EphA1/EphrinA反饋環(huán)調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞促肝細(xì)胞癌血管生成潛能

俞海濤，郭鵬毅，謝孝宰，陳鋼

（1.嘉興學(xué)院附屬第二醫(yī)院 肝膽外科，浙江 嘉興 314000；2.寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院 心胸外科，浙江寧波 315000；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 肝膽外科，浙江 溫州 325015）

內(nèi)皮祖細(xì)胞能特異性地靶向腫瘤新生血管并參與血管生成，因此以內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體和靶點(diǎn)的抗血管生成治療有著誘人的應(yīng)用前景，然而由于內(nèi)皮祖細(xì)胞中治療基因表達(dá)的不受調(diào)控會(huì)導(dǎo)致治療失敗，因此能否精確調(diào)控治療基因定時(shí)、定量表達(dá)是取得突破的關(guān)鍵。前期實(shí)驗(yàn)將Tet-on基因表達(dá)系統(tǒng)調(diào)節(jié)質(zhì)粒及EphA1小干擾RNA質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染進(jìn)大鼠骨髓起源內(nèi)皮祖細(xì)胞系中并構(gòu)建了可精確調(diào)控EphA1基因表達(dá)的雙穩(wěn)轉(zhuǎn)內(nèi)皮祖細(xì)胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet，并證實(shí)利用強(qiáng)力霉素可精確誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞中EphA1 SiRNA質(zhì)粒表達(dá)，從而導(dǎo)致EphA1 mRNA和蛋白表達(dá)的下調(diào)[1]。本研究進(jìn)一步分析體外調(diào)控EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因的表達(dá)對(duì)EphA1/EphrinA1 信號(hào)通路以及對(duì)其細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；同時(shí)探討體外誘導(dǎo)活體內(nèi)EPCsEphA1/SiRNA-Tet中EphA1基因表達(dá)對(duì)其促肝癌血管生成的影響，旨在通過(guò)本研究建立一種安全、高效的可以調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體和靶點(diǎn)的肝癌抗血管生成治療模式。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系與裸鼠 6～8 周齡雄性BALB/c裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)研究動(dòng)物中心，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（浙）2015-0009。huh7 肝癌細(xì)胞株（本實(shí)驗(yàn)室保存），內(nèi)皮祖細(xì)胞系本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.2 試劑與材料 EphA1、EphrinA1多克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）、CD31單克隆抗體（英國(guó)Abcam公司），MTT（美國(guó)Sigma公司），Matrigel膠（美國(guó)R&D公司），Transwell小室（美國(guó)Corning公司），EGM-2含生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基（瑞士LONZA公司）；胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）。

1.3 Western blot檢測(cè)強(qiáng)力霉素對(duì)EphA1/EphrinA1信號(hào)通路影響 檢測(cè)強(qiáng)力霉素對(duì)EPCsTet-On-EphA1SiRNA中EphA1及其配體EphrinA1蛋白表達(dá)的影響：分為調(diào)控組[Dox（+）組，培養(yǎng)液中分別含強(qiáng)力霉素1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL]及非調(diào)控組[Dox（-）組]。簡(jiǎn)要步驟：收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞約2×105個(gè)，加100 μL細(xì)胞裂解液混勻后，于12 000 r/min離心30 min，取上清液作為細(xì)胞總蛋白質(zhì)，經(jīng)SDS聚丙烯酰氨凝膠分離蛋白，電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5% BSA加一抗溫育過(guò)夜，TBST洗滌，加二抗溫育1 h，后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑于暗室自顯影。

1.4 MTT比色實(shí)驗(yàn)測(cè)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPCsEphA1/SiRNA-Tet，5 000個(gè)/孔接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基（此時(shí)培養(yǎng)基中均不含強(qiáng)力霉素），待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基總體積200 μL，其中Dox（+）組培養(yǎng)液中分別含強(qiáng)力霉素1、10和100 μg/mL。分別在接種后24、48、72 h取細(xì)胞進(jìn)行MTT比色試驗(yàn)。簡(jiǎn)要步驟：每孔加入5 g/L的MTT溶液10 μL，孵育4 h后終止培養(yǎng)，吸棄上清，加入150 μL DMSO，振蕩15 min，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)分析儀測(cè)定490 nm處吸光度值，以只加培養(yǎng)液，不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔調(diào)零，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPCsTet-On-EphA1SiRNA體外遷移能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPCsEphA1/SiRNA-Tet，100 000個(gè)/孔接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基（此時(shí)培養(yǎng)基中均不含強(qiáng)力霉素），細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)基總體積500 μL，其中Dox（+）組培養(yǎng)液中分別含強(qiáng)力霉素1、10和100 μg/mL。簡(jiǎn)要步驟：待細(xì)胞生長(zhǎng)滿90%左右后，采用200 μL的槍頭在孔中央作一垂直水平的寬度0.6 mm左右的劃痕，在培養(yǎng)0、12和24 h時(shí)于倒置相差顯微鏡下攝片。測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的劃痕兩側(cè)細(xì)胞間的距離，測(cè)量時(shí)沿劃痕邊緣等距離間隔作5個(gè)標(biāo)記作為數(shù)據(jù)測(cè)定點(diǎn)，取平均值，每組重復(fù)3次。

1.6 Transwell法檢測(cè)EPCsTet-On-EphA1SiRNA體外侵襲能力 Transwell實(shí)驗(yàn)中所用的Matrigel膠能在聚碳酸濾膜表面形成類(lèi)似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞侵襲穿過(guò)重建Matrigel的能力反映EPCsEphA1/SiRNA-Tet的侵襲能力。Matrigel基質(zhì)膠4 ℃下過(guò)夜使其變成液態(tài)，后加入transwell小室的上室中，每室100 μL（冰上操作），37 ℃下放置2～3 h使其凝固。分別用含1、10和100 μg/mL或不含強(qiáng)力霉素的無(wú)血清培養(yǎng)基1 mL重懸EPCsEphA1/SiRNA-Tet（1×106個(gè)細(xì)胞/mL）。每上室分別加200 μL細(xì)胞懸液。下室中均加入500 μL含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，37 ℃下孵育48 h。取出小室，PBS洗2遍；用棉簽輕輕擦去上室上表面的細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫溶液常溫下染色10 min，4%中性甲醛固定、封片，顯微鏡下觀察穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)。每張膜隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)取其均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 測(cè)量裸鼠移植瘤血管生成體積 取5×106個(gè)細(xì)胞/mL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期肝癌細(xì)胞系Huh-7細(xì)胞皮下接種于裸鼠左前肢腋下，成瘤后取生長(zhǎng)旺盛期的腫瘤組織剪切成1 mm3左右小塊，無(wú)菌條件下皮下接種于20只裸鼠左前肢腋下部位；在皮下接種腫瘤細(xì)胞第7天后經(jīng)尾靜脈回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet（1×106/只）。隨后將裸鼠隨機(jī)分為4組（每組5只）：Dox（+）組第2周起飼以含強(qiáng)力霉素（10、100和1 μg/mL）的5%蔗糖溶液，Dox（-）組則飼以5%蔗糖溶液，每4 d更換飲用水。Dox（+）組和Dox（-）組裸鼠體質(zhì)量無(wú)明顯差異。每周記錄裸鼠移植瘤體積并在培養(yǎng)第7周后處死裸鼠，切取皮下移植瘤進(jìn)行對(duì)比，每只裸鼠皮下移植瘤切取部分，甲醛固定后做石蠟包塊，切片后使用CD31進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，統(tǒng)計(jì)裸鼠移植瘤中微血管密度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以表示，2組間比較用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞EphA1/EphrinA1信號(hào)通路影響 Dox（+）組中EphA1蛋白表達(dá)水平明顯降低，其中10 μg/mL Dox（+）組（0.293±0.029）較Dox（-）組（0.943±0.041）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=12.94，P＜0.001）。EphrinA1是EphA1的特異性配體，Dox（+）組調(diào)控后EphrinA1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，10 μg/mL Dox（+）組（0.322±0.041）與Dox（-）組（0.892±0.065）比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.864，P=0.008），見(jiàn)圖1。

圖1 體外調(diào)控EphA1 表達(dá)后EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞EphA1和EphrinA1蛋白表達(dá)的Western blot電泳圖

2.2 體外調(diào)控EphA1 基因?qū)PCsEphA1/SiRNA-Tet增殖能力的影響 在24、48 和72 h時(shí)對(duì)比各組間EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞增殖能力，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 體外調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet運(yùn)動(dòng)能力的影響 劃痕12 h后鏡下可見(jiàn)各組EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞大部分恢復(fù)正常形態(tài)，并且仍保留明顯空白區(qū)。1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組的細(xì)胞劃痕間距比值分別為（39.17±4.03）%、 （37.03±3.58）%、（44.97±3.81）%及（60.87±4.01）%；10 μg/mL Dox（+）組遷移距離較Dox（-）組明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.435，P=0.002）；24 h后Dox（-）組劃痕已愈合，而Dox（+）組仍保留明顯空白區(qū)，見(jiàn)圖3。

2.4 體外調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞侵襲能力的影響 24 h后1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組穿過(guò)濾膜的數(shù)目為（74.6±7.2）個(gè)、 （67.8±4.5）個(gè)、（84.6±7.8）個(gè)及（92.4±8.9）個(gè)；與Dox（-）組比10 μg/mL Dox（+）組穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.467，P=0.039）。見(jiàn)圖4。

圖2 體外調(diào)控EphA1 表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞增殖能力的影響

2.5 體外調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-TetAkt通路的影響 1 μg/mL Dox（+）組、10 μg/mL Dox（+）組、100 μg/mL Dox（+）組及Dox（-）組中其下游的Akt、p-Akt、MMP-2和MMP-9的表達(dá)量都發(fā)生了相應(yīng)的變化。10 μg/mL Dox（+）組較Dox（-）組Akt相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；10 μg/mL Dox（+）組較Dox（-）組的p-Akt和其下游MMP-2/MMP-9相對(duì)表達(dá)量都下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖5。

2.6 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)裸鼠肝癌移植瘤成瘤體積的影響 第1～第4周時(shí)Dox（+）各濃度組皮下移植瘤體積與Dox（-）組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；第5～第6周時(shí)Dox（+）各組腫瘤體積增長(zhǎng)均明顯減慢，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而1 μg/mL Dox（+）組和10 μg/mL Dox（+）組裸鼠移植瘤體積在第6周時(shí)較Dox（-）組也明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而Dox（+）3組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6。

2.7 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)裸鼠肝癌移植瘤微血管密度的影響 光鏡下可見(jiàn)腫瘤被膜及癌巢之間結(jié)締組織中有較多血管。Dox（-）組各癌巢間結(jié)締組織明顯較多，且有結(jié)締組織伸入癌巢中，可見(jiàn)癌巢被結(jié)締組織分割為小結(jié)節(jié)狀，微血管為（37.0±4.1）個(gè)；而100 μg/mL Dox（+）組癌巢較大，癌巢之間亦有結(jié)締組織，但無(wú)明顯結(jié)締組織伸入癌巢內(nèi)的情況，微血管為（21.6±3.6）個(gè)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.823，P=0.024），見(jiàn)圖7。

3 討論

圖3 體外調(diào)控EphA1 表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet遷移能力的影響（×100）

圖4 體外調(diào)控EphA1 表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet侵襲能力的影響（×50）

圖5 體外調(diào)控EphA1 表達(dá)對(duì)EPCsEphA1/SiRNA-Tet Akt/MMP-2/MMP-9通路的影響

圖6 回輸EPCsEphA1/SiRNA-Tet體內(nèi)調(diào)控EphA1表達(dá)對(duì)裸鼠肝癌移植瘤體積的影響

圖7 裸鼠移植瘤微血管密度的免疫組織化學(xué)染色（×100）

肝癌是一種多血管性的腫瘤，抑制肝癌血管形成，切斷肝癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移所依賴的“命脈”，已成為重要的抗癌戰(zhàn)略。研究表明骨髓起源的循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞能定向歸巢腫瘤的新生血管并參與血管生成[2]，利用內(nèi)皮祖細(xì)胞固有的腫瘤新生血管趨化性，能克服傳統(tǒng)細(xì)胞載體不能系統(tǒng)傳遞到所有腫瘤病灶的問(wèn)題，同時(shí)目前以內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體和靶點(diǎn)的腫瘤靶向血管生成治療也取得了卓有成效的進(jìn)展[3-6]。然而以內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體的基因治療和其他基因治療都存在著同一問(wèn)題，即治療基因表達(dá)不受調(diào)控，治療基因的過(guò)度表達(dá)或不適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)不僅會(huì)影響治療結(jié)果，而且會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生病理性損害，甚至?xí)a(chǎn)生致命的不良反應(yīng)[7]，因此實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的精確調(diào)控一直是腫瘤基因治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[8]。本研究致力于建立一種可精確調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞中治療基因定時(shí)、定量表達(dá)的操作體系，使以內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體和靶點(diǎn)的腫瘤抗血管生成治療更安全更高效。

四環(huán)素基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)（Tet基因表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)）是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的用于基因功能研究的新技術(shù)，該系統(tǒng)誘導(dǎo)因子是四環(huán)素及衍生物（目前大多用強(qiáng)力霉素）。利用該調(diào)控系統(tǒng)不僅能精確調(diào)控腫瘤細(xì)胞中目的基因的表達(dá)，還能精確調(diào)控干細(xì)胞中目的基因定時(shí)、定量地表達(dá)，而且這種調(diào)控并不會(huì)影響其自我更新及分化的能力[9]。

已往的研究發(fā)現(xiàn)EphA1/EphrinA1信號(hào)軸參與了肝癌的血管生成過(guò)程，通過(guò)免疫組織化學(xué)檢測(cè)證實(shí)，在肝癌的癌組織及血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在EphA1及其配體EphrinA1蛋白的高表達(dá)[10]，細(xì)胞及動(dòng)物水平研究發(fā)現(xiàn)利用EphA1 SiRNA可外源性地下調(diào)Huh-7肝癌細(xì)胞中EphA1基因的表達(dá)進(jìn)而通過(guò)EphA1/EphrinA1信號(hào)軸抑制肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲能力[11]，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt通路為EphA1/EphrinA1信號(hào)軸的下游信號(hào)[12]，可見(jiàn)EphA1/EphrinA1信號(hào)軸在肝癌血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。近期我們已證實(shí)骨髓起源的內(nèi)皮祖細(xì)胞能特異性地靶向肝癌的的新生血管并參與血管生成[13]，在人外周血EPCs中也檢測(cè)到EphrinA1基因mRNA的表達(dá)[14]，由此推測(cè)EphA1/EphrinA1信號(hào)軸可能參與了內(nèi)皮組細(xì)胞歸巢肝癌新生血管的過(guò)程。

本研究利用前期構(gòu)建的受強(qiáng)力霉素調(diào)控可精確表達(dá)EphA1基因的內(nèi)皮祖細(xì)胞系EPCsEphA1/SiRNA-Tet，在體外研究中結(jié)果顯示10 μg/mL的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)可最大程度地抑制EphA1蛋白的表達(dá)，較之未調(diào)控組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EphA1蛋白的表達(dá)下調(diào)進(jìn)而影響其配體EphrinA1的表達(dá)，最終達(dá)到調(diào)控EphA1/EphrinA1信號(hào)軸的目的；同時(shí)細(xì)胞生物學(xué)行為檢測(cè)結(jié)果表明，盡管下調(diào)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞中EphA1基因表達(dá)時(shí)對(duì)其增殖能力無(wú)明顯影響，但下調(diào)EphA1/EphrinA1信號(hào)通路活性可明顯抑制EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力和向細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲能力，較未調(diào)控組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且10 μg/mL的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)時(shí)效果最為顯著；而且以往研究表明PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)能對(duì)EphrinA1介導(dǎo)的肝癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力產(chǎn)生影響[12]，因此通過(guò)Western blot驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，在EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞中下調(diào)EphA1/EphrinA1信號(hào)通路活性，也能抑制Akt信號(hào)通路，同時(shí)其下游代表細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的MMP-2及MMP-9的表達(dá)也出現(xiàn)下調(diào)，且10 μg/mL的強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)時(shí)效果明顯。另外活體實(shí)驗(yàn)中通過(guò)體外飼以含不同濃度強(qiáng)力霉素的蔗糖溶液來(lái)調(diào)控活體內(nèi)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞中EphA1 基因的表達(dá)，結(jié)果顯示盡管在EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞趨向腫瘤新生血管的早期未能明顯有效地抑制移植瘤的生長(zhǎng)，然而當(dāng)EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞整合入腫瘤新生血管后，下調(diào)EphA1 基因的表達(dá)能明顯抑制瘤的生長(zhǎng)，且這種抑制效果在100 μg/mL強(qiáng)力霉素調(diào)控下效果最為明顯，同時(shí)進(jìn)行了瘤組織免疫組織化學(xué)染色分析，結(jié)果顯示下調(diào)EphA1 基因的表達(dá)使瘤體內(nèi)微血管密度較未調(diào)控組明顯下調(diào)。體內(nèi)外研究結(jié)果證實(shí)成功的建立了一種可精確調(diào)控EPCsEphA1/SiRNA-Tet細(xì)胞中治療基因表達(dá)的系統(tǒng)，并在活體內(nèi)達(dá)到良好的調(diào)控效果，為以可調(diào)控治療基因表達(dá)的內(nèi)皮祖細(xì)胞為載體和靶點(diǎn)的肝癌抗血管生成治療提供了新的治療模式。