性氧清除系統(tǒng)能降低膜脂過(guò)氧化程度, 同時(shí)顯著增加滲透調(diào)節(jié)的有機(jī)物含量, 提高對(duì)抗缺氧脅迫的能力。目前, 針對(duì)油菜, 特別是甘藍(lán)型油菜耐濕性的研究較少, 且主要采用缺氧萌發(fā)種子或其他水淹處理, 通過(guò)測(cè)定幼苗相關(guān)性狀篩選耐濕資源[11,16-18]。在遺傳研究方面, 叢野等[19]發(fā)現(xiàn), 甘藍(lán)型油菜耐濕性的遺傳受2對(duì)完全顯性的主基因+加性-顯性多基因控制。李真[4]利用150個(gè)甘藍(lán)型油菜DH系, 通過(guò)183個(gè)SSR標(biāo)記和157個(gè)AFLP標(biāo)記在對(duì)照和濕害脅迫下共檢測(cè)到45個(gè)QTL, 其中在2個(gè)環(huán)境下同時(shí)檢測(cè)到9個(gè), 與耐濕系數(shù)相關(guān)的有11個(gè)。

本研究調(diào)查濕害脅迫響應(yīng)相關(guān)性狀, 構(gòu)建耐濕系數(shù), 基于60K Illumina Infinium SNP芯片基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 并預(yù)測(cè)耐濕候選基因, 旨在為利用分子標(biāo)記輔助選擇培育耐濕甘藍(lán)型油菜新品種和揭示甘藍(lán)型油菜濕害響應(yīng)分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

將248份甘藍(lán)型油菜品種(系)播種于重慶市油菜工程技術(shù)研究中心歇馬基地旱棚的盆缽(直徑25 cm, 高30 cm)中, 當(dāng)幼苗長(zhǎng)至四葉一心時(shí), 選取幼苗長(zhǎng)勢(shì)均勻、植株大小一致的盆缽進(jìn)行正常灌溉(well watering, WW)和濕害脅迫(waterlogging, WL)處理, WW組土壤含水量維持在20%~23%之間, WL組維持土壤最大持水量(30%左右)且土壤表面無(wú)積水, 采用浙江托普儀器有限公司的TZS-1K土壤水分測(cè)定儀測(cè)定土壤含水量。持續(xù)處理4周后調(diào)查幼苗的綠葉數(shù)(green leaf number, GLN)、地上部鮮重(shoot fresh weight, SFW)和干重(shoot dry weight, SDW)、地下部鮮重(root fresh weight, RFW)和干重(root dry weight, RDW)以及葉片過(guò)氧化物酶(peroxidase, POD)活性、可溶性蛋白(soluble protein, Protein)含量和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量, 并計(jì)算各性狀的耐濕系數(shù)(waterlogging resistance index, WLRI): 耐濕系數(shù) = WL性狀表型值/WW性狀表型值。

1.2 性狀調(diào)查和測(cè)定

1.2.1 GLN調(diào)查 心葉完全平展視為1片葉, 綠色面積超過(guò)葉片面積1/2的視為綠葉。

1.2.2 SFW、SDW、RFW和RDW測(cè)定 隨機(jī)選取每材料WL和WW各3株, 稱其地上部鮮重(g), 將根部洗凈擦干后稱其地下部鮮重(g)。然后于110℃殺青30 min, 75℃烘至恒重, 稱其地上部干重(g)和地下部干重(g)。

1.2.3 葉片POD活性和Protein、MDA含量測(cè)定

取倒數(shù)第二、三片葉的混合樣品, 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒(A084-3)測(cè)定POD活性(U g-1FW), 參照鄒琦[20]所用考馬斯亮藍(lán)-G250染色法測(cè)定Protein含量(mg g-1FW), 參照李合生[21]所用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量(μmol g-1FW)。各材料每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 基因型分析

采用油菜60K Illumina Infinium SNP芯片(包含52,157個(gè)SNP標(biāo)記)進(jìn)行基因型分析, 按照Qu等[22]的方法刪除位置不確定的標(biāo)記以及缺失率大于20%和最小等位基因頻率小于5%的標(biāo)記, 保留32,839個(gè)SNP標(biāo)記用于后續(xù)分析。

1.4 連鎖不平衡分析

使用Tassel 5.2.1[23]基于32,839個(gè)SNP標(biāo)記對(duì)各染色體進(jìn)行連鎖不平衡分析,2的衰減閾值定為0.2。

1.5 群體結(jié)構(gòu)分析

使用STRUCTURE 2.3.4[24]進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析,值依次取1~10, 每個(gè)值運(yùn)算5次, 蒙特卡羅迭代(Markov Chain Monte Carlo, MCMC)和模擬參數(shù)迭代(length of bum-in period)值均為100,000。

1.6 親緣關(guān)系分析

使用Tassel 5.2.1進(jìn)行親緣關(guān)系分析, 小于0的親緣關(guān)系值取為0[25]。

1.7 關(guān)聯(lián)分析、單倍型分析和候選基因預(yù)測(cè)

利用Tassel 5.2.1及6種模型(na?ve, Q, PCA, K, K+Q, K+PCA)對(duì)8個(gè)性狀的WLRI進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 根據(jù)各模型檢測(cè)到的值與期望值的偏離程度選擇最佳模型, 利用MATLAB 2015b繪制QQ圖(Quantile-quantile Plot)和最佳模型Manhattan圖。顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記的閾值為3.045×10-5(1/32,839)。

對(duì)各關(guān)聯(lián)SNP不同基因型材料的耐濕系數(shù)進(jìn)行測(cè)驗(yàn), 將不同SNP基因型間具有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)差異的標(biāo)記稱為顯著性標(biāo)記。利用haploView[26]對(duì)顯著性標(biāo)記所在LD區(qū)間的SNP進(jìn)行單倍型分析, 參照Qu等[22]設(shè)定參數(shù)。根據(jù)已公布的甘藍(lán)型油菜“”基因組信息(http://www. genoscope.cns.fr/brassicanapus/)獲取顯著性標(biāo)記所在的Block區(qū)間的基因及序列, 通過(guò)BLAST與擬南芥基因進(jìn)行同源性比對(duì), 根據(jù)擬南芥基因注釋(https://www.arabidopsis.org/)預(yù)測(cè)甘藍(lán)型油菜耐濕響應(yīng)相關(guān)候選基因的功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型數(shù)據(jù)分析

8個(gè)性狀的方差分析結(jié)果表明, 每個(gè)性狀在水分間、材料間以及水分×材料互作間均存在極顯著(<0.01)差異(表1)。由圖1可知, 絕大多數(shù)材料GLN、SDW、SFW和Protein的耐濕系數(shù)小于1, MDA、POD的耐濕系數(shù)略大于1; 部分材料RFW和RDW的耐濕系數(shù)小于1, 但大多數(shù)材料RFW和RDW的耐濕系數(shù)接近于1。由此可見(jiàn), 濕害會(huì)降低油菜幼苗的綠葉數(shù)、地上部鮮重、干重和葉片的可溶性蛋白含量, 會(huì)使葉片的丙二醛含量、POD活性升高, 地下部干重和地下部鮮重的變化在多數(shù)材料中表現(xiàn)為降低, 在有些材料中表現(xiàn)為升高, 但變化幅度較小。

表1 甘藍(lán)型油菜幼苗濕害脅迫響應(yīng)性狀的方差分析

GLN: 綠葉數(shù); SFW: 地上部鮮重; SDW: 地上部干重; RFW: 地下部鮮重; RDW: 地下部干重; POD: 過(guò)氧化物酶活性; MDA: 丙二醛含量; Protein: 可溶性蛋白含量。**< 0.01。

GLN: green leaf number; SFW: shoot fresh weight; SDW: shoot dry weight; RFW: root fresh weight; RDW: root dry weight; POD: peroxidase activity; MDA: malondialdehyde content; Protein: soluble protein content.**< 0.01.

圖1 甘藍(lán)型油菜幼苗濕害脅迫響應(yīng)性狀耐濕系數(shù)頻數(shù)分布圖

縮寫(xiě)同表1。Abbreviations are the same as those given in Table 1.

2.2 親緣關(guān)系和群體結(jié)構(gòu)

由圖2可知, 91%的材料間的親緣系數(shù)小于0.2, 其中親緣系數(shù)為0的材料占56%。由此可見(jiàn), 試驗(yàn)材料間的親緣關(guān)系較弱。

由群體結(jié)構(gòu)分析結(jié)果(圖3)可知, 當(dāng)=2時(shí),D有最大值, 試驗(yàn)材料可分為2個(gè)亞群(P1和P2), 如圖4所示。將Q矩陣的臨界值設(shè)為0.7, 其中16個(gè)材料屬于P1亞群, 大多數(shù)為來(lái)源于丹麥、加拿大和中國(guó)的春性甘藍(lán)型油菜; 168個(gè)材料屬于P2亞群, 大多數(shù)為來(lái)源于中國(guó)的冬性或半冬性甘藍(lán)型油菜。64個(gè)材料位于P1亞群與P2亞群之間, 大多數(shù)為來(lái)源于中國(guó)的半冬性甘藍(lán)型油菜。

圖2 248份甘藍(lán)型油菜品種(系)的親緣系數(shù)頻率分布圖

圖3 2個(gè)連續(xù)K值所對(duì)應(yīng)的后驗(yàn)概率的變化速率(DK)

圖4 248份甘藍(lán)型油菜品種(系)群體結(jié)構(gòu)分布圖

2.3 LD分析

連鎖不平衡分析LD (2)平均值與遺傳距離(Mb)之間的變化如圖5所示, 當(dāng)2閾值設(shè)為0.2時(shí), 估算的各染色體衰減距離如表2所示。由圖5和表2可知, A亞基因組的衰減速率較C亞基因組快。

2.4 關(guān)聯(lián)分析

為了較好地控制關(guān)聯(lián)分析的假陽(yáng)性和假陰性, 利用32,839個(gè)有效SNP位點(diǎn), 基于na?ve、Q、PCA、K、K+Q和K+PCA 六種模型對(duì)濕害脅迫響應(yīng)的8個(gè)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析, 結(jié)果如圖6、圖7和表3所示。根據(jù)各性狀的WLRI, 基于6種模型的-lg()觀察值與期望值的接近程度, 選擇最佳模型。最終, SDW和RFW的最佳模型為Q模型, SFW和GLN的最佳模型為PCA模型, RDW的最佳模型為K+Q模型, POD、MDA和Protein的最佳模型為K+PCA模型。

對(duì)各性狀WLRI共篩選到36個(gè)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn), 分布在A01、A02、A03、A04、A07、A08、A09、A10、C01、C02、C03、C04、C05、C07、C09等15條染色體上, 可解釋的表型變異為8.28%~ 12.95% (表3)。對(duì)SFW-WLRI與SDW-WLRI檢測(cè)到4個(gè)相同的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)(Bn-A04-p6975646、Bn-A04-p6978163、Bn-A10-p15740896和Bn-scaff_ 16531_1-p428890), 與SFW-WLRI顯著關(guān)聯(lián)的Bn- A04-p6980459、Bn-A04-p6975646和Bn-A04-p6978163位于同一LD區(qū)間, 與GLN-WLRI顯著關(guān)聯(lián)的Bn- scaff_20901_1-p1110262和Bn-A06-p3088460位于同一LD區(qū)間。

測(cè)驗(yàn)結(jié)果顯示, 17個(gè)SNP標(biāo)記(后續(xù)稱為顯著性SNP標(biāo)記)所關(guān)聯(lián)的WLRI在不同的SNP基因型間具有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)的差異(表4)。

表2 甘藍(lán)型油菜各染色體的衰減距離

圖5 甘藍(lán)型油菜染色體連鎖不平衡衰減曲線

圖6 甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀耐濕系數(shù)基于6種模型的關(guān)聯(lián)分析QQ圖

圖7 甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀耐濕系數(shù)基于最佳模型關(guān)聯(lián)分析的Manhattan圖

表3 甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀WLRI顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記

(續(xù)表3)

a、b、c、d標(biāo)注的為對(duì)不同濕害脅迫響應(yīng)性狀耐濕系數(shù)關(guān)聯(lián)分析所檢測(cè)到的相同SNP位點(diǎn)?？s寫(xiě)同表1。

The SNPs marked with a, b, c, d were identified by GWAS for WLRI of different waterlogging-responding traits. Abbreviations are the same as those given in Table 1.

表4 甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記不同基因型的耐濕系數(shù)

(續(xù)表4)

(續(xù)表4)

括號(hào)內(nèi)數(shù)值為具有此類基因型的材料數(shù); 同一SNP標(biāo)記下不同基因型間的耐濕系數(shù), 標(biāo)有不同大寫(xiě)字母表示差異達(dá)到1%顯著水平, 標(biāo)有不同小寫(xiě)字母表示差異達(dá)到5%顯著水平?？s寫(xiě)同表1。

The value in bracets is the number of materials with such genotypes. Under the same SNP marker, the WLRIs between different genotypes are marked with different capital letters indicating the difference reached the significant probability level of 1%, and those with different lowercase letters indicating the difference reached the significant probability level of 5%. Abbreviations are the same as those given in Table 1.

2.5 單倍型分析

對(duì)17個(gè)顯著性標(biāo)記所在LD區(qū)間的SNP進(jìn)行單倍型分析表明, 顯著性標(biāo)記Bn-A02-p13803435、Bn-A09- p20263302、Bn-A09-p21935602、Bn-A10- p15740896、Bn-scaff_16531_1-p428890、Bn-scaff_ 17919_1-p94976、Bn-A06-p3088460和Bn-scaff_18062_1-p214669與至少1個(gè)SNP標(biāo)記位于同一Block, 顯著性標(biāo)記Bn- A04-p6975646、Bn-A04-p6978163和Bn-A04- p6980459與其他7個(gè)SNP位于同一個(gè)72 kb跨度的Block, Bn-A03-p7079712、Bn-A03-p11122273、Bn-scaff_21884_1-p644186、Bn-A09-p30788157、Bn-scaff_23954_1-p1045541和Bn-scaff_20901_1- p1110262未與其他SNP形成Block (圖8)。由于在后續(xù)分析中未篩選到候選基因, 因此Bn-A03- p11122273、Bn-scaff_17919_1-p94976和Bn-scaff_ 21884_1-p644186未在圖8中列出。

2.6 候選基因預(yù)測(cè)

顯著性標(biāo)記所在Block區(qū)間共包含71個(gè)候選基因(圖8和表5), 其中、、、、、和共7個(gè)未Blast到同源的擬南芥基因, 其余64個(gè)均可通過(guò)同源的擬南芥基因注釋預(yù)測(cè)其功能, 它們主要編碼轉(zhuǎn)錄因子(如, transcription initiation factor IIF;, bZIP68;, myb-like HTH transcriptional regulator family protein), 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(如, SUC2),液泡蛋白質(zhì)分揀蛋白[如, vacuolar protein sorting 41 (VPS41)], 生長(zhǎng)抑制子(如, ING2), DNA/RNA結(jié)合蛋白[如和, basic helix-loop-helix (bHLH) DNA-binding superfamily protein;, RNA-binding (RRM/RBD/ RNP motifs) family protein], 酶類(如, protein phosphatase 2C family protein;, UDP-glucose 6-dehydrogenase family protein;, HXXXD-type acyl-transferase family protein;, saccharopine dehydrogenase;, alpha/beta-Hydrolases superfamily protein), 激素響應(yīng)蛋白[如, SAUR- like auxin-responsive protein family;, auxin response factor 8 (ARF8);, arginine decarboxylase 2 (ADC2);, nuclear factor Y (NF-YC9)], 氧化脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫或水分剝奪響應(yīng)蛋白[如, EARLY RESPONSE TO DEHYDRATION 6 (ERD6);, NPK1-related protein kinase 1 (NP1);, TIR-NBS-LRR;, calreticulin 1b (CRT1b)]等。和所編碼的蛋白功能未知。

圖8 顯著性標(biāo)記所在的Blocks及候選基因

顯著性標(biāo)記用黑色邊框標(biāo)示, 候選基因用下畫(huà)線標(biāo)示。

Significant markers are marked with black border and the candidate genes are underlined.

表5 甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀耐濕系數(shù)候選基因相關(guān)信息

(續(xù)表5)

3 討論

張學(xué)昆等[15]研究發(fā)現(xiàn), 油菜苗期濕害處理使植株變得矮小, 葉片發(fā)黃, 莖稈纖細(xì), 可溶性糖和丙二醛含量升高, SOD酶活性增強(qiáng), 而POD酶活性在耐濕材料中顯著提高, 在濕害敏感材料中顯著降低。李浩杰等[27]認(rèn)為, 濕害脅迫抑制了油菜生長(zhǎng), 使得根冠比、根干重下降。李真等[11]對(duì)油菜DH群體苗期的耐濕性鑒定發(fā)現(xiàn), 濕害脅迫后各家系的根干重、地上部干重都較正常灌溉組下降。涂玉琴等[28]研究發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜幼苗的綠葉數(shù)在濕害脅迫后明顯減少, 黃葉數(shù)增加, 地上部鮮重和干重顯著低于對(duì)照。本研究結(jié)果顯示, 濕害脅迫后, 甘藍(lán)型油菜幼苗綠葉數(shù)減少, 地上部鮮重、干重均降低, POD酶活性和MDA含量升高, 這與前人研究結(jié)果基本一致。

陳龍等[29]認(rèn)為植物在遭受逆境脅迫時(shí), 一些原有的蛋白質(zhì)合成受到抑制, 逆境蛋白被誘發(fā)合成以提高植物的耐脅迫能力。濕害脅迫對(duì)油菜幼苗可溶性蛋白含量的影響, 前人的研究結(jié)果不盡一致。范其新[30]研究發(fā)現(xiàn)濕害脅迫前后油菜幼苗的可溶性蛋白含量變化不大。張學(xué)昆等[15]發(fā)現(xiàn)濕害處理使油菜幼苗可溶性蛋白含量升高。在薛遠(yuǎn)超[31]研究中, 濕害脅迫下油菜苗期可溶性蛋白含量耐濕系數(shù)為0.68~1.44, 說(shuō)明在有的材料中可溶性蛋白含量升高, 而有的材料降低。陳娟妮等[18]對(duì)長(zhǎng)江流域主要甘藍(lán)型油菜品種苗期耐濕性鑒定發(fā)現(xiàn), 濕害使可溶性蛋白有不同程度的降低, 本研究的結(jié)果與此一致。濕害脅迫下, 可溶性蛋白含量的變化可能與試驗(yàn)材料的耐濕性強(qiáng)弱、濕害脅迫程度和時(shí)間有關(guān)。本研究的濕害脅迫時(shí)間為4周, 可能由于多數(shù)材料可溶性蛋白的分解加劇, 合成受阻, 導(dǎo)致可溶性蛋白含量有所降低。

李真等[11]和涂玉琴等[28]發(fā)現(xiàn), 濕害脅迫后油菜幼苗地下部鮮重和干重均顯著低于對(duì)照, 而薛遠(yuǎn)超[31]對(duì)油菜苗期進(jìn)行淹水處理(保持水面高于土面3 cm), 發(fā)現(xiàn)不同材料地下部干重耐濕系數(shù)為0.24~3.91, 平均為1.03, 說(shuō)明大多數(shù)材料在受到濕害脅迫后地下部干重會(huì)增加。本研究的結(jié)果與此一致, 其可能原因是本研究的濕害脅迫處理土壤表面無(wú)積水, 對(duì)部分耐濕性強(qiáng)的材料根系生長(zhǎng)抑制較小, 且受到濕害脅迫后形成了部分不定根, 使根的總量超過(guò)了正常灌溉的對(duì)照。李真等[11]也發(fā)現(xiàn)油菜DH群體受到淹水處理后部分耐濕性強(qiáng)的株系植株下胚軸接近水表面處形成了許多不定根。

本研究對(duì)8個(gè)濕害脅迫響應(yīng)性狀的耐濕系數(shù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測(cè)到36個(gè)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn), 可解釋8.28%~12.95%的表型變異, 其中17個(gè)顯著性標(biāo)記所關(guān)聯(lián)的耐濕系數(shù)在不同的SNP基因型間具有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)的差異, 而其余19個(gè)差異不顯著, 原因可能是關(guān)聯(lián)分析所采用的閾值(1/32,839)對(duì)于某些性狀偏高, 導(dǎo)致出現(xiàn)假陽(yáng)性的關(guān)聯(lián)位點(diǎn)。17個(gè)顯著性標(biāo)記所在的Blocks覆蓋了71個(gè)候選基因, 其中64個(gè)可通過(guò)同源的擬南芥基因注釋預(yù)測(cè)其功能。有研究表明, ARF8為根生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控所必須, 參與生長(zhǎng)素激活的信號(hào)通路[32], 精氨酸脫羧酶ADC2響應(yīng)ABA、JA、冷脅迫、滲透脅迫、氧化脅迫、鹽脅迫、機(jī)械損傷等[33], TIR- NBS-LRR蛋白具有應(yīng)激響應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)功能[34], ERD6響應(yīng)ABA、鹽脅迫和水分剝奪[35], NF-YC9參與脫落酸激活和赤霉素介導(dǎo)的信號(hào)通路[36], NPK1- related protein kinase 1 (NP1)響應(yīng)氧化脅迫[37], CRT1b響應(yīng)氧化脅迫和鹽脅迫[38-39]。它們對(duì)應(yīng)的甘藍(lán)型油菜同源基因在本研究中都被預(yù)測(cè)到。許多研究發(fā)現(xiàn), miRNA和可變剪接在濕害脅迫響應(yīng)過(guò)程中具有重要作用, Zou等[40]對(duì)甘藍(lán)型油菜苗期濕害脅迫下根部轉(zhuǎn)錄組分析檢測(cè)到了一系列“DNA/RNA binding”基因。本研究檢測(cè)到了3個(gè)DNA binding候選基因和1個(gè)RNA binding候選基因。根據(jù)這些候選基因注釋的功能可以推測(cè), 甘藍(lán)型油菜可能通過(guò)miRNA或可變剪接調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、激素響應(yīng)及一系列酶類和功能蛋白等響應(yīng)濕害脅迫, 同時(shí)也可能存在與其他非生物脅迫和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的基因參與濕害脅迫響應(yīng)過(guò)程。本研究篩選的與甘藍(lán)型油菜濕害脅迫響應(yīng)性狀顯著關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記和候選基因, 為進(jìn)一步進(jìn)行基因功能驗(yàn)證、闡釋濕害脅迫響應(yīng)機(jī)制奠定了基礎(chǔ), 將有助于耐濕品種的培育。

4 結(jié)論

濕害脅迫較正常灌溉, 油菜幼苗綠葉數(shù)減少, 地上部干重和鮮重以及葉片可溶性蛋白含量降低, 葉片POD酶活性和MDA含量略有升高。地下部干重和鮮重在多數(shù)材料中降低, 而在有些材料中升高, 變化幅度均較小。共檢測(cè)到與耐濕系數(shù)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記36個(gè)。17個(gè)所關(guān)聯(lián)的耐濕系數(shù)在基因型間具有顯著(<0.05)或極顯著(<0.01)差異, 其所在的Blocks共覆蓋71個(gè)候選基因, 其中64個(gè)Blast到同源擬南芥基因, 主要編碼轉(zhuǎn)錄因子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、生長(zhǎng)抑制子、蛋白磷酸酶、DNA/RNA結(jié)合蛋白、激素響應(yīng)蛋白以及氧化脅迫、滲透脅迫、鹽脅迫或水分剝奪響應(yīng)蛋白等。

[1] 王三根. 植物抗性生理與分子生物學(xué). 北京: 現(xiàn)代教育出版社, 2009. pp 211–226. Wang S G. Plant Hardiness Physiology and Molecular Biology. Beijing: Modern Education Press, 2009. pp 211–226 (in Chinese).

[2] Levitt J. Responses of Plants to Environmental Stresses, Volume II: Water, radiation, salt, and other stresses. New York: Academic Press, 1980. pp 213–228.

[3] 劉友良. 植物水分逆境生理. 北京: 農(nóng)業(yè)出版社, 1992. pp 144–177. Liu Y L. Plant Water Stress Physiology. Beijing: Agriculture Press, 1992. pp 144–177 (in Chinese).

[4] 李真. 甘藍(lán)型油菜苗期耐濕性和抗旱性相關(guān)QTL分析. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 湖北武漢, 2008. Li Z. Study on QTL Associated with Waterlogging Tolerance and Drought Resistance during Seedling Stage inL. MS Thesis of Huazhong Agricultural University, Wuhan, Hubei, China, 2008 (in Chinese with English abstract).

[5] 蔡士賓, 曹旸, 方先文. 小麥耐濕性變異及其配合力分析. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1996, 12(3): 1–5. Cai S B, Cao Y, Fang X W. Studies on the variability and combining ability of waterlogging tolerance in common wheat., 1996, 12(3): 1–5 (in Chinese with English abstract).

[6] 魏鳳珍, 李金才, 董琦. 孕穗期至抽穗期濕害對(duì)耐濕性不同品種冬小麥光合特性的影響. 植物生理學(xué)通訊, 2000, 36(2): 119–122. Wei F Z, Li J C, Dong Q. Effects of waterlogging at booting and heading stages on photosynthetic characteristics in different varieties of wet-resistant winter wheat., 2000, 36(2): 119–122 (in Chinese with English abstract).

[7] 李金才, 董琦, 余松烈. 不同生育期根際土壤淹水對(duì)小麥品種光合作用和產(chǎn)量的影響. 作物學(xué)報(bào), 2001, 27: 434–441. Li J C, Dong Q, Yu S L. Effect of waterlogging at different growth stages on photosynthesis and yield of different wheat cultivars., 2001, 27: 434–441 (in Chinese with English abstract).

[8] 呂軍. 漬水對(duì)冬小麥生長(zhǎng)的危害及其生理效應(yīng). 植物生理學(xué)報(bào), 1994, 20: 221–226. Lyu J. The injury to winter wheat growth by soil waterlogging and its mechanism., 1994, 20: 221–226 (in Chinese with English abstract).

[9] 張舟, 朱謹(jǐn)文. 成都地區(qū)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策分析. 四川農(nóng)業(yè)科技, 2013, (6): 12–13. Zhang Z, Zhu J W. Present situation and countermeasure analysis of rapeseed industry development in Chengdu area., 2013, (6): 12–13 (in Chinese).

[10] 郭燕枝, 楊雅倫, 孫君茂. 我國(guó)油菜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的現(xiàn)狀及對(duì)策. 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì), 2016, (7): 44–46. Guo Y Z, Yang Y L, Sun J M. Present situation and countermeasures of rapeseed industry development in China., 2016, (7): 44–46 (in Chinese).

[11] 李真, 蒲圓圓, 高長(zhǎng)斌, 周廣生, 涂金星, 傅廷棟. 甘藍(lán)型油菜DH群體苗期耐濕性的評(píng)價(jià). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2010, 43: 286–292. Li Z, Pu Y Y, Gao C B, Zhou G S, Tu J X, Fu T D. Evaluation of waterlogging tolerance in rapeseed (L.) DH lines at seedling stage., 2010, 43: 286–292 (in Chinese with English abstract).

[12] Crawford R M M. Oxygen availability as an ecological limit to plant distribution., 1992, 23: 93–185.

[13] Justin S H F W, Armstrong W. The anatomical characteristics of toots and plant response to soil flooding., 1987, 106: 465–495.

[14] Sachs M M, Subbaiah C C, Saab I N. Anaerobic gene expression and flooding tolerance in maize., 1996, 47: 1–15.

[15] 張學(xué)昆, 范其新, 陳潔, 李加納, 王漢中. 不同耐濕基因型甘藍(lán)型油菜苗期對(duì)缺氧脅迫的生理差異響應(yīng). 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 40: 485–491. Zhang X K, Fan Q X, Chen J, Li J N, Wang H Z. Physiological reaction differences of different waterlogging-tolerant genotype rapeseed (L.) to anoxia., 2007, 40: 485–491 (in Chinese with English abstract).

[16] 盧長(zhǎng)明, 龔學(xué)明. 缺氧條件下油菜種子發(fā)芽特性的遺傳參數(shù)研究. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1989, 11(4): 23–26. Lu C M, Gong X M. Study on the genetic parameters of germination characteristics of rapeseeds (L.)., 1989, 11(4): 23–26 (in Chinese with English abstract).

[17] 范其新, 張學(xué)昆, 諶利, 李加納. 缺氧對(duì)甘藍(lán)型黃籽與黑籽油菜發(fā)芽的影響. 中國(guó)油料作物學(xué)報(bào), 2005, 27(3): 84–87. Fan Q X, Zhang X K, Chen L, Li J N. Effects of anoxic condition on germination of the yellow and black-seeded lines inL., 2005, 27(3): 84–87 (in Chinese with English abstract).

[18] 陳娟妮, 梁穎. 長(zhǎng)江流域主要甘藍(lán)型油菜品種苗期耐濕性鑒定. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 19: 626–630. Chen J N, Liang Y. Determining rapeseed tolerance to waterlogging at seedling stage in the Yangtze River basin., 2011, 19: 626–630 (in Chinese with English abstract).

[19] 叢野, 程勇, 鄒崇順, 張學(xué)昆, 王漢中. 甘藍(lán)型油菜發(fā)芽種子耐濕性的主基因＋多基因遺傳分析. 作物學(xué)報(bào), 2009, 35: 1462–1467. Cong Y, Cheng Y, Zou C S, Zhang X K. Wang H Z. Genetic analysis of waterlogging tolerance for germinated seeds of rapeseed (L.) with mixed model of major gene plus polygene., 2009, 35: 1462–1467 (in Chinese with English abstract).

[20] 鄒琦. 植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo). 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2003. pp 129–130. Zou Q. Plant Physiology Experiment Instruction. Beijing: China Agriculture Press, 2003. pp 129–130 (in Chinese).

[21] 李合生. 植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù). 北京: 高等教育出版社, 2000. pp 260–261. Li H S. Experimental Principles and Techniques of Plant Physiology and Biochemistry. Beijing: Higher Education Press, 2000. pp 260–261 (in Chinese).

[22] Qu C M, Jia L D, Fu F Y, Zhao H Y, Lu K, Wei L J, Xu X F, Liang Y, Li S M, Wang R. Genome-wide association mapping and identification of candidate genes for fatty acid composition inL. using SNP markers., 2017, 18: 232. doi: 10.1186/s12864-017-3607-8.

[23] Bradbury P J, Zhang Z, Kroon D E, Casstevens T M, Ramdoss Y, Buckler E S. TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples., 2007, 23: 2633–2635.

[24] Evanno G, Regnaut S, Goudet J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study., 2005, 14: 2611–2620.

[25] Yu J, Pressoir G, Briggs W H, Vroh B I, Yamasaki M, Doebley J F, McMullen M D, Gaut B S, Nielsen D M, Holland J B, Kresovich S, Buckler E S. A unified mixed-model method for association mapping that accounts for multiple levels of relatedness., 2006, 38: 203–208.

[26] Barrett J C, Fry B, Maller J, Daly M J. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps., 2005, 21: 263–265.

[27] 李浩杰, 張雪花, 蒲曉斌, 張錦芳, 蔣俊, 柴靚, 蔣梁材. 甘藍(lán)型油菜對(duì)田間模擬濕害脅迫的生理響應(yīng). 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2013, 26(1): 84–88.Li H J, Zhang X H, Pu X B, Zhang J F, Jiang J, Chai L, Jiang L C. Physiological reaction of field waterlogging treatment inL., 2013, 26(1): 84–88 (in Chinese with English abstract).

[28] 涂玉琴, 湯潔, 涂偉鳳, 戴興臨, 張弢. 甘藍(lán)型油菜與蔊菜屬間雜種后代的苗期耐濕性綜合評(píng)價(jià). 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015, 16: 895–902. Tu Y Q, Tang J, Tu W F, Dai X L, Zhang T. Comprehensive evaluation of waterlogging tolerance of progenies betweenL. and(L.) Hiern., 2015, 16: 895–902 (in Chinese with English abstract).

[29] 陳龍, 王賢. 植物水分脅迫誘導(dǎo)蛋白的特性和功能. 生物學(xué)教學(xué), 2003, 28(11): 2–3. Chen L, Wang X. Characteristics and functions of proteins induced under water stress in plant., 2003, 28(11): 2–3 (in Chinese).

[30] 范其新. 甘藍(lán)型油菜耐濕品種資源篩選及耐濕機(jī)理研究. 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文, 重慶, 2005. Fan Q X. Identification ofL. of High Tolerance to Waterlogging and Research on Physiological Adaptability Mechanism to Anaerobiosis. MS Thesis of Southwest Agricultural University. Chongqing, China, 2005 (in Chinese with English abstract).

[31] 薛遠(yuǎn)超. 甘藍(lán)型油菜EMS誘變材料的耐濕性鑒定與篩選. 西南大學(xué)碩士學(xué)位論文, 重慶, 2011. Xue Y C. Indentification and Screening of Waterlogging Tole-rance inMutated by EMS. MS Thesis of Southwest University, Chongqing, China, 2011 (in Chinese with English abstract).

[32] Wang Y, Li K, Chen L, Zou Y, Liu H, Tian Y, Li D, Wang R, Zhao F, Ferguson B J, Gresshoff P M, Li X. Micro RNA167-Directed regulation of the auxin response factorsandis required for soybean nodulation and lateral root development., 2015, 168: 984–999.

[33] Alvarez-Gerding X, Espinoza C, Inostroza-Blancheteau C, Arce-Johnson P. Molecular and physiological changes in response to salt stress inW. plants overexpressingCBF3/DREB1A., 2015, 92: 71–80.

[34] Jens S, Maria K, Svante B, Christina D. Transgressive segregation reveals twoTIR-NB-LRR resistance genes effective against, causal agent of blackleg disease., 2006, 46: 218–230.

[35] Kohji Y, Yuriko O, Junya M, Kazuo N, Yasunari F, Kazuo S, Kazuko Y S. Functional analysis of anabiotic stress-inducible facilitated diffusion transporter for monosaccharides., 2010, 285: 1138–1146.

[36] Bi C, Ma Y, Wang X F, Zhang D P. Overexpression of the transcription factor NF-YC9 confers abscisic acid hypersensitivity in., 2017, 95: 425–439.

[37] Kovtun Y, Chiu W L, Tena G, Sheen J. Functional analysis of oxidative stress-activated mitogen-activated protein kinase cascade in plants., 2000, 97: 2940–2945.

[38] Kim J H, Nguyen N H, Nguyen N T, Hong S W, Lee H. Loss of all three calreticulins, CRT1, CRT2 and CRT3, causes enhanced sensitivity to water stress in., 2013, 32: 1843–1853.

[39] Hironori K, Keiko F, Yuki T, Atsushi O, Shunji S. ER stress-induced protein, VIGG, disturbs plant cation homeostasis, which is correlated with growth retardation and robustness to ER stress., 2011, 405: 514–520.

[40] Zou X L, Tan X Y, Hu C W, Zeng L, Lu G Y, Fu G P, Cheng Y, Zhang X K. The transcriptome ofL. roots under waterlogging at the seedling stage., 2013, 14: 2637–2651.

Genome-wide association analysis and candidate genes prediction of waterlogging-responding traits inL.

LI Yang-Yang1,2,3,**, JING Rong-Rong1,3,**, LYU Rong-Rong1,2,3, SHI Peng-Cheng1,2,3, LI Xin1,2,3, WANG Qin1,2,3, WU Dan1,2,3, ZHOU Qing-Yuan1,3, LI Jia-Na1,2,3, and TANG Zhang-Lin1,2,3,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University,Chongqing 400715, China;3Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed, Chongqing 400715, China

The yield and quality of rapeseed are significantly affected by waterlogging. Many researches on waterlogging of rapeseed mostly aimed at its mechanism and physiological response, but a few of them identified the genes related to waterlogging. In this study, 248L. accessions were planted in flowerpots with treatments of waterlogging and well watering for four weeks when the plants had four true leaves in rain-proof installation, and eight waterlogging-responding traits were investigated. The genome-wide association analysis was carried out based on 60K Illumina Infinium SNP genotype data and the candidate genes associated with waterlogging responses were predicted. Under waterlogging, the number of green leaf, the shoot fresh weight and dry weight, the leaf soluble protein content were lower, and the leaf POD activity, the MDA content were higher than those under well watering. The root fresh weight and dry weight were lower in most accessions and higher in some accessions under waterlogging stress. A total of 36 SNPs were identified associated with waterlogging traits and explained the phenotypic variation of 8.28%–12.95%. There were significant (< 0.05) or extremely significant (< 0.01) differences in the waterlogging resistance index among genotypes of 17 SNPs. The Blocks containing 17 SNPs covered 71 candidate genes. Among them, 64 candidate genes were homologous togenes by blast. They encoded transcription factors (e.g. transcription initiation factor IIF, bZIP68, myb-like HTH transcriptional regulator family protein), transport protein (e.g. SUC2), inhibitor of growth (e.g. ING2), protein phosphatase (e.g. protein phosphatase 2C family protein), DNA/RNA binding proteins [e.g. bHLH DNA-binding superfamily protein, RNA-binding (RRM/RBD/RNP motifs) family protein], hormone response proteins (e.g. ARF8, ADC2, ERD6, NF-YC9), oxidative/osmotic/cold stress or water deprivation response proteins (e.g. ERD6, NP1, TIR-NBS-LRR, CRT1b). These results would be benefit for revealing the waterlogging resistance mechanism and cultivating new varieties with waterlogging resistance inL.

L.; waterlogging-responding traits; genome-wide association analysis; candidate genes

本研究由重慶市社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新主題專項(xiàng)(cstc2016shms-ztzx80010), 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0100504)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(XDJK2019D021)資助。

This study was supported by the Science and Technology Innovation Project of Chongqing Social Undertakings & Livelihood Security (cstc2016shms-ztzx80010), the National Key R&D Program of China (2018YFD0100504) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2019D021).

唐章林, E-mail: tangzhlin@swu.edu.cn, Tel: 023-68251264

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

李陽(yáng)陽(yáng), E-mail: liyangyangswu@163.com; 荊蓉蓉, E-mail: m15525440862@163.com

2019-02-25;

2019-06-24;

2019-07-16.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190715.1553.004.html

10.3724/SP.J.1006.2019.94027