評(píng)價(jià)芽孢桿菌脂肽產(chǎn)量及底物碳利用效率的新方法

王 晶，劉 茗，馮歌林，方 偉，高 競，梁辰飛，秦 華，陳俊輝，徐秋芳

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院，浙江杭州311300）

芽孢桿菌Bacillus是一類產(chǎn)生耐熱、耐旱，并且抗紫外線和有機(jī)溶劑的好氧細(xì)菌［1］，具有在不同環(huán)境下定殖與繁殖的能力［2］，同時(shí)具備抵抗真菌和病原細(xì)菌等方面的優(yōu)點(diǎn)［2-3］。芽孢桿菌是一種理想的生防菌，所產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要有抗生素、細(xì)菌素、細(xì)胞壁降解酶、其他抗菌蛋白及揮發(fā)性等物質(zhì)［4］，其中脂肽類抗生素是一大類重要的拮抗物質(zhì)［5］。脂肽類抗生素理化性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)高溫、強(qiáng)酸和弱堿具有一定的耐受能力［6］，對(duì)胰蛋白酶、蛋白酶K等多種蛋白酶不敏感［7］，表明它是一類穩(wěn)定態(tài)物質(zhì)。同時(shí)脂肽類抗生素可以殺滅病原細(xì)菌、真菌和病毒，是一類抑制腫瘤生長的生物活性物質(zhì)［8］，成為芽孢桿菌拮抗物質(zhì)領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。因此，獲得高產(chǎn)量的脂肽類抗生素是目前開發(fā)芽孢桿菌的主要目的，芽孢桿菌的代謝活動(dòng)受到多種因素影響，如培養(yǎng)基、初始pH值、溫度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、通氣量以及發(fā)酵工藝等［9］。探索高產(chǎn)量脂肽物質(zhì)的最佳發(fā)酵條件需要進(jìn)行大量的實(shí)驗(yàn)，通過對(duì)不同溫度、pH值、接種量、通氣等條件的試驗(yàn)得到優(yōu)化組合。目前，主要應(yīng)用重量法和液相色譜法來衡量脂肽類產(chǎn)量高低。而脂肽類物質(zhì)定量分析前需要把該物質(zhì)從發(fā)酵液中分離出來，有酸沉降法、超濾法、色譜法、液膜分離法、泡沫分離法、吸附法以及雙水相法等分離方法［10］，其中酸沉降法（濃鹽酸沉淀法）使用最廣。芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量較低，大部分低于1000 mg·L-1，有的甚至不足100 mg·L-1［11］。重量法靈敏度較低，需要從較大量的發(fā)酵液中分離脂肽類物質(zhì)，菌體分離（培養(yǎng)結(jié)束）和脂肽物質(zhì)分離（酸沉降后）都需要進(jìn)行離心，多因素探索優(yōu)化條件時(shí)離心的工作量非常大。液相色譜法雖然靈敏度和準(zhǔn)確度均較高，但需要昂貴的液相色譜儀器，色譜測定條件的摸索也費(fèi)時(shí)費(fèi)工，并且需要有標(biāo)準(zhǔn)樣品才能進(jìn)行絕對(duì)定量，而目前市場上除了表面活性素（surfactin）外沒有商品化的標(biāo)準(zhǔn)樣品。在優(yōu)化條件時(shí)，不需要很高絕對(duì)產(chǎn)量的準(zhǔn)確度，主要是比較不同培養(yǎng)條件脂肽物質(zhì)產(chǎn)量相對(duì)高低。因此，簡單、快捷的產(chǎn)量評(píng)測方法可提高工作效率。本研究試圖通過測定不同初始pH值的培養(yǎng)基、發(fā)酵液酸沉降前后有機(jī)碳總量，計(jì)算沉降前后有機(jī)碳的差值，來推算發(fā)酵液中脂肽類粗提物含量，探索一種簡單、快捷評(píng)價(jià)脂肽類物質(zhì)產(chǎn)量的方法。同時(shí)通過測定培養(yǎng)基、含菌體發(fā)酵液以及去菌體發(fā)酵液的有機(jī)碳含量，來評(píng)價(jià)碳的利用效率。雖然獲得脂肽類物質(zhì)是酵液的最終目的，但如果能探索到一種底物碳利用效率和脂肽物質(zhì)產(chǎn)量雙高的培養(yǎng)條件，可節(jié)約原料成本以提高經(jīng)濟(jì)效益，也可減少代謝過程中二氧化碳?xì)怏w排放以保護(hù)大氣環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

解淀粉芽孢桿菌Bacillus amyloliquefaciensWK1，菌種保藏號(hào)：CGMCC 11640，由浙江省森林生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)與固碳減排重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在-70℃的條件下甘油冷凍保存。

1.2 培養(yǎng)基配方

參考莊國宏［10］得到的解淀粉芽孢桿菌GD產(chǎn)脂肽類物質(zhì)的優(yōu)化培養(yǎng)基Landy：葡萄糖10.0 g，L-谷氨酸 5.0 g， MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g， KH2PO41.0 g， FeSO4·7H2O 0.15 mg， MnSO45.00 mg， CuSO4·5H2O 0.16 mg，蒸餾水1000 mL；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯100 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，自然pH值。

1.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化及抑制效果觀察

已確定菌株WK1最佳接種量為3%，最佳培養(yǎng)溫度為37℃［11-12］。為了確定脂肽類物質(zhì)最高產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間，將病原菌接種到含有發(fā)酵液的平板中，觀察記錄病原菌生長情況。具體方法如下：①菌株WK1種子液制備：選取菌株WK1的單菌落，接種于pH 7的100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，在37℃、搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r·min-1條件下培養(yǎng)14 h。②不同培養(yǎng)時(shí)間發(fā)酵液的制備：將WK1種子液按接種量3%（V/V）分別接種到裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的6個(gè)三角瓶中，37℃，180 r·min-1搖瓶培養(yǎng)，分別在48，60，72 h終止培養(yǎng)，獲得不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵液，將發(fā)酵液離心15 min（6000 r·min-1）去除菌體后得上清液。③含發(fā)酵液的培養(yǎng)基制備：分別吸取100 mL不同時(shí)間的發(fā)酵上清液與PDA液體培養(yǎng)基按1∶1體積比混合，加入5.0 g瓊脂，115℃滅菌30 min后制成6個(gè)厚薄均勻的培養(yǎng)基。④抑制效果觀察：將病原菌葡萄座腔菌Botryosphaeria dothidea單菌落打餅分別接種到混合培養(yǎng)基中（打餅直徑為0.5 cm），放入27℃的真菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分別在第1，2，3，4，5，10天時(shí)拍照，同時(shí)測量病原菌落直徑，計(jì)算抑制率。抑制率=（對(duì)照病原菌菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對(duì)照病原菌菌落直徑×100%。

1.4 發(fā)酵液pH值動(dòng)態(tài)測定

每個(gè)處理設(shè)置1個(gè)培養(yǎng)基體積為200 mL的搖瓶，用于發(fā)酵液pH值的動(dòng)態(tài)監(jiān)測，培養(yǎng)條件同1.3。分別于培養(yǎng)8，16，24，32，40，48，56，64，72 h時(shí)取出10 mL發(fā)酵液，用酸度計(jì)測定pH值，采樣過程在超凈工作臺(tái)中，避免母體培養(yǎng)基污染。

1.5 脂肽物質(zhì)產(chǎn)量測定

在已有研究基礎(chǔ)上，設(shè)置初始pH值分別為5，6，7的Landy培養(yǎng)基，以獲得不同產(chǎn)量的脂肽物質(zhì)，比較不同方法，同時(shí)檢測pH值對(duì)脂肽物質(zhì)產(chǎn)量的影響。每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)基體積為300 mL，接種3%（V菌液/V培養(yǎng)液），37℃，180 r·min-1，搖瓶72 h（從前期抑制試驗(yàn)得到的最佳培養(yǎng)時(shí)間）。搖瓶結(jié)束后，立即通過紫外滅菌以阻止芽孢桿菌繼續(xù)生長繁殖，測量發(fā)酵液體積，將菌液全部離心，放到4℃冰箱備用。

1.5.1 重量法 吸取240 mL去除菌體的發(fā)酵液于三角瓶中，緩慢滴加濃度為6 mol·L-1的鹽酸，逐漸將溶液pH值調(diào)至2以沉淀脂肽類物質(zhì)，置于4℃冰箱過夜。準(zhǔn)備100 mL離心管（質(zhì)量為W0），分3次將液體轉(zhuǎn)入100 mL的離心管，在4500g下離心30 min，每次離心后的上清液收集一起，用于有機(jī)碳測定；同一樣品的液體轉(zhuǎn)入同一離心管收集脂肽粗提物沉淀，用pH值為2的鹽酸洗滌沉淀2次，以除去水溶性雜質(zhì)，而后將沉淀置于-70℃冰箱充分冷凍，用冷凍干燥機(jī)去除水分后得脂肽類粗提物，取出放到真空干燥器內(nèi)，等升至室溫后稱質(zhì)量（W1），W1與W0的差值即為脂肽類粗提物的質(zhì)量，計(jì)算得發(fā)酵液脂肽物質(zhì)質(zhì)量濃度。

1.5.2 差減法 脂肽類物質(zhì)是芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的同系物，雖然不是純的有機(jī)化合物，但其含碳量變化不大。程敏等［11］應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定WK1的代謝產(chǎn)物主要為C14～C17的芬薺素（fengycin），參考主要脂肽物質(zhì)芬薺素的分子結(jié)構(gòu)［13］推算出WK1的謝產(chǎn)物脂肽含碳率平均為0.54。因此，通過測定發(fā)酵液酸沉降（方法與重量法相同）前后的總有機(jī)碳質(zhì)量濃度，計(jì)算差值可得到脂肽類粗提物質(zhì)量。酸沉降前總有機(jī)碳測定，吸取2 mL去除菌體的發(fā)酵液，用去離子水稀釋13倍，應(yīng)用總有機(jī)碳分析儀（TOC-L CPN，津島）測定溶液中的有機(jī)碳質(zhì)量濃度。酸沉降后溶液中總有機(jī)碳測定，吸取2 mL酸沉降析出脂肽物質(zhì)后上清液，用去離子水稀釋13倍，同樣用TOC分析儀測定溶液中的有機(jī)碳質(zhì)量濃度。由于調(diào)節(jié)酸度所用的鹽酸體積很小，可以忽略不計(jì)，因此，脂肽物質(zhì)產(chǎn)量（mg·L-1）=（酸沉前有機(jī)碳質(zhì)量濃度-酸沉降后有機(jī)碳質(zhì)量濃度）/0.54。

1.5.3 底物碳利用效率 通過脂肽物質(zhì)的合成效率和二氧化碳排放損失率來間接綜合評(píng)價(jià)培養(yǎng)基中底物碳利用效率。單位底物碳合成的脂肽類物質(zhì)越多越好，而在培養(yǎng)過程中微生物通過好氧呼吸排放二氧化碳則越少越好。脂肽物質(zhì)合成效率（mg·kg-1）=脂肽物質(zhì)碳質(zhì)量濃度/Landy培養(yǎng)基初始碳質(zhì)量濃度，統(tǒng)一用TOC分析儀測定。二氧化碳排放量（mg·kg-1）=（Landy培養(yǎng)基初始碳質(zhì)量濃度-含菌體發(fā)酵液的碳質(zhì)量濃度）/Landy培養(yǎng)基初始碳質(zhì)量濃度，統(tǒng)一用重鉻酸鉀法測定。

1.6 培養(yǎng)基和含菌體發(fā)酵液有機(jī)碳質(zhì)量濃度測定

菌體發(fā)酵液是混濁的不透明液體，無法用TOC分析儀直接測定，因而采用重鉻酸鉀法測定含菌體發(fā)酵液有機(jī)碳質(zhì)量濃度。72 h培養(yǎng)結(jié)束后，分別吸取2 mL不同處理的含菌體發(fā)酵液于硬質(zhì)試管進(jìn)行消煮。為了計(jì)算發(fā)酵前后培養(yǎng)基中有機(jī)碳的損失量，同時(shí)用重鉻酸鉀法測定Landy培養(yǎng)基初始碳質(zhì)量濃度，為 5769.55 mg·L-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 最高產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間確定

通過WK1對(duì)病源菌的抑制效果試驗(yàn)，間接確定WK1產(chǎn)脂肽類物質(zhì)最高產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間為72 h。對(duì)解淀粉芽孢桿菌WK1與病原菌的平板對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，代謝產(chǎn)物通過破壞菌絲和孢子細(xì)胞壁、細(xì)胞膜，使細(xì)胞原生質(zhì)泄露，菌絲和孢子萎縮的方式抑制山核桃干腐病原菌Bacillus dothidea的生長［11］。因此，將除菌后發(fā)酵液直接混入培養(yǎng)基可間接衡量代謝物的產(chǎn)量，通過發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑制效果試驗(yàn)可確定最高產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間。觀察含有發(fā)酵液（48，60，72 h）培養(yǎng)基上病原菌的生長情況（圖1和表1）發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵液對(duì)病原菌生長均有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加抑制率逐漸增加，1～5 d內(nèi)抑制率增速快，抑制效果顯著，5～10 d內(nèi)增速變緩，甚至48與60 h共2個(gè)處理在第10天出現(xiàn)下降。這是因?yàn)殚_始接種的是單菌落病原菌，1 d時(shí)間內(nèi)繁殖的數(shù)量有限，但隨著時(shí)間的延長病原菌數(shù)量不斷增加，而代謝產(chǎn)物的脂肽濃度有限，所以病原菌數(shù)量增加后抑制效果減弱。綜合1～10 d的結(jié)果，WK1的發(fā)酵時(shí)間越長抑制效果越好，在72 h抑制率達(dá)到最高值，效果最為顯著，培養(yǎng)5和10 d時(shí)的抑制率達(dá)到83.3%和84.9%，對(duì)于抗生素篩選的效果而言，已經(jīng)達(dá)到較強(qiáng)的水平。在解淀粉芽孢桿菌HAB-7的抑菌試驗(yàn)中，經(jīng)優(yōu)化后最佳培養(yǎng)條件對(duì)芒果炭疽菌的抑制率達(dá)到78.3%［14］。大量研究表明［15-17］：解淀粉芽孢桿菌的最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間都在72 h以內(nèi)，且在本實(shí)驗(yàn)中60 h的抑制率已經(jīng)達(dá)80%，繼續(xù)增加發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑制率的提升不大，且會(huì)增加發(fā)酵成本。

表1 不同時(shí)間PDA培養(yǎng)基內(nèi)病原菌菌落直徑平均值和抑制率Table 1 Mean diameter and inhibition rate of pathogenic bacteria in PDA medium at different time

2.2 重量法和差減法結(jié)果比較

初始pH值對(duì)發(fā)酵微生物的生長繁殖和代謝產(chǎn)物的合成有非常顯著的影響。因此，選擇最適合的初始pH值對(duì)微生物的培養(yǎng)就顯得尤為重要。重量法測得不同初始pH值的培養(yǎng)基在72 h后脂肽物質(zhì)的產(chǎn)量從高到低依次為pH 6，pH 7，pH 5（圖1），初始pH值為6和7條件下的脂肽物質(zhì)的產(chǎn)量顯著大于pH 5處理（P＜0.05），pH值為6和7的發(fā)酵液酸沉降時(shí)沉淀明顯比pH值為5的發(fā)酵液多，說明培養(yǎng)液pH值為5時(shí)對(duì)脂肽物質(zhì)的生成不利。差減法計(jì)算得到不同處理脂肽物質(zhì)產(chǎn)量差異規(guī)律與重量法一致，但產(chǎn)量比重量法高（圖1），初始pH值為5，6，7處理的差減法測定結(jié)果分別比重量法高69.9%，15.8%和17.0%。這是因?yàn)門OC能檢測到溶液有機(jī)碳的微小變化，重量法則因?yàn)橘|(zhì)量太少無法檢測到微小變化，因此差減法相比重量法更加靈敏。2種方法的結(jié)果存在一定的相關(guān)性，但由于重量法的靈敏度較低，導(dǎo)致相關(guān)系數(shù)僅0.5632（n=9）。

隨著微生物生長繁殖脂肽類物質(zhì)不斷積累，微生物繁殖越多則代謝產(chǎn)量越多。pH值為5時(shí)產(chǎn)量低的原因可能是因?yàn)樗嵝原h(huán)境不利于WK1生長。整個(gè)發(fā)酵過程中初始pH值為5的發(fā)酵液pH值始終低于6.0（圖2），而初始pH值為6和7的發(fā)酵液pH值在前24 h急速下降，之后快速回升，到48～56 h恢復(fù)到初始水平，之后繼續(xù)上升，最后達(dá)8.14。發(fā)酵液pH值的下降主要是代謝過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸引起的，在最初的24 h培養(yǎng)基中的葡萄糖被快速分解產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，而之后這些有機(jī)酸又被微生物分解利用，溶液中的有機(jī)酸慢慢減少。另外，微生物的代謝過程產(chǎn)生氨，隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行氨濃度增加，pH值逐漸回升。

初始pH值為5處理含菌體發(fā)酵液的總有機(jī)碳質(zhì)量濃度明顯高于pH 6和pH 7處理（圖3），說明pH值為5條件下WK1代謝消耗最少，再次證明初始pH值為5處理不利于WK1生長。由于所有處理的初始有機(jī)碳質(zhì)量濃度是相等的，微生物代謝越活躍，消耗的有機(jī)碳就越多。

圖1 培養(yǎng)基不同初始pH值脂肽類物質(zhì)的重量法和差減法結(jié)果比較Figure 1 Comparison on lipopeptide production measured by weight methods and OC difference methods

圖 2 不同初始 pH值的 Landy培養(yǎng)基內(nèi)pH值隨發(fā)酵時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamics of liquid pH with increasing time of fermentation between different initial Landy medium pH

2.3 培養(yǎng)基底物碳的利用效率評(píng)價(jià)

初始pH值為5的培養(yǎng)基中菌株WK1脂肽物質(zhì)合成效率最低（162 mg·kg-1），排放的二氧化碳也最少（205 mg·kg-1），初始pH值為6和7的培養(yǎng)基中菌株WK1活動(dòng)排放的二氧化碳相同，顯著高于初始pH值為5的處理（P＜0.05），pH 6培養(yǎng)基中菌株WK1脂肽物質(zhì)合成效率高于pH 7培養(yǎng)基。Landy培養(yǎng)基有機(jī)碳質(zhì)量濃度理論值為5769.55 mg·L-1，重鉻酸鉀法和TOC分析儀測得Landy培養(yǎng)基初始有機(jī)碳質(zhì)量濃度分別為4933.30和5252.43 mg·L-1，分別是理論值的85.51%和90.14%，說明2種方法均不能完全檢測溶液中的全部有機(jī)碳。通過分析含菌體的發(fā)酵液有機(jī)碳質(zhì)量濃度（圖3）以及酸沉降前后的總有機(jī)碳質(zhì)量濃度（圖4）可知：初始pH值為5條件下有機(jī)碳質(zhì)量濃度顯著高于其他2個(gè)處理，說明pH值為5條件下的培養(yǎng)基中未被微生物同化利用的碳最高。綜合圖1，圖3和圖4的結(jié)果得知：初始pH值為5條件微生物代謝利用的總碳、合成的脂肽類物質(zhì)、排放的二氧化碳均為最少。

圖3 不同處理培養(yǎng)結(jié)束后溶液中有機(jī)碳質(zhì)量濃度比較Figure 3 Comparison of organic carbon content in solution containing WK1 strains at the end of 72 h fermentation between treatments

圖4 不同處理發(fā)酵液酸沉降前后的總有機(jī)碳質(zhì)量濃度結(jié)果比較Figure 4 Comparison of total organic carbon in solution before and after lipopeptide being separated by acid deposition between treatments

由于重鉻酸鉀法和TOC法對(duì)同一溶液的測定結(jié)果存在差異，因此，計(jì)算差值時(shí)必須以同一種方法測定的結(jié)果計(jì)算。結(jié)果表明（表2）：初始pH值為5時(shí)培養(yǎng)基中菌株WK1脂肽物質(zhì)合成效率最低（162 mg·kg-1），二氧化碳排放量也最少（205 mg·kg-1）；初始pH值為6和7的培養(yǎng)基中菌株WK1的二氧化碳排放量相同，顯著高于初始pH值為5的處理（P＜0.05），但初始pH值為6的培養(yǎng)基中菌株WK1脂肽物質(zhì)合成效率高于初始pH值為7處理，因此，初始pH值為6的培養(yǎng)基為最佳。由于初始pH值為6的處理二氧化碳排放量較高，后期實(shí)驗(yàn)可探索初始pH 5和pH 6之間菌株WK1脂肽物質(zhì)合成效率的變化，有可能找到二氧化碳排放量較低，但又不影響脂肽物質(zhì)合成效率的pH值。

表2 各處理二氧化碳排放量和脂肽物質(zhì)合成效率Table 2 CO2emission and produced lipopeptide from organic carbon medium

3 結(jié)論與討論

解淀粉芽孢桿菌WK1獲得較高產(chǎn)量脂肽物質(zhì)的最佳培養(yǎng)時(shí)間為72 h，比許多已報(bào)道的芽孢桿菌長。不同細(xì)菌的生長速度不同，最佳培養(yǎng)時(shí)間有差異，而同樣是芽孢桿菌，生長速度也存在較大差異。車曉曦等［18］得到解淀粉芽孢桿菌SAB1菌株最佳發(fā)酵時(shí)間為26 h，王帥等［19］發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Bacillus subtilisG1發(fā)酵38 h時(shí)脂肽產(chǎn)量最高，洪鵬等［20］發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌HF-01菌株培養(yǎng)48 h對(duì)柑橘綠霉病菌Penicillum digitatum拮抗效果最佳。相比而言，WK1的生長速度相對(duì)較慢，獲得較高脂肽產(chǎn)量的發(fā)酵時(shí)間為72 h，與解淀粉芽孢桿菌MH17最優(yōu)發(fā)酵時(shí)間相同［21］。

初始pH值為5條件下微生物脂肽物質(zhì)合成效率和二氧化碳排放量均最低，初始pH值為6與7條件下二氧化碳排放量（700 mg·kg-1）相同，但pH值為6條件下脂肽物質(zhì)產(chǎn)量（1228 mg·L-1培養(yǎng)基）和脂肽合成效率（234 mg·kg-1）最高。由此可見：WK1菌株最適初始pH值為6，而不同解淀粉芽孢桿菌菌株產(chǎn)脂肽最適初始pH值不同，張雷［22］對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株15-1-1的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn)：初始pH值為7時(shí)該菌株產(chǎn)脂肽物質(zhì)產(chǎn)量以及培養(yǎng)液D（600）值最大，陳敏等［23］在對(duì)解淀粉芽孢桿菌菌株SC1150發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)發(fā)現(xiàn)最適初始pH值為6.5。

重量法與差減法測定的不同處理的脂肽物質(zhì)產(chǎn)量規(guī)律相同，從高到低依次為pH 6，pH 7，pH 5，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.5632（n=9），但相同初始pH值條件下差減法所得的脂肽物質(zhì)產(chǎn)量均高于重量法。可見，差減法是評(píng)價(jià)脂肽產(chǎn)量的簡單快速而有效的方法。