短瓣金蓮花化學(xué)成分與抑菌活性相關(guān)性研究

趙波,李洪濤,李鞠,蘇連杰*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;2.廊坊市中醫(yī)醫(yī)院，河北 廊坊 065000)

毛茛科金蓮花屬(TrolliusL.)植物金蓮花(TrolliuschinensisBunge)為多年生宿根草本植物，其花味苦、性寒、氣芳香，具有清熱解毒、止腐愈傷等功效，主治刃傷、瘡殤多膿及咽喉腫痛等[1-2]。現(xiàn)代藥學(xué)研究和臨床應(yīng)用表明，金蓮花主要用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎和支氣管炎[3]，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和抗氧化等活性，并在2003年被選為預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)疾病中的復(fù)合處方藥物之一。由于金蓮花所具有的良好生物活性及廣泛應(yīng)用，使其野生資源匱乏并遭到破壞，因此急需尋找其替代源藥材，以拓展金蓮花藥材來(lái)源[4]。

短瓣金蓮花(TrolliusledebouriReichb.)為金蓮花同屬植物，主要分布于黑龍江省及內(nèi)蒙古東北部，在西伯利亞?wèn)|部及遠(yuǎn)東地區(qū)也有分布，資源比較豐富。目前，已有學(xué)者對(duì)短瓣金蓮花進(jìn)行了初步化學(xué)研究，分離得到黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)和甾醇類(lèi)等化合物，并進(jìn)行了初步活性研究，發(fā)現(xiàn)其同樣具有抗病毒、抗炎及抗氧化等生物活性[5]。筆者前期的研究工作表明，短瓣金蓮花與金蓮花的化學(xué)成分相當(dāng)。為進(jìn)一步確定短瓣金蓮花能否替代金蓮花成為一種安全、有效的臨床新藥源，本研究對(duì)短瓣金蓮花進(jìn)行了體內(nèi)外抑菌活性研究，并初步探討了其抑菌活性與化學(xué)成分的相關(guān)性。

1 儀器與材料

B-L系列分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；HH-S恒溫水浴鍋(江蘇金壇縣醫(yī)療儀器廠)；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；classⅡTYPE B2無(wú)菌操作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)；超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌和志賀氏痢疾桿菌(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)中心提供)；蛋白胨、瓊脂粉和氯化鈉(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；胰酶提取物；頭孢氨芐(批準(zhǔn)文號(hào)：H11020463);金蓮花片(批準(zhǔn)文號(hào)：Z13020456)。

昆明種小鼠，體質(zhì)量(20±2.0)g，雌雄各半，清潔級(jí)，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SYXK黑2015001。

短瓣金蓮花和金蓮花藥材采自大興安嶺加格達(dá)奇，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)蘇連杰教授鑒定為T(mén)rolliusledebouriReichb.和TrolliuschinensisBunge。

葒草苷和牡荊苷單體自制，經(jīng)HPLC測(cè)定純度為99.98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外抑菌試驗(yàn)

2.1.1 供試品的制備

精密稱(chēng)取干燥至恒重的短瓣金蓮花和金蓮花，70%乙醇回流提取，合并提取液減壓回收至無(wú)醇味，得總提取物。上大孔樹(shù)脂，用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和95%梯度乙醇洗脫，減壓回收洗脫液，用無(wú)菌水稀釋至相當(dāng)于生藥量1 g/ml溶液，并按2、4、8、16倍稀釋成4個(gè)濃度。

2.1.2 藥敏紙片的制備

用打孔器將普通定性濾紙片用打孔器打成若干直徑為6 mm的圓形紙片，置于干燥潔凈的小錐形瓶中，封口，放入高壓蒸氣滅菌鍋中，經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min，放冷，干燥。分別取干燥后的不同供試樣品0.2 g，用水溶解至濃度為20 μg/mL，并按倍比稀釋法稀釋成5個(gè)不同的濃度，將濾紙片放入溶劑中，反復(fù)吸取，晾干，直至將溶劑吸干，用紫外燈照射滅菌10～15 min，備用。

2.1.3 培養(yǎng)基的制備

制備瓊脂培養(yǎng)基。精密稱(chēng)取胰酶提物5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g,向燒杯中依次加入蛋白胨、胰酶提物、氯化鈉，加入1 000 mL蒸餾水，將燒杯放在加有石棉網(wǎng)的電爐上加熱，邊攪拌邊加入1.2%的瓊脂粉，加熱至微沸透明。并補(bǔ)足由于蒸發(fā)而失掉的水分，用4%的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，過(guò)濾，均勻分裝于500 mL錐形瓶中，然后放入121 ℃高壓滅菌30 min，取出趁熱倒入經(jīng)過(guò)高壓滅菌的培養(yǎng)皿中，厚度約3～5 mm，冷卻凝固，備用。

2.1.4 菌懸液的制備

分別將菌株先接種于平板，在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，挑選出各個(gè)菌株的典型菌落接種于25 mL瓊脂培養(yǎng)基中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，取1 mL制備菌液用無(wú)菌生理鹽水(0.9%)以10倍稀釋法依次進(jìn)行稀釋?zhuān)c麥?zhǔn)媳壬軐?duì)比，調(diào)整其濁度至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)(即1.5×108cfu/mL)，備用。

2.1.5 抑菌活性的測(cè)定

采用濾紙片擴(kuò)散法，用無(wú)菌移液管吸取稀釋好的菌懸液0.1 mL，置于培養(yǎng)皿中央，倒入適量的瓊脂培養(yǎng)液使菌懸液涂布均勻。用無(wú)菌鑷子夾取含藥濾紙片貼在培養(yǎng)基的表面，同時(shí)以含藥量為0.02 mg/mL的頭孢氨芐細(xì)菌藥敏試紙為陽(yáng)性對(duì)照，以無(wú)菌雙蒸水浸泡過(guò)的濾紙片為陰性對(duì)照。將培養(yǎng)基放入37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出觀察抑菌圈，并用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈的大小，結(jié)果以毫米(mm)表示，并以此判斷不同濃度供試品對(duì)供試菌的抑菌效果，每種不同濃度的供試品分別做3組平行對(duì)照，結(jié)果取平均值。具體見(jiàn)表1和表2。

注：與空白組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

注：與空白組比較，P<0.05，P<0.01，P<0.001。

表1及表2結(jié)果表明，與空白組比較，短瓣金蓮花與金蓮花總提物及不同洗脫部位對(duì)金黃色葡萄球菌等5種細(xì)菌均有不同程度的抑制作用，且以總提取物的抑菌效果最好；黃酮類(lèi)單體化合物葒草苷和牡荊苷除對(duì)金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌無(wú)抑菌作用，對(duì)其他三種細(xì)菌均有較好的抑菌效果。說(shuō)明短瓣金蓮花與金蓮花抑菌效果相當(dāng)。

2.2 體內(nèi)抑菌試驗(yàn)

2.2.1 感染菌液的制備

按“2.1.4”項(xiàng)操作，培養(yǎng)金黃色葡萄球菌，并將菌液按照麥?zhǔn)嫌?jì)數(shù)法制成1011、1010、109、108、107、106、105、104cfu/mL濃度的菌液。

2.2.2 MLD(最小致死量)的確定

取體質(zhì)量18～22 g的小鼠30只，分為6組，每組5只。分別腹腔注射不同濃度的細(xì)菌溶液(金黃色葡萄球菌)，注射量為0.5 mL/只，觀察小鼠在4天內(nèi)的死亡情況，得到最小致死量(MLD)，即感染后引起小鼠100%死亡率的菌液濃度。結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果表明金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠的最小致死量為1011cfu/mL。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)，選定引起小鼠死亡率達(dá)80%～100%死亡的菌液濃度進(jìn)行感染，即金黃色葡萄球菌為1010cfu/mL。

表3金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠MLD的測(cè)定

組別菌液濃度(cfu/mL)劑量(ml/只)動(dòng)物數(shù)(只)死亡數(shù)(只)死亡率(%)11×1070.5500 21×1080.55240.031×1090.55360.041×10100.55480.051×10110.555100.061×10120.555100.0

2.2.3 對(duì)小鼠感染致死性金黃色葡萄球菌的保護(hù)作用

取雌雄各半昆明種小白鼠90只，分為正常組、模型對(duì)照組(蒸餾水20 mL/kg)、金蓮花片組(2.4 g/kg)和70%乙醇提取短瓣金蓮花及金蓮花總提取物低劑量(0.12 g/kg)、中劑量(0.24 g/kg)、高劑量(0.48 g/kg)組。每日給小鼠灌胃1次，連續(xù)3天。第3天給藥后1 h腹腔注射最小致死量的細(xì)菌懸液0.5 mL/只作致死性攻擊，感染小鼠后，每小時(shí)觀察小鼠死亡情況，計(jì)算48 h小鼠死亡數(shù)，計(jì)算死亡率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4結(jié)果表明，模型對(duì)照組小鼠死亡率高達(dá)90.0%，與模型對(duì)照組比較，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠死亡率40.0%，體內(nèi)抗菌療效顯著。短瓣金蓮花與金蓮花總提取物3個(gè)劑量組小鼠死亡率明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)，并有一定劑量依賴關(guān)系。

表4短瓣金蓮花提取物對(duì)感染小鼠死亡率的影響

組別劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只)死亡數(shù)(只)死亡率(%)正常組—1000 模型對(duì)照組—10990.0金蓮花片組2.410440.0金蓮花總提組(低)0.1210760.0金蓮花總提組(中)0.2410650.0金蓮花總提組(高)0.4810440.0短瓣金蓮花總提組(低)0.1210880.0短瓣金蓮花總提組(中)0.2410770.0短瓣金蓮花總提組(高)0.4810550.0

3 小結(jié)

體外抗菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，短瓣金蓮花及金蓮花對(duì)五種實(shí)驗(yàn)細(xì)菌均有不同程度的抗菌作用，尤以短瓣金蓮花與金蓮花總提取物的抗菌效果最好，葒草苷和牡荊苷對(duì)大腸桿菌及綠膿桿菌抑菌作用比較明顯，對(duì)其他實(shí)驗(yàn)菌作用不明顯。推測(cè)金蓮花屬植物抗菌活性可能與其總黃酮類(lèi)成分中各單體協(xié)同抑菌作用有關(guān)。

體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)研究表明，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和金蓮花及短瓣金蓮花總黃酮3個(gè)劑量組對(duì)感染致死量的金黃色葡萄球菌小鼠均有一定的體內(nèi)保護(hù)作用(P<0.05)，并有一定劑量依賴關(guān)系。結(jié)果顯示，金蓮花與短瓣金蓮花的抗菌活性相當(dāng)。