基于血腦屏障靶向多肽的腦神經(jīng)分析化學(xué)研究進(jìn)展

黃嫣嫣　趙睿

摘?要?將用于分析檢測(cè)的分子或材料透過(guò)血腦屏障（Blood?brain barrier， BBB），使其高效靶向中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)原位、在體腦神經(jīng)化學(xué)分析亟需解決的問(wèn)題。多肽作為內(nèi)源性生理活性物質(zhì)，具有模塊化的結(jié)構(gòu)，不僅設(shè)計(jì)性強(qiáng)、構(gòu)象可預(yù)測(cè)，而且利用固相合成方法可高效、低干擾地獲得目標(biāo)序列。以小分子多肽為穿梭工具，可將熒光分子、造影劑、納米顆粒等高效、快速地轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)位置，為腦科學(xué)研究及相關(guān)疾病的檢測(cè)、分子機(jī)制研究提供新方法和新技術(shù)。本文圍繞BBB和多肽的特點(diǎn)，從BBB穿透途徑和靶向多肽設(shè)計(jì)篩選方法出發(fā)，對(duì)近年來(lái)基于多肽（Peptide shuttles）的BBB靶向分析的研究進(jìn)展進(jìn)行了總結(jié)和評(píng)述，期望從分子、細(xì)胞到活體的角度為腦神經(jīng)分析化學(xué)研究提供參考和借鑒。

關(guān)鍵詞?血腦屏障; 多肽; 靶向分析; 親和篩選; 評(píng)述

1?引 言

腦功能的發(fā)揮離不開(kāi)各種化學(xué)物質(zhì)，從蛋白質(zhì)等大分子到神經(jīng)肽、氨基酸、膽堿等小分子，執(zhí)行并調(diào)控著神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)部、神經(jīng)細(xì)胞之間以及大腦和外周神經(jīng)之間的信號(hào)傳遞[1～3]。以腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)及其特征分子活動(dòng)為目標(biāo)，在細(xì)胞、組織和活體層次開(kāi)展實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)和原位分析檢測(cè)，對(duì)于腦功能的解析、腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究具有重要意義[4，5]。血腦屏障（Blood?brain barrier， BBB）是腦神經(jīng)分析化學(xué)面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)。人工設(shè)計(jì)的分子、材料或藥物，必須要穿透BBB才能實(shí)現(xiàn)原位活體檢測(cè)、示蹤或調(diào)控的目的[6～8]。作為維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的物理和功能屏障，由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞、基膜等構(gòu)成的BBB具有致密結(jié)構(gòu)（圖1），對(duì)進(jìn)入的分子具有極其嚴(yán)苛的選擇性和限制，阻擋了98%的小分子物質(zhì)和幾乎所有大分子從血液進(jìn)入腦組織[9～11]。因此，如何將用于分析檢測(cè)的探針透過(guò)BBB，使其高效靶向地到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是實(shí)現(xiàn)原位、在體腦神經(jīng)化學(xué)分析亟需解決的問(wèn)題。隨著化學(xué)、生物學(xué)和材料等學(xué)科的快速發(fā)展，以及對(duì)BBB認(rèn)識(shí)的逐漸深入，新的分子、納米材料和機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)或構(gòu)建，用于穿梭BBB，在眾多領(lǐng)域成為研究的熱點(diǎn)[7，12～14]。

多肽作為內(nèi)源性的生理活性物質(zhì)，具有生物相容性高、組織穿透能力強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定等特點(diǎn)[15～17]。此外，多肽分子具有模塊化的結(jié)構(gòu)，不僅設(shè)計(jì)性強(qiáng)、構(gòu)象可預(yù)測(cè)，而且利用固相合成方法可高效、低干擾地獲得目標(biāo)序列。人工設(shè)計(jì)、合成和篩選高親和力、高選擇性的多肽是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)[18～20]。由于特殊的物理化學(xué)性質(zhì)和生物學(xué)效應(yīng)，越來(lái)越多的多肽被發(fā)現(xiàn)具有穿透生物屏障的能力，這些生物屏障不僅有BBB，還包括細(xì)胞膜和胃腸道膜[12，13，21]。以這些多肽為工具，可將用于腦成像的熒光分子、造影劑、納米顆粒等高效、快速地轉(zhuǎn)運(yùn)到目標(biāo)位置，實(shí)現(xiàn)腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和信號(hào)的原位、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)分析，進(jìn)而為腦科學(xué)及相關(guān)疾病的檢測(cè)、分子機(jī)制研究提供新方法和新技術(shù)。本文圍繞BBB和多肽的特點(diǎn)，從BBB穿透途徑和靶向多肽設(shè)計(jì)篩選方法出發(fā)，對(duì)近年來(lái)基于多肽（Peptide shuttles）的BBB靶向分析研究進(jìn)展進(jìn)行了歸納總結(jié)，期望從分子、細(xì)胞到活體的角度為腦神經(jīng)分析化學(xué)研究提供參考和借鑒。

2?多肽與血腦屏障

BBB是所有物質(zhì)進(jìn)入大腦的必經(jīng)之路，然而大腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞致密連接，阻斷了外源性物質(zhì)以細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)的方式進(jìn)入大腦（圖1）[9，13，22]。在疾病治療過(guò)程中，多數(shù)藥物進(jìn)入大腦中常是侵入性的，涉及高風(fēng)險(xiǎn)的腦損傷或神經(jīng)功能障礙[13，23]。顯然，該方法無(wú)法滿足原位、無(wú)損分析的要求。避開(kāi)細(xì)胞間質(zhì)輸運(yùn)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)克服BBB，成為一種理想方式，也成為腦分析常見(jiàn)的策略[12，13]。

BBB和其它生物屏障（如細(xì)胞膜）具有類似的化學(xué)性質(zhì)，其中之一便是高度親脂性[9]。因此，增加親脂性成為提高被動(dòng)運(yùn)輸穿透內(nèi)皮細(xì)胞效率的方法。此外，引入正電荷可增加分子和細(xì)胞表面陰離子（如糖蛋白）的相互作用，從而介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞攝入和被動(dòng)運(yùn)輸[24]。然而，這些化學(xué)修飾不具有選擇性，所獲得的產(chǎn)物在透過(guò)BBB的同時(shí)，也被其它組織攝取，導(dǎo)致脫靶。為了提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)的靶向選擇性，可采用仿生修飾方法提高小分子的BBB穿透能力。一些生命活動(dòng)的必需物質(zhì)（激素、葡萄糖、氨基酸等）能快速、高效地進(jìn)入大腦[25]。以這些分子的結(jié)構(gòu)為指導(dǎo)，對(duì)目標(biāo)探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和修飾，可望用于腦神經(jīng)系統(tǒng)分析。

相比于對(duì)每種特定化合物進(jìn)行修飾，從而賦予其BBB穿透能力，發(fā)展可用于不同類別客體分子的輸運(yùn)載體，更具有通用性。BBB shuttles的概念最早由Pardridge教授于1986年提出[26]。第一個(gè)成功實(shí)驗(yàn)的是正電荷修飾的白蛋白[27]，如前所述，簡(jiǎn)單電荷修飾的被動(dòng)運(yùn)輸缺少組織靶向性，腦部聚集效率不能滿足研究的要求?；诜肿幼R(shí)別的主動(dòng)運(yùn)輸方法由抗體首先實(shí)現(xiàn)[28]。以靶向細(xì)胞表面受體的抗體為載體，提高了BBB透過(guò)性，但抗原?抗體的極高親和力使抗體滯留在BBB[29]，實(shí)際進(jìn)入腦實(shí)質(zhì)的效率降低。BBB shuttles在歷經(jīng)蛋白質(zhì)、抗體分子之后，多肽成為了近十年的關(guān)注點(diǎn)。

多肽具有可設(shè)計(jì)性、穩(wěn)定性、細(xì)胞核組織穿透性等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，使其成為理想的BBB shuttles。同時(shí)，多肽相互作用親和力可控，合適的親和力有利于分子從BBB進(jìn)一步到腦實(shí)質(zhì)的釋放。氨基酸是多肽的構(gòu)建單元，其種類多樣，結(jié)構(gòu)靈活，具有豐富的可修飾位點(diǎn)，可用于功能化或客體偶聯(lián)。從早期的源自于HIV病毒的TAT多肽實(shí)現(xiàn)跨越BBB轉(zhuǎn)運(yùn)酶[30，31]，到僅有3個(gè)氨基酸殘基的小分子轉(zhuǎn)運(yùn)載體谷胱甘肽（GSH）[32]，多肽作為BBB shuttles的研究發(fā)展迅速。尤其在近五年，研究者設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)了30余種BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽 [12，13]，展現(xiàn)出更高的穿透效率和功能多樣性，成為開(kāi)展腦神經(jīng)化學(xué)分析不可或缺的有力工具。

3?BBB靶向轉(zhuǎn)運(yùn)肽的設(shè)計(jì)和親和篩選

多肽穿透BBB的途徑分為被動(dòng)運(yùn)輸和主動(dòng)運(yùn)輸（圖2A）[33]。一些典型的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽如表1所列。由于致密的BBB細(xì)胞間質(zhì)難以透過(guò)，經(jīng)BBB內(nèi)皮細(xì)胞攝入成為了跨越屏障的主要方式。因此，可結(jié)合并進(jìn)入細(xì)胞的多肽常是BBB shuttles的候選化合物。研究者從分子識(shí)別、結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)或化合物庫(kù)構(gòu)建出發(fā)，采用生命分析化學(xué)方法進(jìn)行篩選，以期獲得新型BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（圖2B）[13]。

新的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)體系的發(fā)現(xiàn)需要建立合理有效的篩選鑒定方法。目前，BBB體外篩選模型主要有基&：指Spengler等[40]描述的3字母氨基酸代碼（Stands for 3?letter amino acid code from one described by Spengler et al[40]）; [Dap]：二氨基丙酸（Diaminopropionic acid）。

于細(xì)胞的體外篩選模型和平行人工膜滲透裝置等[13]。在這些篩選分析的最后一步，往往需要利用高效液相色譜（High?performance liquid chromatography， HPLC）對(duì)Transwell系統(tǒng)中的多肽進(jìn)行分離和定量分析，以確定不同多肽透過(guò)BBB的效率[41]。隨著分析裝置向微型化、微量化方向發(fā)展，對(duì)鑒定檢測(cè)的靈敏度提出了更高的要求，LC?MS/MS成為多肽定量分析的主要手段。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，最近建立了基于內(nèi)標(biāo)定量的MALDI?TOF MS方法用于BBB模型中多肽穿透效率的評(píng)價(jià)，具有快速、簡(jiǎn)便和綠色環(huán)保的優(yōu)勢(shì)[41]。此外，BBB轉(zhuǎn)運(yùn)活體研究模型主要借助腦部微透析、熒光/化學(xué)發(fā)光等成像技術(shù)[13]，對(duì)進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的候選化合物進(jìn)行原位的定性與定量分析。分析方法和技術(shù)的進(jìn)步為高效、準(zhǔn)確的體外篩選提供了重要保障。

3.1?被動(dòng)運(yùn)輸多肽的設(shè)計(jì)和篩選

被動(dòng)運(yùn)輸多肽進(jìn)入細(xì)胞時(shí)不依賴受體識(shí)別，而是采用非特異性攝入的方式。其特征理化性質(zhì)包括親脂性、富含正電荷或利于插入細(xì)胞膜的SymbolaA@螺旋[12]。細(xì)胞穿膜肽（Cell?penetrating peptides， CPPs）具有高效的細(xì)胞穿透能力，常作為穿透大腦內(nèi)皮細(xì)胞的載體，是被動(dòng)運(yùn)輸多肽的代表[42，43]。大部分CPPs源于天然的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，如HIV病毒膜融合相關(guān)蛋白質(zhì)中的TAT多肽[31]。通過(guò)非特異性的細(xì)胞內(nèi)吞作用（Adsorptive?mediated transcytosis，AMT），可增加熒光染料、酶和納米顆粒等的BBB透過(guò)效率，將其運(yùn)載至中樞神經(jīng)系統(tǒng)[42]。

基于TAT等多肽結(jié)構(gòu)，通過(guò)仿生設(shè)計(jì)得到的寡聚精氨酸，屬于人工設(shè)計(jì)的BBB運(yùn)載多肽[44]?；谶z傳算法的結(jié)構(gòu)優(yōu)化方法也被用于多肽物理化學(xué)性質(zhì)的設(shè)計(jì)，調(diào)控的參數(shù)涉及氫鍵單元、脂水分配系數(shù)（lgP）等[45]。研究表明，N?甲基化的多肽具有穿透BBB的能力[28，46]，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建的具有N?MePhe重復(fù)單元的多肽，如（N?MePhe）4，曾被認(rèn)為是被動(dòng)運(yùn)輸型BBB shuttles的金標(biāo)準(zhǔn)（Gold?standard）[33]。從體外構(gòu)建的BBB模型到活體應(yīng)用，上述多肽實(shí)現(xiàn)了不同荷載分子的高效腦部運(yùn)輸。

多肽化合物庫(kù)（Peptide library）以其高度多樣性成為新型功能分子的重要來(lái)源，無(wú)疑也為BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽的發(fā)現(xiàn)提供了豐富的資源（圖2）[18，47，48]。將肽庫(kù)與分子設(shè)計(jì)相結(jié)合，Malakoutikhah等[49]設(shè)計(jì)了一系列多肽候選化合物，構(gòu)建了固定化膜親和色譜體系和體外膜滲透性分析體系，通過(guò)肽鏈長(zhǎng)度、端基類型和取代氨基酸的篩選，獲得了透過(guò)率高、生物相容性好的優(yōu)選多肽，具有成為BBB被動(dòng)運(yùn)輸有效載體的潛力。相比于被動(dòng)運(yùn)輸多肽，肽庫(kù)設(shè)計(jì)篩選更多地用于主動(dòng)運(yùn)輸型BBB轉(zhuǎn)運(yùn)肽的構(gòu)建，為獲得具有靶向特異性的多肽提供了有效途徑。

在已有的BBB被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)載體中，親脂性化合物仍占多數(shù)，但其水溶性差，阻礙其進(jìn)一步的活體分析和生物應(yīng)用。因此，設(shè)計(jì)篩選水溶性的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽成為研究熱點(diǎn)。利用脯氨酸水溶性高、特殊的亞胺和環(huán)形分子結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，Arranz?Gibert等[33]將經(jīng)典的N?MePhe序列與多聚脯氨酸結(jié)合，設(shè)計(jì)出新型轉(zhuǎn)運(yùn)多肽，不僅具有高效的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)能力，而且水溶性增加了1000倍。通過(guò)替換多肽序列中氨基酸對(duì)映體，發(fā)現(xiàn)了生物膜穿透能力的手性歧視效應(yīng)，并解析了這種歧視效應(yīng)可能來(lái)源于不同手性氨基酸導(dǎo)致多肽二級(jí)構(gòu)象的差異性。具有高水溶性的被動(dòng)運(yùn)輸多肽在腦神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞標(biāo)記和成像分析中具有良好的應(yīng)用前景。

3.2?主動(dòng)運(yùn)輸多肽的設(shè)計(jì)篩選

主動(dòng)運(yùn)輸多肽通過(guò)與血腦屏障界面處的受體分子相互作用，進(jìn)而由受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與其它BBB轉(zhuǎn)運(yùn)方式相比，主動(dòng)運(yùn)輸由于具有靶向特異性，增加了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的富集效率，避免了外周組織非特異性分布的脫靶效應(yīng)[12，13，42]，在分析檢測(cè)時(shí)降低了背景噪音，大大提高了選擇性和靈敏度。不僅如此，主動(dòng)運(yùn)輸方式能夠攜帶的物質(zhì)更為廣泛，基本不受尺寸、表面電荷等物理化學(xué)性質(zhì)的影響[12]。因此，針對(duì)BBB特有受體的分子特征，發(fā)展主動(dòng)運(yùn)輸多肽設(shè)計(jì)篩選新方法，對(duì)于腦神經(jīng)化學(xué)分析的發(fā)展具有重要意義。

天然存在的神經(jīng)生物活性物質(zhì)是BBB主動(dòng)運(yùn)輸多肽的來(lái)源之一（圖2），包括內(nèi)源性物質(zhì)，如激素、神經(jīng)肽和脂蛋白等，也可以是外源性的病毒和神經(jīng)毒素[13]。最近，Pradhan等[50]從兩棲動(dòng)物大腦神經(jīng)肽中獲取了一個(gè)具有活性的四肽片段Ser?Leu?Lys?Pro（SLKP），經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)再設(shè)計(jì)的SLKP類肽成功穿透了BBB的，并具有促進(jìn)神經(jīng)突觸生長(zhǎng)的活性（圖3A）。蜂毒神經(jīng)毒素是具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)主動(dòng)靶向能力的天然物質(zhì)，但其生物毒性大，免疫原性及易被蛋白酶酶解的缺點(diǎn)阻礙其在腦神經(jīng)分析化學(xué)中的應(yīng)用。為了解決上述問(wèn)題，Teixidó研究組對(duì)蜂毒肽Apamin結(jié)構(gòu)進(jìn)行了結(jié)構(gòu)精煉和設(shè)計(jì)，獲得了環(huán)狀內(nèi)酰胺類肽MiniAp?4，不僅具有更高效的BBB主動(dòng)運(yùn)輸能力，而且低毒、抗降解; 其具有的、可功能化的官能團(tuán)，有利于熒光分子、蛋白質(zhì)和納米顆粒的修飾，是理想的轉(zhuǎn)運(yùn)載體[35]?；诃h(huán)狀內(nèi)酰胺橋連結(jié)構(gòu)有利于抑制多肽活體降解，該研究組以動(dòng)物毒液成分為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了環(huán)狀小肽用于金納米顆粒的功能化。在體外細(xì)胞模型中，環(huán)肽攜帶運(yùn)載的納米顆?？纱┩竷?nèi)皮細(xì)胞，證明天然存在的神經(jīng)活性物質(zhì)可為BBB主動(dòng)運(yùn)輸多肽設(shè)計(jì)和發(fā)現(xiàn)提供有益的借鑒（圖3B）[51]。

主動(dòng)運(yùn)輸中起介導(dǎo)作用的受體非常適合作為多肽化合物庫(kù)篩選的靶標(biāo)，從數(shù)目龐大的候選多肽中選出與其具有高結(jié)合力的主動(dòng)靶向多肽。無(wú)論是基于生物方法的噬菌體展示肽庫(kù)（Phage display peptide library），還是基于化學(xué)合成的組合肽庫(kù)（Combinatorial peptide library），都已成為主動(dòng)靶向多肽的重要來(lái)源。以大腦內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（Transferrin receptor， TfR）為靶標(biāo)，Teixidó研究組利用體外BBB模型對(duì)所構(gòu)建的噬菌體展示肽庫(kù)進(jìn)行篩選，獲得了與TfR具有高親和力相互作用的十二肽THRre，在細(xì)胞和活體層次均顯示出BBB的高效穿透和荷載轉(zhuǎn)運(yùn)能力[36]。最近，該課題組為了解決活體穩(wěn)定性的問(wèn)題，對(duì)THRre進(jìn)行了結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)二分支的二價(jià)多肽可顯著增加BBB攝入效率和對(duì)綠色熒光蛋白質(zhì)的運(yùn)載能力，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的成像分析[52]。同樣以TfR為靶標(biāo)，Tan等[53]開(kāi)展了噬菌體展示肽庫(kù)的多輪篩選，并設(shè)置了陰性對(duì)照篩選體系，提高了多肽篩選的準(zhǔn)確性。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)，解析了優(yōu)選多肽與TfR的結(jié)合位點(diǎn); 利用共聚焦激光掃描顯微鏡和流式細(xì)胞分析確證了多肽和TfR高表達(dá)細(xì)胞的親和力和特異性，有望成為BBB靶向多肽。

受體的正確選擇是成功發(fā)現(xiàn)靶向多肽的前提。目前，用于主動(dòng)運(yùn)輸多肽篩選的受體有限，除了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，還有低密度脂蛋白、乙酰膽堿受體和胰島素等。2007年，Kumar等[37]從病毒糖蛋白中獲得了由29個(gè)氨基酸組成的多肽RVG，并發(fā)現(xiàn)其與神經(jīng)細(xì)胞高表達(dá)的乙酰膽堿受體有特異性結(jié)合作用; 利用精氨酸進(jìn)一步功能化構(gòu)建的RVG?9R主動(dòng)運(yùn)輸系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了RNA的腦部轉(zhuǎn)運(yùn)。Mann等[55]以低密度脂蛋白（LDLR）受體為靶標(biāo)，在高表達(dá)LDLR的細(xì)胞中開(kāi)展了噬菌體展示肽庫(kù)的篩選，獲得了與靶標(biāo)受體具有親和力的環(huán)肽; 通過(guò)結(jié)構(gòu)優(yōu)化，進(jìn)一步增強(qiáng)了與LDLR的親和力和特異性，實(shí)現(xiàn)了小分子、抗體片段等不同物質(zhì)的腦部高效輸運(yùn)。Picciolini等[56]以腦損傷相關(guān)的蛋白多糖復(fù)合物為標(biāo)志物，在小鼠體內(nèi)開(kāi)展了噬菌體展示肽庫(kù)的活體篩選。通過(guò)高通量篩選鑒定由尾靜脈定位至腦部的噬菌體，得到了一個(gè)短肽CAQK，不僅具有靶向主動(dòng)運(yùn)載小分子的能力，還可作為納米材料的表面修飾分子，特異性地將生物大分子轉(zhuǎn)運(yùn)到損傷位置。

4?基于靶向多肽的腦神經(jīng)化學(xué)分析新方法

抗體作為經(jīng)典的分子識(shí)別工具，具有高選擇性和高親和力。將抗原?抗體識(shí)別與光學(xué)、電化學(xué)等可檢測(cè)信號(hào)相結(jié)合，已用于神經(jīng)退行性疾病相關(guān)關(guān)鍵分子和物質(zhì)的分析[56～58]。然而，作為生物大分子，抗體存在分子尺寸大、穿透性差、免疫原性等問(wèn)題; 此外，其制備過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力、易失活等性質(zhì)也限制了其應(yīng)用范圍。利用多肽與靶標(biāo)分子的特異性識(shí)別和BBB轉(zhuǎn)運(yùn)能力，開(kāi)展腦神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)和信息的高選擇性、高靈敏度分析檢測(cè)，對(duì)于腦功能分子機(jī)制的揭示、生理病理過(guò)程的監(jiān)測(cè)和調(diào)控都具有重要意義。近幾年，以多肽為識(shí)別元件和BBB轉(zhuǎn)運(yùn)載體，將信號(hào)分子或納米材料高效輸送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，建立原位、實(shí)時(shí)的成像分析方法，從分子、細(xì)胞到活體水平為腦神經(jīng)化學(xué)研究提供了直接的可視化證據(jù)。

4.1?基于BBB靶向多肽的影像學(xué)分析方法

經(jīng)典的生物影像技術(shù)，如核磁共振成像（Nuclear magnetic resonance imaging， NMRi）、計(jì)算機(jī)斷層掃描（Computed tomography， CT）、正電子發(fā)射斷層掃描（Positron emission tomography， PET）等，推動(dòng)了神經(jīng)生理學(xué)和認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)的快速發(fā)展。以靶向多肽對(duì)造影劑或顯影劑進(jìn)行功能化，可提高BBB的穿透和富集效率，降低毒性，增加穩(wěn)定性和水溶性，在腦部病變的早期檢測(cè)中被廣泛研究和應(yīng)用[59，60]。

美國(guó)堪薩斯大學(xué)Tabanor等[61]采用羧基端酰胺化的六肽HAV6（Ac?SHAVSS?NH2），考察了多肽功能化前后的釓試劑在腦部NMRi成像中的效果。經(jīng)過(guò)尾靜脈注射，含有多肽的釓顯影劑獲得了更好的腦部定位和富集效率; 在多肽的作用下，在不同腦區(qū)都可檢測(cè)到核磁信號(hào)，顯示了多肽對(duì)小分子顯影劑的腦部輸運(yùn)能力?；诠入赘孰模℅SH）與GSH受體的特異性識(shí)別作用，Nosrati等[62]設(shè)計(jì)合成了GSH功能化的磁性納米材料，利用NMRi開(kāi)展了小鼠模型中納米材料的成像分布分析，觀測(cè)到多肽介導(dǎo)的BBB高效穿透和負(fù)載分子的靶向富集效應(yīng)。

納米顆?？山M裝不同的功能單元，已成為疾病檢測(cè)和治療研究的熱點(diǎn)。Frigell等[63]以葡萄糖保護(hù)的金納米顆粒為平臺(tái)，組裝了68Ga試劑作為PET信號(hào)團(tuán)，以兩條阿片樣神經(jīng)肽為BBB靶向基團(tuán)，制備了多功能的納米材料，開(kāi)展了生物成像分析（圖4）。根據(jù)所獲得的PET信號(hào)，與未修飾多肽的納米材料相比，神經(jīng)肽修飾的納米材料的BBB穿透能力增加了3倍，顯示了其在腦成像研究中的應(yīng)用前景。

將疾病特征的生理信號(hào)作為刺激，誘導(dǎo)影像信號(hào)的產(chǎn)生，可用于區(qū)分正常組織和病變組織，在術(shù)中病變組織的準(zhǔn)確切除中具有重要的指導(dǎo)意義。Gao等[39]根據(jù)腦腫瘤區(qū)別于正常組織的酸性微環(huán)境，構(gòu)建了酸刺激響應(yīng)的NMRi和表面增強(qiáng)拉曼（Surface?enhanced resonance Raman spectroscopy， SERRS）雙模態(tài)成像系統(tǒng)，用于指導(dǎo)腦腫瘤手術(shù)。他們?cè)O(shè)計(jì)了兩種表面修飾Angiopep2多肽的金納米顆粒Au?AZ和Au?AK。在多肽與受體的相互作用下，Au?AZ和Au?AK穿透BBB進(jìn)入腦組織; 腦腫瘤組織中的Au?AZ和Au?AK脫去表面保護(hù)層，暴露出可發(fā)生點(diǎn)擊反應(yīng)的官能團(tuán)而交聯(lián)聚集，使NMRi和SERRS信號(hào)均得到增強(qiáng); 在正常組織中則不會(huì)發(fā)生這種現(xiàn)象。利用刺激響應(yīng)的雙模態(tài)成像系統(tǒng)，明確區(qū)分了腦腫瘤和正常腦組織的邊界，為手術(shù)的成功提供了保障。

4.2?基于BBB靶向多肽的熒光成像分析方法

熒光成像技術(shù)以其高分辨率、高靈敏度的特點(diǎn)成為研究的熱點(diǎn)，在腦神經(jīng)系統(tǒng)分子事件的監(jiān)測(cè)、情感的分子基礎(chǔ)研究和疾病診斷中發(fā)揮了重要作用[14，64，65]。通過(guò)共價(jià)或非共價(jià)的方式將多肽與熒光染料或納米顆粒進(jìn)行偶聯(lián)，可利用熒光成像可視化地篩查所設(shè)計(jì)的多肽是否定位至腦組織。 Fadzen等[66]設(shè)計(jì)并預(yù)測(cè)了具有全氟芳烴結(jié)構(gòu)的大環(huán)多肽是一種新型的BBB轉(zhuǎn)運(yùn)肽， 利用Click反應(yīng)對(duì)多肽進(jìn)行熒光標(biāo)記，分別在細(xì)胞球和動(dòng)物模型層面通過(guò)熒光成像分析，直接觀測(cè)到環(huán)肽的細(xì)胞穿透和BBB運(yùn)輸能力（圖5A）。另一方面，利用BBB轉(zhuǎn)運(yùn)多肽可使熒光試劑靶向轉(zhuǎn)運(yùn)與高效富集到腦組織，對(duì)生理病理過(guò)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 Cai等[67]利用聚集誘導(dǎo)發(fā)光染料（Aggregation induced emission， AIE）信號(hào)可控、 可提高檢測(cè)的靈敏度和信噪比的特點(diǎn)，以靶向多肽為識(shí)別元件，構(gòu)建了多肽功能化的AIE自組裝納米材料，實(shí)現(xiàn)了腦部腫瘤的熒光原位成像檢測(cè)，準(zhǔn)確鑒別出了病變組織的邊界，在疾病診療中具有廣闊的應(yīng)用前景。

將具有不同目標(biāo)靶向的多肽組裝于一個(gè)體系可提高轉(zhuǎn)運(yùn)的特異性，從而用于特定生理病理現(xiàn)象的高選擇性成像分析。Zhao等[68]將分別靶向TfR和缺血的多肽修飾于脂質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)多肽修飾可增加腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞（BCEC cells）對(duì)脂質(zhì)體的攝入; 對(duì)雙靶向多肽修飾的脂質(zhì)體進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用ex vivo熒光成像觀測(cè)到雙靶向多肽修飾的脂質(zhì)體在大腦缺血區(qū)域的特異性富集，實(shí)現(xiàn)了高特異性的主動(dòng)運(yùn)輸。最近，Israel等[69]將4種具有不同靶向的多肽以排列組合的方式組裝到可生物降解的聚合物（P）納米顆粒表面，P骨架修飾羅丹明（rh）熒光分子后，通過(guò)光學(xué)成像的方式考察不同多肽修飾的P對(duì)BBB的穿透能力、在不同腦區(qū)的生物分布以及動(dòng)力學(xué)過(guò)程。他們發(fā)現(xiàn)修飾有BBB轉(zhuǎn)運(yùn)肽AP2和內(nèi)涵體逃逸肽的P/LLL/AP2/rh在尾靜脈注射30 min后，在皮質(zhì)層、中腦丘和海馬區(qū)的薄壁組織中聚集并產(chǎn)生顯著的熒光。進(jìn)一步的研究表明，P/LLL/AP2/rh中AP2發(fā)揮了BBB高效的穿透作用，LLL則起到穩(wěn)定聚合物納米組裝體的作用。這種雙功能多肽的靶向組裝體在腦神經(jīng)系統(tǒng)的成像和神經(jīng)障礙分子機(jī)制解析中具有良好的應(yīng)用前景。

除了小分子外，BBB轉(zhuǎn)運(yùn)肽在納米顆粒和生物大分子的運(yùn)載方面也有優(yōu)異表現(xiàn)。兼具TfR靶向和抗生物降解能力的多肽在與量子點(diǎn)（Quantum dots， QDs）偶聯(lián)后，可將納米尺寸的QDs運(yùn)至腦實(shí)質(zhì)。利用活體雙光子成像分析，觀測(cè)到無(wú)多肽修飾的“裸露QDs”被滯留在腦毛細(xì)血管內(nèi)，而修飾多肽QDs則可滲透毛細(xì)血管進(jìn)入大腦，顯示出主動(dòng)運(yùn)輸能力（圖5B）[70]。Lim等[71]從天然蛋白質(zhì)中獲得了新型多肽dNP2，利用熒光成像分析考察了dNP2的細(xì)胞和BBB穿透能力，繼而以dNP2為靶向元件運(yùn)載功能蛋白質(zhì)，顯示出在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病診療中的應(yīng)用價(jià)值（圖5C）。

5?總結(jié)與展望

靶向多肽在“血”和“腦”之間架起一座橋梁，使熒光分子、顯影試劑、納米材料等跨越屏障，將不可見(jiàn)、不可知的分子事件和生理過(guò)程轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)的信號(hào)，為腦神經(jīng)分析化學(xué)的發(fā)展和腦科學(xué)的深入研究提供了新工具和新技術(shù)。在得到長(zhǎng)足發(fā)展的同時(shí)，隨著對(duì)大腦認(rèn)識(shí)和轉(zhuǎn)運(yùn)肽研究的深入，已有的靶標(biāo)受體和多肽也不斷面臨新的挑戰(zhàn)。一些目前常用的受體分子，包括TfR、LDLR等，不僅在大腦內(nèi)皮細(xì)胞高表達(dá)，在外周病變組織也大量出現(xiàn)，降低了特異性，影響靶向多肽對(duì)BBB的高特異性定位分析。此外，多肽在具有高生物相容性的同時(shí)，也可能被機(jī)體內(nèi)的水解酶降解，因此，增加其生物穩(wěn)定性也是亟需解決的問(wèn)題，對(duì)于活體、原位、長(zhǎng)時(shí)程示蹤分析具有重要意義。

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Targeted Analysis of Central Nervous System Using

Blood?Brain Barrier Shuttle Peptides

HUANG Yan?Yan1，2， ZHAO Rui*1，2

1（Beijing National Laboratory for Molecular Sciences， CAS Key Laboratory of Analytical Chemistry for Living Biosystems，

Institute of Chemistry， Chinese Academy of Sciences， Beijing 100190， China）

2（University of Chinese Academy of Sciences， Beijing 100049， China）

Abstract?Targeted delivery of molecules and materials across blood?brain barrier （BBB） is critical for in?situ and real?time analysis of central nervous system， which is also a challenge for analytical chemistry. As a kind of endogenous bioactive species， peptides with modulate structure can be designed with predictable conformations and chemically synthesized with high efficiency and purity. Peptides can act as BBB shuttles to transport fluorescent dyes， contrast agents and nanomaterial to target tissues， providing new tools and analytical methods for brain science， disease detection and molecular mechanism investigation. This review summarizes recent advances in analytical applications of BBB shuttle peptides for studying central nervous system. Introduction on BBB， peptides as well as design and screening approaches of BBB shuttle peptides is also included.

Keywords?Blood?brain barrier; Peptide; Targeted analysis; Affinity screening; Review