茶樹愈傷組織誘導

劉靜

摘要：以茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]種子在無菌條件下萌發(fā)的根和葉為外植體，探究在MS培養(yǎng)基中不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑對茶樹根和葉愈傷組織誘導的影響。結果表明，以幼根為外植體誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基為NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L，誘導率為85.1%;培養(yǎng)基NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L為幼葉誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基，誘導率為87.0%。

關鍵詞：茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.];愈傷組織;組織培養(yǎng);誘導率

中圖分類號：S571.1 ? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）18-0149-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.036 ? ? ? ? ? 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Callus induction from tea tree

LIU Jing

（School of Modern Agriculture and Biotechnology，Ankang University，Ankang 725000，Shaanxi，China）

Abstract： The effects of different plant growth regulators on the induction of tea[Camellia sinensis（L.） O. Ktze.] root and leaf callus in MS medium were investigated by using the germinated roots and leaves of tea seeds as explants under aseptic conditions. The results showed that the optimum medium for callus induction was NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L， and the induction rate was 85.1%. NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L was the optimal medium for callus induction in young leaves， with an induction rate of 87.0%.

Key words： tea tree[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]; callus; tissue culture; induction rate

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Ktze.]屬山茶科山茶屬多年生常綠木本植物，茶葉中含有機化學成分和無機礦物元素等，具有提神醒腦、解毒、利尿等功效[1]。茶樹按照繁殖方式的不同分為種子繁殖和無性繁殖，種子直播簡單易行，成本低廉，但天然茶樹種子萌發(fā)受時間和季節(jié)的影響，并且難以擺脫氣候和環(huán)境的不利影響，育種目的難以真正實現(xiàn)。無性繁殖以扦插為主，但是該方法在育苗周期、繁殖系數(shù)、對環(huán)境的要求方面有一定的缺陷，這使得茶樹新品種的繁育和推廣速度受到限制[2]，利用組織培養(yǎng)繁殖不僅可以解決上述問題，而且具有材料利用率高、育苗周期短、繁殖數(shù)量大、不受季節(jié)影響等諸多優(yōu)點。本試驗以茶樹無菌苗的幼根和幼葉為外植體，通過植物組織培養(yǎng)技術補充茶樹愈傷組織誘導途徑，旨在為茶樹無菌苗的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

供試材料為陜茶1號茶樹成熟蒴果，當年10月初采收，種子采收后一部分常溫保存，另一部分在4 ℃條件下冷藏保存。

所需植物生長調(diào)節(jié)劑為6-芐氨基嘌呤、萘乙酸、2，4-二氯苯乙酸，所需基本培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基。

1.2 ?方法

1.2.1 ?茶樹種子的殺菌 ?茶樹種子剝?nèi)スず?，流水沖洗2 h，用75%乙醇殺菌30 s，0.1%氯化汞殺菌8 min，無菌水沖洗5～6次。

1.2.2 ?茶樹種子的不同處理方法 ?①將低溫儲存的茶樹種子（帶種皮）殺菌后接種在空白MS培養(yǎng)基上。②將低溫儲存的茶樹種子殺菌并去除種皮后接種在空白MS培養(yǎng)基上。③將低溫儲存的茶樹種子殺菌并去除種皮，再將子葉切除2/3后接種于空白MS培養(yǎng)基上。

空白MS培養(yǎng)基中蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂含量為8 g/L，pH為5.8，光照度為1 500 lx，光照時間為12 h/d，溫度為25 ℃。30 d后統(tǒng)計不同處理方法對茶樹種子的萌發(fā)率及幼苗生長的影響。

萌發(fā)率=萌發(fā)的種子個數(shù)/接種的未污染的種子總數(shù)×100%

1.2.3 ?常溫儲存的茶樹種子萌發(fā)率和低溫儲存的茶樹種子萌發(fā)率的比較 ?將常溫儲存和低溫儲存的茶樹種子殺菌，去除種皮后將子葉切除2/3分別接種于空白MS培養(yǎng)基上。30 d后統(tǒng)計不同處理方法下茶樹種子的萌發(fā)率及幼苗生長情況。

萌發(fā)率=萌發(fā)的種子個數(shù)/接種的未污染的種子總數(shù)×100%

1.2.4 ?茶樹愈傷組織誘導 ?當無菌苗生長到3～4 cm時，將茶樹無菌苗的幼根切成0.5 cm長，無菌苗的幼葉切成0.5 cm×0.5 cm大小分別接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，共9種：①NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L;②NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L;③NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L;④NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 3.0 mg/L;⑤NAA 0.1 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑥NAA 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑦NAA 1.0 mg/L+6-BA 1.0 mg/L;⑧6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L;⑨6-BA 1.0 mg/L+2，4-D 1.0 mg/L。接種30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導率，比較不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑組合對愈傷組織誘導的影響。

愈傷組織誘導率=（長出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%

2 ?結果與分析

2.1 ?不同處理方法對低溫儲存種子萌發(fā)率及幼苗生長的影響

從表1可以看出，冷藏一段時間的茶樹種子，其中保留內(nèi)種皮的種子萌發(fā)率為0，去除內(nèi)種皮保留完整子葉的種子萌發(fā)率為84.3%，去除內(nèi)種皮保留1/3子葉的種子萌發(fā)率為90.1%。觀察發(fā)現(xiàn)帶有內(nèi)種皮的茶樹種子接種2 d后附帶培養(yǎng)基全部褐化，且后期沒有萌發(fā)跡象（圖1a），在萌發(fā)時間上，以一芽三葉為培養(yǎng)目標，未去除種皮的種子未見萌發(fā)，去除種皮的完整種子（圖1b）萌發(fā)需要的時間為14 d;萌發(fā)最快的為去除種皮的帶有1/3子葉的種子，只需10 d左右;可能由于茶樹緊實的種子結構抑制了芽點的生長，所以將子葉分開后對芽點的生長更有利。去除種皮的冷藏種子萌發(fā)率保持在80.0%以上，生長狀況良好，不僅莖葉茁壯，還有數(shù)條側(cè)根長出（圖1c）。

2.2 ?不同儲存溫度對茶樹種子萌發(fā)率的影響

從表2可以看出，未經(jīng)冷藏的去除內(nèi)種皮保留1/3子葉的茶樹種子萌發(fā)率為56.0%。種子萌發(fā)所需時間長，且生長緩慢;而經(jīng)過冷藏的種子萌發(fā)率可達90.1%，種子萌發(fā)快，幼苗健壯，經(jīng)過冷藏的去除種皮的種子萌發(fā)率遠高于未經(jīng)冷藏處理種子，可能是種子內(nèi)部含有脫落酸等抑制萌發(fā)的內(nèi)源性激素，經(jīng)過一段時間的冷藏處理，抑制物質(zhì)流失，有利于種子萌發(fā)。

2.3 ?茶樹愈傷組織的誘導

2.3.1 ?以無菌苗的根為外植體誘導愈傷組織情況 ?在以幼根為外植體誘導愈傷組織的過程中，主要表現(xiàn)為以下幾種情況：第一，幼根接種在培養(yǎng)基上后有部分出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，繼代培養(yǎng)無明顯變化或逐漸死亡（圖2a）;第二，愈傷組織生長速度較慢，通過30 d的誘導只有少量淡黃色的愈傷組織且質(zhì)地較硬（圖2b），可能由于茶樹為木本植物，雖然為幼根，但也有少部分木質(zhì)化，導致愈傷組織生長緩慢且質(zhì)地較硬;第三，愈傷組織的誘導率較低。從表3可以看出，1號至4號培養(yǎng)基中，隨著2，4-D的濃度升高，愈傷組織的誘導率明顯升高，2，4-D的濃度以1.5～2.0 mg/L為宜，超過或低于這一范圍，愈傷組織的誘導率均表現(xiàn)出下降的趨勢。在5號至7號培養(yǎng)基中，愈傷組織生長緩慢，數(shù)量少。8號培養(yǎng)基無愈傷組織產(chǎn)生，綜上所述，以幼根為外植體，誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基為2號培養(yǎng)基（NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 1.5 mg/L）。

2.3.2 ?以幼葉為外植體誘導愈傷組織情況 ?茶樹幼葉在接種后逐漸向上皺卷，膨大變厚，10 d后在外植體切口邊緣出現(xiàn)少量黃白色顆粒狀愈傷組織（圖3a）;30 d后，幼葉切口邊緣的愈傷組織逐漸增多，愈傷組織顏色為黃白色（圖3b）。從表4可以看出，在1號至4號培養(yǎng)基中，2號和3號培養(yǎng)基的愈傷組織誘導率較高，分別為83.7%和87.0%，通過多次繼代培養(yǎng)，可以得到大量淡黃色愈傷組織。5號至7號培養(yǎng)基中，在6-BA濃度相同的情況下，愈傷組織隨著NAA濃度的升高，誘導率呈遞增趨勢，當NAA濃度達到1.0 mg/L時，愈傷組織誘導率可達75.0%。在8號、9號培養(yǎng)基中，6-BA的濃度從0.5 mg/L增加到1.0 mg/L，誘導率從24.3%提高至72.4%。誘導出的愈傷組織逐漸由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\黃綠色，質(zhì)地較松脆。綜上所述，無論是愈傷組織誘導率還是愈傷組織的質(zhì)量，3號培養(yǎng)基（NAA 1.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L）都較為適合。

3 ?小結與討論

3.1 ?茶樹種子的萌發(fā)

本試驗所用茶樹種子為當年10月初采集，其中一部分茶樹種子常溫保存，另一部分茶樹種子放置4 ℃冰箱保存，研究發(fā)現(xiàn)茶樹種子的種皮和貯存溫度對種子萌發(fā)有較大影響，種皮極易引起培養(yǎng)基的褐化，并限制茶樹種子的萌發(fā)，試驗中沒有去除種皮的種子萌發(fā)率為零，去除種皮的種子有較高的萌發(fā)率，并且低溫儲存的種子萌發(fā)率遠高于常溫儲存。武田善行等[3]研究發(fā)現(xiàn)茶樹種子經(jīng)過一段時間冷藏處理后，可促進發(fā)芽和顯著提高發(fā)芽整齊度，種子經(jīng)短期低溫處理效果顯著，但隨著冷藏時間加長其效果逐漸變小。郭帶英[4]認為茶樹種子在低溫下貯藏能延長其生命力并保持較高的萌發(fā)率。

3.2 ?茶樹愈傷組織誘導中對外植體的選擇

以茶樹無菌苗的根和葉為外植體誘導愈傷組織，葉愈傷組織誘導率相對較高，陳玉玲等[5]比較了幼莖和葉誘導愈傷組織的效果，認為幼莖要好于葉片，葉片的葉脈較葉緣更易產(chǎn)生愈傷組織，局部的褐化對愈傷組織生長影響不大，葉片誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.4 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L。奚彪等[6]選擇春季的腋芽為外植體，成功誘導出愈傷組織并獲得了再生植株，但其成梢率低、生長慢。目前，已經(jīng)成功利用茶樹的營養(yǎng)器官和生殖器官通過組織培養(yǎng)技術得到完整植株，但對于最優(yōu)外植體仍然沒有定論，可見，在外植體的選擇上仍然具有繼續(xù)探索的必要性。

3.3 ?存在的問題和今后的研究方向

茶樹再生體系的建立包括愈傷組織的誘導、繼代、分化，最后形成具有較高生長能力的植株這一系列過程。本試驗通過9種不同培養(yǎng)基誘導愈傷組織，部分培養(yǎng)基能夠得到較為理想的愈傷組織，但仍有部分培養(yǎng)基沒有誘導出愈傷組織，并且已得到的愈傷組織生長速度慢、數(shù)量少。通過種子培養(yǎng)出的無菌苗作為外植體來源，可以明顯地控制外植體褐化，但仍然有部分根在誘導中發(fā)生褐化并難以改善。雖然有報道稱子葉為茶樹愈傷組織誘導的最佳材料[7]，但在本試驗中未能實現(xiàn)，這將在后期研究中進一步探索。茶樹再生體系的建立，因素多樣，聯(lián)系復雜，需要調(diào)整的空間較大，所以，還需要大量的研究對該體系的建立提供技術支持和完善的理論。

參考文獻：

[1] 邊世平.茶葉的化學成分及其保健作用[J].青海大學學報（自然科學版），2004，22（4）：64-65.

[2] 黃燕芬，吳 ?曦，周國蘭，等.茶樹無菌播種建立植株再生體系[J].河南農(nóng)業(yè)科學，2013，42（5）：60-63.

[3] 武田善行，葉乃興.低溫貯藏對茶籽發(fā)芽的影響[J].茶葉科學簡報，1994（4）：44.

[4] 郭帶英.茶籽的采收及貯藏對幼苗成活率的影響[J].廣東茶葉，1986（1）：18-22.

[5] 陳玉玲，馬麗霞，紀紅冰，等.茶愈傷組織誘導的研究[J].河北師范大學學報（自然科學版），2007，31（3）：389-391.

[6] 奚 ?彪，劉祖生.外植體性質(zhì)對茶腋芽組培快繁的影響[J].茶葉，1994，20（4）：14-17.

[7] 黃燕芬，周國蘭，趙華富，等.茶子未成熟胚子葉柄離體培養(yǎng)誘導再生植株[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2011，39（3）：31-33.