酶抑制法快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的比較試驗(yàn)

羅俊霞　趙建波　賈冬　尚航影　韓洛利　宋曉爽

摘要：采用6種商品化酶抑制法快速檢測(cè)試劑盒對(duì)敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷4種有機(jī)磷農(nóng)藥進(jìn)行了快速測(cè)定。結(jié)果表明，6種試劑盒對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性、檢出限各不一樣;6種試劑盒對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制率與農(nóng)藥濃度的對(duì)數(shù)線性模擬回歸的線性范圍也不相同;取用3.0 mL的提取液和取用2.5 mL的提取液抑制率差別不大，僅有個(gè)別農(nóng)藥在個(gè)別濃度水平下有差異。酶抑制法快速檢測(cè)試劑盒對(duì)各種有機(jī)磷農(nóng)藥的檢測(cè)敏感性不同，在實(shí)際的檢測(cè)工作中，建議對(duì)抑制率≥10%的樣品進(jìn)行復(fù)檢，同時(shí)采用色譜質(zhì)譜進(jìn)行了定性定量分析。

關(guān)鍵詞：酶抑制法;快速檢測(cè);有機(jī)磷農(nóng)藥;敏感性

中圖分類號(hào)：O656 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2019）18-0115-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.18.028 ? ? ? ? ? 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Comparative test of enzyme reagent method for rapid detection of

organophosphorus pesticide residues

LUO Jun-xia1，ZHAO Jian-bo2，JIA Dong1，SHANG Hang-ying1，HAN Luo-li1，SONG Xiao-shuang1

（1.Zhengzhou Agricultural Product Quality Inspection and Circulation Center，Zhengzhou 450006，China;

2.Zhengzhou Agricultural Technology Promotion Center，Zhengzhou 450006，China）

Abstract： Four organophosphorus pesticides， including dichlorvos， quinthion， trichlorfon and octamphos-methyl， were rapidly determined by six reagent kits of commercial enzyme inhibition. The results showed that the reproducibility of pesticide residue in the rapid detection kit by enzyme inhibition decreased with the increase of inhibition rate. The sensitivity and detection limit of each reagent box to several pesticides were different. The inhibition rate of each reagent box for the four pesticides is not the same as the linear regression range of the logarithm of the pesticide concentration. There was little difference between 3.0 mL extraction and 2.5 mL extraction during the test， and individual pesticides differed at individual concentration levels. Since the reagent box for rapid detection of pesticide residues by enzyme inhibition method has different sensitivity for the detection of various pesticides， it is recommended that the sample with a suppression rate of ≥10% be reexamined in the actual test work， and that the chromatographic mass spectrometry be used for qualitative quantification.

Key words： enzyme inhibition method; rapid detection; organophosphorus pesticide; sensitivity

近年來，各種農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用越來越多，為應(yīng)對(duì)市場(chǎng)發(fā)展的需求及加入WTO后國際市場(chǎng)的要求，國家加強(qiáng)了對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品的監(jiān)管提出了更高的要求。農(nóng)藥殘留是農(nóng)藥使用后殘存于農(nóng)產(chǎn)品、生物體及環(huán)境中的農(nóng)藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質(zhì)的總稱[1]。而農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法主要有儀器分析法、生物檢測(cè)法和酶抑制法等。酶抑制法通過污染物對(duì)各種酶的抑制作用來表征污染物的綜合毒性，相比儀器分析法，該法具有操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)[2-6]，但酶的來源紛繁復(fù)雜，對(duì)各種有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感程度也不同[7-13]，姜露等[12]、溫艷霞等[13]則更為深入地對(duì)植物酯酶中的麥麩酯酶和大豆酯酶進(jìn)行了研究，劉永杰等[6]對(duì)羧酸酯酶進(jìn)行了研究，黃志勇等[14]、汪葵等[15]將植物酯酶和膽堿酯酶進(jìn)行了比較，鄭藝華等[16]對(duì)動(dòng)物酯酶中的雞肝酯酶進(jìn)行了研究，楊莉等[17]對(duì)豬肝酯酶與膽堿酯酶進(jìn)行了比較，丁運(yùn)華等[18]將3種不同來源的膽堿酯酶進(jìn)行了比較試驗(yàn)，張寧[19]則對(duì)動(dòng)物膽堿酯酶和植物膽堿酯酶進(jìn)行了比對(duì)試驗(yàn)?；谶@些研究，快速檢測(cè)產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，但據(jù)調(diào)查市售的商品快速檢測(cè)產(chǎn)品的酶源多數(shù)來源于動(dòng)物酶源中的膽堿酯酶[20-27]，但商品化酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的試劑盒對(duì)各種農(nóng)藥的敏感程度需要使用單位進(jìn)行甄別。

為了解基于酶抑制法的各種試劑盒對(duì)農(nóng)藥的敏感性，篩選出更適應(yīng)于快速檢測(cè)的酶抑制法檢測(cè)試劑盒，對(duì)6種商品化酶抑制法快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)比較，以期對(duì)試劑盒的生產(chǎn)起到參考作用。

1 ?材料與方法

1.1 ?儀器與試劑

CL-BIII型16通道農(nóng)殘速測(cè)儀（上海復(fù)博農(nóng)業(yè)科技有限公司）;SHA-C型雙重恒溫水浴振蕩器（杰瑞爾電器有限公司）;HH.W21-Cr 420型電熱恒溫水浴鍋（北京三二八科學(xué)儀器有限公司）;WH-861型漩渦混合器;Rongtai 5 mL和Thermo 200 μL的移液槍;農(nóng)藥殘留檢測(cè)試劑盒的品牌分別是深圳A試劑盒、廣州B試劑盒、東莞C試劑盒、廈門D試劑盒、湖北E試劑盒、深圳F試劑盒;由農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù)科研檢測(cè)所生產(chǎn)的濃度為1 000 mg/L的敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷等有機(jī)磷類農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使用時(shí)稀釋成80 μg/mL的儲(chǔ)備液。

1.2 ?試劑配制

6種商品化檢測(cè)試劑盒里有緩沖試劑、酶試劑、顯色劑和底物，緩沖試劑用500 mL的去離子水溶解，酶試劑（乙酰膽堿酯酶）、顯色劑（二硫代硝基苯甲酸）和底物分別按照各試劑盒說明書的要求進(jìn)行配制，具體方法見表1。

1.3 ?方法

1.3.1 ?試驗(yàn)分組 ?試驗(yàn)分別選用敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷4種農(nóng)藥，每種農(nóng)藥設(shè)置5個(gè)濃度，分別為0.05、0.50、1.00、2.00、3.00 mg/kg，每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)定3次。同時(shí)，根據(jù)針對(duì)每種有機(jī)磷農(nóng)藥每個(gè)濃度設(shè)置2個(gè)處理，為3.0 mL樣品溶液或2.5 mL樣品溶液。

1.3.2 ?樣品的檢測(cè) ?分別取樣品溶液3.0 mL或2.5 mL于10 mL試管中，依次加入0.1 mL的酶液、0.1 mL的顯色劑，用旋渦混合振蕩器混勻，再用電熱恒溫水浴鍋在37 ℃水浴10 min，取出后加入0.1 mL的底物搖勻，立即放入儀器比色池中，用CL-BIII型16通道的農(nóng)殘速測(cè)儀測(cè)定3 min內(nèi)的吸光度變化值ΔA。同時(shí)，設(shè)置緩沖液溶液作為對(duì)照。

1.3.3 ?重現(xiàn)性試驗(yàn) ?通過試劑盒測(cè)定在不同濃度水平下對(duì)各種有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制率，計(jì)算抑制率的平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，根據(jù)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差比較各試劑盒測(cè)定4種農(nóng)藥的重現(xiàn)性。

1.3.4 ?敏感性試驗(yàn) ?6種試劑盒對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥抑制率與濃度的對(duì)數(shù)線性模擬回歸，獲得線性回歸方程，計(jì)算出IC50和IC10。將IC10確定為檢出限，將IC50確定為超標(biāo)限，根據(jù)檢出限比較6種試劑盒對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?6種商品化試劑盒測(cè)定4種有機(jī)磷農(nóng)藥的重現(xiàn)性分析

由表2可知，在6種商品化試劑盒中B試劑盒測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的重現(xiàn)性最差，其次是D試劑盒;同時(shí)，對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感程度越高的酶試劑或農(nóng)藥的濃度越高時(shí)測(cè)定有機(jī)磷農(nóng)藥的重現(xiàn)性越好。重現(xiàn)性最差的B酶試劑測(cè)定濃度為0.05 mg/kg的辛硫磷時(shí)，當(dāng)提取液體積為3.0、2.5 mL時(shí)變異系數(shù)分別為7.8、9.2，其抑制率分別為15.3%、12.6%;其次是B試劑盒測(cè)定濃度為0.50 mg/kg的敵敵畏時(shí)，當(dāng)提取液體積為3.0、2.5 mL時(shí)變異系數(shù)分別為7.7、7.8，其抑制率分別為14.7%、13.0%;再次是B試劑盒測(cè)定濃度為0.05 mg/kg的喹硫磷時(shí)，當(dāng)提取液體積為3.0、2.5 mL時(shí)變異系數(shù)分別為2.4、6.6，其抑制率分別為18.4%、5.8%;D試劑盒測(cè)定濃度為0.05 mg/kg的敵敵畏時(shí)，當(dāng)提取液體積為3.0、2.5 mL時(shí)變異系數(shù)分別為1.9、5.6，其抑制率分別為48.1%、33.3%。其他變異系數(shù)基本在5.0以下，重現(xiàn)性相對(duì)較好。

2.2 ?6種商品化試劑盒對(duì)4種有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性分析

2.2.1 ?6種商品化試劑盒對(duì)敵敵畏的敏感性比較 ?由圖1可知，6種商品化試劑盒測(cè)定敵敵畏，提取液體積為3.0和2.5 mL，其折線圖基本相同;B試劑盒測(cè)定時(shí)，敵敵畏濃度從0.05 mg/kg增加至3.00 mg/kg，其抑制率增幅最大，D試劑盒和F試劑盒增幅相差較小，C試劑盒和E試劑盒在最低濃度水平下，其抑制率就達(dá)100%或接近100%。從折線圖可以看出，綜合不同濃度測(cè)定結(jié)果，當(dāng)提取液體積為3.0 mL 時(shí)，6種試劑盒對(duì)敵敵畏敏感性按照E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、D試劑盒、F試劑盒、B試劑盒的順序依次降低。

2.2.2 ?6種商品化試劑盒對(duì)喹硫磷的敏感性比較 ?由圖2可知，6種商品化試劑盒測(cè)定喹硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時(shí)，其折線圖除了A試劑盒有差異外，其他圖形基本相似;C試劑盒和E試劑盒在測(cè)定濃度范圍內(nèi)增幅相差較小，不同濃度水平下抑制率達(dá)100%或接近100%。從折線圖來看，綜合不同濃度測(cè)定結(jié)果，提取液為2.5 mL和3.0 mL時(shí)分別測(cè)定喹硫磷，其敏感性分別按照C試劑盒、E試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、A試劑盒、D試劑盒的順序依次降低和E試劑盒、C試劑盒、D試劑盒、A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒的順序依次降低。

2.2.3 ?6種商品化試劑盒對(duì)敵百蟲的敏感性比較 ?由圖3可知，6種商品化試劑盒測(cè)定敵百蟲，提取液體積為3.0和2.5 mL時(shí)，其折線圖除了A試劑盒差別較大外，其他基本相同。從折線圖來看，綜合不同濃度測(cè)定結(jié)果，提取液為3.0 mL時(shí)，6種商品化試劑盒對(duì)敵百蟲的敏感性按照D試劑盒、E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、F試劑盒（B試劑盒）的順序依次降低;提取液為3.0 mL時(shí)，對(duì)敵百蟲的感敏性按照D試劑盒、E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、B試劑盒（F試劑盒）的順序依次降低。

2.2.4 ?6種商品化試劑盒對(duì)辛硫磷的敏感性比較 ?由圖4可知，6種商品化試劑盒測(cè)定測(cè)定辛硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時(shí)，其折線圖基本相同。從折線圖來看，綜合不同濃度測(cè)定結(jié)果，6種商品化試劑盒對(duì)敵敵畏的敏感性按照C試劑盒（E試劑盒）、D試劑盒、B試劑盒、F試劑盒、A試劑盒的順序依次降低。

2.3 ?6種商品化試劑盒測(cè)定4種有機(jī)磷農(nóng)藥相關(guān)性及檢出限分析

2.3.1 ?6種試劑盒測(cè)定敵敵畏時(shí)相關(guān)性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測(cè)定敵敵畏時(shí)，C試劑盒和E試劑盒線性范圍比較窄，當(dāng)濃度為0.5 mg/kg時(shí)，抑制率達(dá)到100%，在0.05～0.50 mg/kg的范圍內(nèi)只包含2個(gè)點(diǎn)，相關(guān)系數(shù)為1.000 0。A試劑盒、B試劑盒、D試劑盒、F試劑盒4種試劑盒測(cè)定敵敵畏在0.05～3.00 mg/kg范圍內(nèi)，提取液為3.0 mL和2.5 mL時(shí)，其抑制率和農(nóng)藥濃度的常用對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.947 9、0.846 2、0.889 6、0.895 8;0.896 9、0.877 0、0.889 4。從IC50和IC10結(jié)果來看，按照E試劑盒、C試劑盒、A試劑盒、D試劑盒、B試劑盒、F試劑盒順序?qū)硵澄返拿舾行灾饾u降低。除了E試劑盒，F(xiàn)試劑盒、D試劑盒、C試劑盒、B試劑盒的檢出限均是3.0 mL低于2.5 mL，就測(cè)定敵敵畏而言，取用3.0 mL的提取液比取用2.5 mL的提取液靈敏度更高。

2.3.2 ?6種試劑盒測(cè)定喹硫磷時(shí)相關(guān)性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測(cè)定喹硫磷時(shí)，提取液為2.5 mL的C試劑盒和提取液為3.0 mL的E試劑盒均在濃度為0.05 mg/kg，其抑制率就達(dá)到100%;提取液為3.0 mL的C試劑盒和提取液為2.5 mL的E試劑盒均在濃度為0.5 mg/kg時(shí)抑制率就達(dá)到100%。B試劑盒、D試劑盒、F試劑盒3個(gè)品牌在0.05～3.00 mg/kg范圍內(nèi)，提取液為3.0 mL和2.5 mL時(shí)，其抑制率和農(nóng)藥濃度的常用對(duì)數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.981 8、0.994 3、0.950 6;0.985 8、0.988 7、0.960 7;就檢出限來看，按照A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、D試劑盒、C試劑盒、E試劑盒的順序依次降低，試劑盒靈敏度依次升高。

2.3.3 ?6種試劑盒測(cè)定敵百蟲時(shí)相關(guān)性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測(cè)定敵百蟲時(shí)，其酶抑制率方程的線性范圍不一致，在提取液體積為3.0 mL時(shí)，A試劑盒、D試劑盒兩個(gè)品牌線性范圍為0.05～3.00 mg/kg，B試劑盒、F試劑盒的線性范圍為1.0～3.0 mg/kg，C試劑盒、E試劑盒的線性范圍為0.05～2.00 mg/kg;在提取液體積為2.5 mL時(shí)，A試劑盒、D試劑盒、E試劑盒3個(gè)品牌線性范圍為0.05～3.00 mg/kg，B試劑盒的線性范圍為0.5～3.0 mg/kg，C試劑盒的線性范圍為0.05～1.00 mg/kg，F(xiàn)試劑盒的線性范圍為2.0～3.0 mg/kg。就檢出限來看，按照F試劑盒、B試劑盒、A試劑盒、C試劑盒、E試劑盒、D的順序依次降低，試劑盒的靈敏度依次升高。

2.3.4 ?6種試劑盒測(cè)定辛硫磷時(shí)相關(guān)性及檢出限分析 ?由表3可知，6種試劑盒測(cè)定辛硫磷，提取液體積為3.0和2.5 mL時(shí)，C試劑盒和E試劑盒均在濃度為0.05 mg/kg時(shí)，其抑制率就達(dá)到100%，無法擬合抑制率和濃度對(duì)數(shù)的曲線;其他試劑盒抑制率和濃度的常用對(duì)數(shù)均在0.05～3.00 mg/kg范圍內(nèi)呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系。就檢出限來看，按照A試劑盒、F試劑盒、B試劑盒、D試劑盒的順序依次降低，試劑盒的靈敏度依次升高。

3 ?結(jié)論

研究結(jié)果表明，6種商品化試劑盒對(duì)敵敵畏、喹硫磷、敵百蟲、辛硫磷的敏感性均不相同，可能因?yàn)樵噭┖兄忻傅膩碓床煌⑻崛〉姆椒ú煌蛎傅募兌炔煌?，說明試劑盒在酶的選擇和提取上應(yīng)該嚴(yán)格控制。在日常的檢測(cè)工作中，使用A試劑盒，酶的重現(xiàn)性較高，不易受外界環(huán)境影響;而E試劑盒的重現(xiàn)性較差，受外界環(huán)境的影響較大。

按照蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[28-32]，樣品的抑制率達(dá)到50%則判定為樣品超標(biāo)，即是IC50所對(duì)應(yīng)的濃度值，國家限量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)每一種農(nóng)藥的限量不同，試劑盒對(duì)農(nóng)藥敏感性也不一，同時(shí)酶抑制法不能定性，因此在日常檢測(cè)中只要抑制率高于10%的樣品建議復(fù)檢。

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