氣體信號分子硫化氫的活體檢測方法研究進展

陳仲輝　陳宇　翁愛彬　羅芳　郭隆華　邱彬　林振宇　陳國南

摘?要?腦神經(jīng)相關的各種生理和病理過程需在眾多生理活性物質的共同參與下完成。硫化氫（H2S）作為第三類內源性氣體信號分子，在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理機能方面起重要的調節(jié)作用。因此，在活體層次實現(xiàn)H2S的精準定量分析，將極大推動人類揭秘腦神經(jīng)過程中的分子機制的研究進程。 然而，H2S具有較強的還原性和易揮發(fā)性，其物理化學性質與腦內含巰基化合物相似，實現(xiàn)H2S的高選擇性的分離分析成為其檢測的關鍵科學問題。本文綜述了近年來各類型H2S檢測方法的設計原理及研究進展，對相關研究的發(fā)展前景進行了展望。

關鍵詞?硫化氫; 活體檢測方法; 評述

1?引 言

腦神經(jīng)系統(tǒng)在進行信息傳遞時，需要諸多化學物質參與。氣體信號分子是生命體中具有重要生理功能的內源性氣體小分子的統(tǒng)稱，其分子量小、持續(xù)產生，且產生和代謝過程均由酶進行調節(jié)。該類物質主要以自由擴散的形式進出細胞膜，且擴散速度快、無需特異性受體轉運。H2S作為氣體信號分子，在胞內合成并參與細胞間的信息傳遞[1]。內源性H2S主要通過以下3種酶催化產生： 胱硫醚?β?合酶（CBS）、胱硫醚?γ?裂解酶（CSE）和3?巰基?硫酸轉移酶（3?MST）[2]。內源性H2S在腦神經(jīng)的生理和病理過程中具有極其重要作用。 首先，H2S作為神經(jīng)調節(jié)劑，可調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳遞和心血管系統(tǒng)的平滑肌松弛等過程[3～7]; 其次，H2S可作為神經(jīng)保護劑，清除體內過量的活性氧物質，減弱對機體的氧化損傷，以及神經(jīng)退行性病變和心肌損傷過程而引發(fā)的細胞凋亡[8～10]。因此，開展面向活體的H2S檢測對于深入理解生命體的生理功能及疾病的致病機理具有重要意義。本文對近年來H2S檢測方法的設計原理及研究的進展進行了總結，對該領域未來的發(fā)展前景進行了展望。

2?H2S檢測方法

由于腦神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境極其復雜，含有神經(jīng)遞質、神經(jīng)調質、能量代謝物質、抗氧化物質和大分子蛋白質等，探究腦內內源性H2S的生理和病理作用很大程度依賴于H2S檢測方法的適用性。H2S的檢測方法在近十年來取得了極大進展。 本文對可視化分析、熒光分析、電化學分析及化學發(fā)光分析4種類型的H2S檢測方法進行歸納總結，著重概述各方法的設計理念、檢測機制及其應用前景。

2.1?基于可視化分析的H2S檢測方法

以光學響應信號為基礎的可視化檢測方法通過裸眼辨識反應前后溶液顏色＼，種類的變化實現(xiàn)對H2S的半定量檢測，可進一步采用光度計讀取溶液吸光度的變化情況對其進行定量測定。該方法具有操作簡單快捷、檢測成本相對較低和信號輸出可視化等特點。目前，根據(jù)溶液的顏色變化情況大致可分為單色、雙色和多色變化3種類型。

基于亞甲基藍顯色反應檢測的H2S方法具有悠久歷史。 該方法首先在樣品中加入硫化物的捕獲劑乙酸鋅，隨后，在上述提取物中加入N，N?二甲基對苯二胺硫酸鹽，并在FeCl3的作用下生成亞甲基藍; 通過測量亞甲基藍的吸光度，實現(xiàn)對H2S的定量檢測。該方法檢測H2S或者硫化物的濃度范圍約1～1000 μmol/L，且偏差小于3%[11]。為進一步提高H2S可視化檢測方法的靈敏度，Tang等[12]利用鋱離子?G四鏈體?血紅素（Tb/G4?hemin）與具有催化活性的脫氧核酶（DNAzyme）形成過氧化物模擬酶，可催化H2O2氧化2，2'?聯(lián)氮?雙?3?乙基苯并噻唑啉?6?磺酸（ABTS）產生綠色oxABTS的性質，開發(fā)了一種檢測H2S的比色傳感器。由于Ag+可改變Tb/G4?hemin DNAzyme模擬酶的結構，導致其催化活性降低。而H2S能與Ag+競爭性結合，使得Tb/G4?hemin DNAzyme催化ABTS的活性逐漸增強，通過檢測oxABTS的可見光吸收峰強度實現(xiàn)對H2S的定量檢測。該方法對H2S濃度響應的線性范圍為20 nmol/L～2 μmol/L，檢出限為13 nmol/L; 與其它的單色H2S可視化分析檢測方法相比，具有較高的靈敏度。

近年來，貴金屬納米粒子常被用于可視化檢測方法中?；谫F金屬納米粒子的可視化檢測方法是根據(jù)其聚集或解聚集程度不同導致溶液產生明顯的顏色差異，實現(xiàn)對目標物的可視化分析檢測。Yuan等[13]構建了一種硫代疊氮衍生物和活性酯功能化的金納米粒子（AE?Au NPs）化學傳感器。如圖1A所示，該傳感器利用金納米顆粒（Au NPs）局域表面等離子體共振（LSPR）的特性，其在均相溶液中呈現(xiàn)出紅色，在聚集態(tài)時，溶液的顏色變?yōu)樗{色，即顏色變化鮮明，可通過裸眼區(qū)分4 μmol/L H2S，初步實現(xiàn)對H2S的半定量檢測。Zhang等[14]基于Au NPs反聚集原理構建了一種可視化快速檢測H2S氣體的方法。Au NPs在高鹽緩沖液中容易發(fā)生聚集，導致溶液變成藍色。該傳感器采用鼓泡的方式將H2S與Au NPs通過AuS鍵的形式結合，保證Au NPs均勻、穩(wěn)定地分散在含有80 mmol/L NaCl的Tris緩沖液。該方法靈敏度高，實現(xiàn)了H2S的雙色可視化檢測。

為進一步提高H2S可視化檢測的視覺靈敏度，研究人員通過調控貴金屬納米顆粒的形貌以改變其LSPR效應，進而使溶液產生更為豐富的顏色變化。3，3'，5，5'?四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色底物在傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附反應中，具有顯色結果穩(wěn)定的優(yōu)點。本課題組首次發(fā)現(xiàn)顯色反應產物TMB2+可對金納米棒（Au NRs）產生氧化刻蝕，使Au NRs長徑比發(fā)生改變，繼而溶液展現(xiàn)出豐富多彩的顏色變化[15]。基于上述原理，采用辣根過氧化物酶（HRP）捕獲樣品中的H2S，引發(fā)HRP活性發(fā)生變化，導致HRP催化H2O2?TMB顯色液在相同的時間內產生不同濃度的TMB2+; 當加入Au NRs時，不同濃度的TMB2+對Au NRs可發(fā)生不同程度的刻蝕，實現(xiàn)了H2S的多色彩可視化檢測，如圖1B所示。 該方法成功應用于鼠腦內不同腦區(qū)微透析液中H2S濃度的可視化檢測。

2.2?基于熒光探針技術的H2S檢測方法

可視化檢測方法通常用于檢測離體的血清、組織勻漿或微透析液中的H2S濃度，檢測前需要對樣品進行預處理，如血清蛋白分離、組織研磨和細胞破碎等步驟。熒光探針可實現(xiàn)對目標物幾乎無損且高時間分辨的檢測，為細胞或活體層次上H2S的定量分析提供了有效途徑。近年來，H2S熒光探針在設計、合成、作用機理探究以及在生命科學中的應用等方面發(fā)展迅速。根據(jù)熒光探針與H2S識別機理大致可以分為3種：（1）基于H2S的還原性，將探針中疊氮基團還原為氨基; （2）H2S與熒光探針發(fā)生親核加成反應; （3）H2S與熒光探針中的金屬配體的配位結合。

2.2.1?基于H2S的還原性原理構建的熒光分析方法?有機疊氮化合物作為生物正交官能團被廣泛用于化學生物學領域。該類熒光探針可通過含胺類熒光分子上修飾疊氮基團獲取，其合成途徑相對簡單，具有良好的細胞相容性。H2S可將探針中的疊氮基團還原成氨基，引發(fā)探針中電子密度發(fā)生變化，導致探針的熒光信號發(fā)生變化，進而實現(xiàn)H2S的定量分析。Lippert等[16]首次報道了基于羅丹明基的疊氮化合物熒光探針用于胞內H2S的定量分析; 并進一步對其官能團進行優(yōu)化，實現(xiàn)了血管內表皮生長因子刺激靜脈內皮細胞產生的內源性H2S的熒光成像。該類型的熒光探針為研究生命體系中的H2S提供了新思路?；诖耍絹碓蕉嗟幕诏B氮基團的熒光探針被不斷設計合成，如香豆素類[17]、2?（2?氨基苯基）苯并噻唑類[18]、7?硝基苯并?2?氧代?1，3?二唑類[19]、二氰甲基二氫呋喃類[20]和間苯二甲酸類[21]等。

為進一步提高設計合成的熒光探針對H2S的特異性識別能力，減少外部環(huán)境、檢測底物和光漂白等因素的影響，研究人員基于疊氮化合物和氨基之間的電子差異，構建了用于H2S檢測的比率型熒光探針。比率型熒光探針是以兩個不同發(fā)射波長的熒光強度比值作為目標物定量信號。光源強度和儀器靈敏度等相對固定的干擾因素對比率熒光探針的影響較小，使得探針檢測靈敏度、選擇性和線性范圍有所提高。比率型熒光探針包含三部分：對目標物響應的熒光基團、參比熒光基團和上述二者的連接基團。Yu等[22]構建了一種熒光共振能量轉移的比率型熒光探針用于血清中H2S檢測，該探針中的碳量子點既是能量的給體也是探針的定位點，其檢出限為10 nmol/L。Wan等[23]合成了基于甲酚紫的H2S比率型熒光探針，實現(xiàn)了MCF?7細胞和斑馬魚中的H2S熒光成像，如圖2A所示。該探針有望用于監(jiān)測腦神經(jīng)系統(tǒng)中H2S的生理作用。為進一步解決熒光探針自淬滅現(xiàn)象，即探針聚集引發(fā)信號淬滅對檢測信號的準確性帶來的影響，Zhang等[24]將兩親性嵌段聚合物和疊氮改性的聚集誘導熒光（AIE）材料通過共沉淀的方式得到聚集誘導熒光量子點（AIE Ds）。該聚合物量子點具有優(yōu)良的AIE性能和較大的Stock位移（約150 nm），大大降低了自淬滅現(xiàn)象。該量子點具備良好的水分散性和穩(wěn)定性（>15周），可準確區(qū)分出H2S與其它硫醇化合物，并成功實現(xiàn)了胞內溶酶體中內源性H2S熒光成像（圖2B）。

2.2.2?基于H2S與探針發(fā)生親核加成反應構建的熒光分析方法?H2S是一種優(yōu)良的親核試劑，在生理pH條件下主要以HS的形式存在。因此，與腦神經(jīng)系統(tǒng)中的其它硫醇物質相比，H2S具有更高的親核性。H2S參與的親核反應主要包含兩類：芳基硝基的硫解和共軛體系的破壞; H2S解離產生的HS?可與探針的親電基團發(fā)生親核加成反應[25，26]?；谠撛恚琇i等[25]采用（2，4?二硝基苯氧基）酪氨酸（DNPTYR）功能化的石墨烯量子點（GQDs）合成了H2S觸發(fā)的信號增強型熒光探針，如圖3A所示。DNPTYR中含有二硝基苯氧基，可通過光致電子轉移效應猝滅GQDs的發(fā)光信號; 樣品中的H2S可引發(fā)二硝基苯氧基發(fā)生重排，破壞光致電子轉移效應，進而恢復熒光信號。該熒光探針對H2S響應時間短，實現(xiàn)了應激環(huán)境下胞內H2S含量的實時動態(tài)監(jiān)測。Chen等[27]將花青素和香豆素熒光基團結合，構建了一種線粒體靶向探針CouMC，并成功用于生理病理模型下胞內H2S的定量分析檢測，如圖3B所示。Zhang等[28]合成了基于p?硝基芐基的比率熒光探針（RHP?2），其光穩(wěn)定性好，在不同樣品中，發(fā)射峰強度與H2S濃度均呈現(xiàn)良好的線性關系。該探針成功應用于抑郁模型下小鼠腦內海馬細胞的H2S濃度的實時監(jiān)測。為進一步提高熒光探針的生物相容性，Zhang等[26]基于AIE和激發(fā)態(tài)分子內質子轉移（ESIPT）原理，將疏水的AIE染料嵌入到脂質體中，合成了對H2S響應的AIE納米探針。該探針具有良好的細胞膜滲透性，成功用于斑馬魚體內的H2S成像。

2.2.3?基于H2S與金屬配體配位結合原理構建的熒光分析方法?基于金屬配體與H2S或硫化物配位結合的分析方法，也是一種經(jīng)典的H2S定量分析方法。如Cu2+通常在熒光探針中充當信號猝滅劑，H2S可與探針中的Cu2+形成穩(wěn)定的CuS沉淀（Ksp=8.0×1036），觸發(fā)探針的信號開關，產生強烈的熒光信號[29～32]。Sasakura等[33]合成了HSIP?1熒光探針，該探針利用氮雜環(huán)Cu2+對探針的熒光強度進行調控，當樣品中存在H2S時，探針中的Cu2+與H2S反應產生CuS，進而增強熒光信號。Yue等[34]利用選擇性識別Cu2+的DNAzyme與熒光標記技術構建了一種高特異性識別H2S的熒光傳感器。DNAzyme基底鏈和DNAzyme分別用熒光基團與猝滅基團標記，當二者通過堿基互補配對相互靠近時，熒光信號猝滅。當樣品中不含有H2S時，Cu2+引發(fā)DNAzyme基底鏈裂解，并產生熒光信號; 當樣品中含有H2S時，Cu2+與H2S反應產生CuS沉淀，觸發(fā)DNAzyme基底鏈裂解能力減弱，熒光信號逐漸減弱。 Wang等[35]合成了基于碳量子點（CQDs）與銀納米粒子（Ag NPs）納米復合物熒光探針用于鼠腦微透析液中H2S的定量檢測，如圖4A所示。CQDs與Ag NPs之間形成AgN鍵，發(fā)生熒光共振能量轉移，導致CQDs熒光信號發(fā)生猝滅; 而樣品中的H2S則與Ag NPs形成比AgN鍵更穩(wěn)定的AgS鍵，CQDs熒光信號隨著H2S濃度的增加而逐漸增強。該方法具有較高的靈敏度，檢出限可達0.4 nmol/L，并成功用于大鼠腦缺血過程皮層H2S的定量檢測。

此外，貴金屬納米簇（NCs）也可用于檢測H2S或硫化物。Cui等[36]以牛血清白蛋白為模板，采用“一鍋法”合成了金納米簇（Au NCs），具有良好的水溶性、穩(wěn)定性和分散性。S2?可與Au NCs以AuS形式結合，猝滅Au NCs的熒光信號，因此可用于H2S的檢測，常見的陰離子對其檢測不產生干擾。Zhao研究組[37，38]利用Au NPs、谷胱甘肽（GSH）和熒光素（FITC）合成了Au NP?GSH?FITC熒光探針，如圖4B所示。該探針與在線液滴微流控芯片結合，可實時連續(xù)監(jiān)測微透析液中硫化物的變化情況，檢測的線性范圍為0.1～5.0 μmol/L，檢出限為50 nmol/L，探針與目標物反應時間小于2 min，實現(xiàn)了病理模型下鼠腦微透析液中H2S的連續(xù)檢測。

2.3?基于電化學傳感技術的H2S檢測方法

相較于可視化和熒光檢測方法，電化學方法具有靈敏度高、響應時間短、易于集成和微型化的優(yōu)點，H2S的電化學檢測常常通過合理調控傳感界面來實現(xiàn)。以硫化物離子選擇性電極為代表的電化學檢測方法已廣泛用于生物樣品中的硫化物的定量分析[39?41]。該方法是在堿性溶液中測定硫化物的濃度，易于操作且能夠動態(tài)檢測樣品中硫化物的濃度[42]。值得注意的是，在檢測過程中，樣品的pH值必須保持穩(wěn)定，并以此條件建立標準曲線。但該離子選擇性電極在檢測硫化物時，硫醇分子亦可與電極表面的Ag+/Ag2S結合，導致電極活性降低，再次使用前必須重新校準。

理想的H2S檢測方法應可用于生物樣品中的H2S或者硫化物的分析檢測，而不被基質中的眾多生物鹽或其它生理活性物質影響，同時能足夠靈敏地檢測出生理水平的H2S濃度。為克服硫離子選擇性電極在檢測生物樣品過程中頻繁校準的缺點，研究人員開發(fā)了硫化物極譜傳感器[43，44]。該極譜傳感器的陰、陽極及內充液與外界待測樣品之間通過一種聚合物薄膜隔開，內充液由K3[Fe（CN）6]和碳酸鹽緩沖液組成; 而H2S分子可自由穿過該聚合物薄膜，與內充液作用并產生信號輸出。樣品中的H2S可以向聚合物膜的另一側自由擴散，并在堿性溶液一側解離為HS或S2，同時將K3[Fe（CN）6]還原為K4[Fe（CN）6]，電子傳遞到陽極，進而產生電流信號。該傳感器背景電流低，從而具有較低的檢出限（～2 μmol/L）。

Dilgin等[45]探究了硫化物在槲皮素修飾石墨電極表面的電催化氧化行為。電化學表征結果表明，修飾電極對硫化物氧化具有明顯的電催化活性，硫化物的氧化電位由450 mV移至280 mV。Savizi等[46]采用殼聚糖/丙烯酰胺作為固定劑，將過氧化物酶固定在絲網(wǎng)印刷電極表面，制備了一種基于酶抑制的安培生物傳感器。該傳感器以氫醌作為電子傳遞介體，通過優(yōu)化基質用量、介質濃度和電解質pH值等實驗條件，實現(xiàn)了對H2S的高靈敏和高選擇性分析檢測。Qi等[47]構建了一種通過檢測硫化物進而檢測排硫桿菌活性的生物傳感器，并將其成功用于檢測細菌培養(yǎng)過程中硫化物代謝情況。Asif等[48]通過共沉淀法將碳納米管（CNT）與CuMn層狀雙氫氧化物（CuMn?LDH）進行復合， 形成CNTs@CuMn?LDH雜化納米材料，用于H2S的直接測定。CuMn?LDH負載在CNT骨架上， 增加了界面之間的相互作用力，進而提高電極表面的電子傳遞速率和氧化還原反應過程。該傳感器展現(xiàn)出對H2S良好的催化氧化性能，檢出限低至0.3 nmol/L，并將其用于監(jiān)測人黑色素瘤細胞株在血管內皮生長因子刺激下H2S實時變化情況。Wang等[49]發(fā)現(xiàn)，在中性環(huán)境中（pH=7.4），Ru（NH3）3+6可在較低電位下催化氧化含有HS和H2S的混合物。利用該原理，與活體微透析技術連用，實現(xiàn)了腦微透析液中H2S的在線監(jiān)測（見圖5A）。相較于其它方法，該方法實現(xiàn)了活體在線檢測，且不需要調節(jié)樣品的酸堿性即可對H2S進行實時監(jiān)測。此外，該課題組還設計合成了一種信號增強型釕銅配合物的電致化學發(fā)光（ECL）探針用于檢測鼠腦微透析液中的H2S含量[50]。釕銅配合物通過Nafion固定在玻碳電極表面，并將其置于密閉容器中與液態(tài)樣品揮發(fā)出的H2S發(fā)生反應，配合物中的銅離子被競爭出來，產生ECL信號，如圖5B所示。該方法首次將ECL技術用于鼠腦中H2S的檢測，并且有效地避免了腦內抗壞血酸等還原性物質對ECL信號的干擾。

2.4?基于化學發(fā)光探針技術的H2S檢測方法

化學發(fā)光是指化學反應過程產生的光發(fā)射的現(xiàn)象。發(fā)光探針吸收反應過程中所產生的化學能，使探針分子或中間態(tài)分子的電子躍遷到激發(fā)態(tài)，當電子從激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)時，以發(fā)射光子的形態(tài)釋放出能量。Bailey等[51]首次開發(fā)了一種基于魯米諾的疊氮衍生物的化學發(fā)光探針用于檢測H2S，（圖6A），并將其用于監(jiān)測CSE酶促反應過程中H2S濃度的變化。Ke等[52]合成了一種生物化學發(fā)光探針，以疊氮基團與H2S互相作用為基礎，探針對H2S表現(xiàn)出明顯的化學發(fā)光增強的效果，具有較高的靈敏度和選擇性（圖6B）。該生物發(fā)光探針成功應用于細胞和動物成像，為了解各種生理和病理過程H2S的變化提供了新的策略。本課題組采用傳統(tǒng)的HRP催化魯米諾?H2O2化學發(fā)光體系構建了H2S化學發(fā)光檢測新方法[53]。由于H2S可抑制HRP的活性，降低催化魯米諾?H2O2的化學發(fā)光信號，基于此實現(xiàn)H2S的定量檢測，并成功用于鼠腦微透析液中H2S濃度的測定。

3?總結與展望

發(fā)展H2S檢測方法對進一步揭開其生理學、病理學和治療學等方面的功能具有重要意義。本文對多種類型的H2S活體檢測新方法進行分析和總結，如可視化、熒光、電化學和化學發(fā)光等，其在實際應用中均展現(xiàn)出良好的潛力。然而， H2S檢測新方法也面臨著一些挑戰(zhàn)。總之，H2S檢測新方法研究需要在檢測的新原理構建方面繼續(xù)深入，以滿足日益增長的腦神經(jīng)化學基礎研究和相關疾病的診斷與治療的需求。

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51?Bailey T， Pluth M. J. Am. Chem. Soc.， ?2013， ?135（44）： 16697-16704

52?Ke B， Wu W， Liu W， Liang H， Gong D， Hu X， Li M. Anal. Chem.， ?2016， ?88（1）： 592-595

53?Fang Z， Yue G， Wang J， Luo F， Guo L， Qiu B， Lin Z. Anal. Methods， ?2019， ?11（24）： 3085-3089

Research Progress of in Vivo Detection Methods

for Gasotransmitter Hydrogen Sulfide

CHEN Zhong?Hui1，2， CHEN Yu1， WENG Ai?Bin1， LUO Fang2， GUO Long?Hua2，

QIU Bin2， LIN Zhen?Yu*2， CHEN Guo?Nan2

1（The Affiliated Hospital of Putian University， Putian University， Putian 351100， China）

2（Ministry of Education Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety，

Department of Chemistry， Fuzhou University， Fuzhou 350116， China）

Abstract?The quantitative analysis for neurochemistry in living biosystems has drawn extensive attention， because the physiological active substance participates in the transmission of information and relates to physiology and pathology in the brain. Hydrogen sulfide （H2S）， as the third gasotransmitter， plays a significant role in the neurophysiology and neuropathology in brain. In vivo detection of H2S will greatly promote the molecular mechanism in the physiology and pathology process. However， H2S have strong reducibility and volatility， and its properties are similar to those of sulfhydryl compounds in the brain. Therefore， selective separation and recognition of H2S from sulfhydryl compounds in the brain is the key scientific issue in the detection of H2S. Herein， the design principle and research progress of various types of H2S detection methods in recent year were reviewed， and an outlook for the future of H2S detection method was propected.

Keywords?Hydrogen sulfide; In vivo detection methods; Review