外源一氧化氮對鉻脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響

閆志強(qiáng)，陳銀萍，余沛東，師小平，頡海帆，丁浚剛

(蘭州交通大學(xué)環(huán)境與市政工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070)

【研究意義】鉻(Cr)的毒性與其存在的價(jià)態(tài)有關(guān)，在生態(tài)環(huán)境中，Cr(Ⅵ)比Cr(Ⅲ)毒性高100倍，相比于Cr(Ⅲ)，Cr(Ⅵ)具有化學(xué)活性強(qiáng)、移動(dòng)性大、生物毒性強(qiáng)且持久，易被植物吸收等特點(diǎn)，不僅能在作物體內(nèi)殘留，影響作物的正常生長，導(dǎo)致糧食減產(chǎn)[1-3]，而且還能通過食物鏈進(jìn)入人體從而危害人類健康[4]。近年來，隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，Cr在工農(nóng)業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用，但由于大量的含Cr“三廢”不合理的排放，導(dǎo)致土壤受Cr嚴(yán)重污染，生態(tài)環(huán)境急劇惡化[5]。因此，土壤Cr污染的治理已迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】一氧化氮(Nitric oxide, NO)是植物體中一種氧化還原信號分子，參與調(diào)節(jié)植物各種生理過程，具有保護(hù)細(xì)胞和緩解毒害的雙重效用[6]，適量的NO能夠作為抗氧化劑，通過清除活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)并誘導(dǎo)抗氧化酶基因的表達(dá)，來增強(qiáng)植物對逆境脅迫的抗性[7-8]。有研究表明，NO也參與植物對各種重金屬脅迫的信號應(yīng)答[9]。硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)作為一種外源NO供體能減輕Cd、Pb脅迫對羽扇豆(Lupinusmicranthus)根生長的抑制作用[10]，提高水稻(Oryzasativa)對Cd[11]和甘菊(Chrysanthemumlavandulifolium)對Mn[12]的耐受性，緩解重金屬對其的毒害作用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】娃娃菜(Brassicapekinensis)具有口感嫩脆、高產(chǎn)、抗病、適應(yīng)性廣、耐貯運(yùn)等優(yōu)良特性，是國內(nèi)在高海拔灌溉農(nóng)業(yè)區(qū)生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)蔬菜[13]，特別是當(dāng)我國長江以南地區(qū)在6-9月蔬菜產(chǎn)量低時(shí)，能夠高產(chǎn)供應(yīng)以緩解其困境。我國關(guān)于娃娃菜的研究多數(shù)集中在優(yōu)化高產(chǎn)栽培技術(shù)和防治病蟲害方面上[14-15]，鮮有關(guān)于Cr污染對娃娃菜的生長發(fā)育影響的報(bào)道，而關(guān)于NO對Cr抑制娃娃菜生長發(fā)育的研究更為少見?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本實(shí)驗(yàn)以娃娃菜為實(shí)驗(yàn)材料，采用不同濃度的SNP對Cr脅迫下娃娃菜種子及幼苗進(jìn)行處理，分析外源NO對Cr脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)和幼苗膜脂過氧化、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶活性的影響，旨在探索調(diào)節(jié)外源NO水平對緩解Cr脅迫下娃娃菜萌發(fā)生長的作用機(jī)理，以期為深入研究緩解Cr對作物毒害方面提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料為購于甘肅省農(nóng)科院的‘韓國二號娃娃菜’。NO供體硝普鈉(亞硝基鐵氰化鈉，sodium nitroprusside，SNP，購自 Sigma 公司)，現(xiàn)用現(xiàn)配，通常0.15 μmol·L-1SNP可以產(chǎn)生小于0.2 μmol·L-1的NO[16]。配置Hoagland營養(yǎng)液為母液。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 發(fā)芽試驗(yàn) 選取籽粒飽滿整齊一致且無病蟲傷害的種子洗凈種外包衣，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的NaClO消毒10 min，然后再用蒸餾水沖洗數(shù)次，吸干種子表面水分后播于鋪有一層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中擺放35顆。以Hoagland營養(yǎng)液為母液，設(shè)置6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，均施加50 μmol·L-1的K2Cr2O7模擬Cr脅迫，每組分別施加 0、50、100、200、500、1000 μmol·L-1的SNP(Cr，Cr+50，Cr+100，Cr+200，Cr+500，Cr+1000)，以Cr0+SNP0為空白對照組(CK)組，共7組每組3個(gè)重復(fù)。然后在溫度為25 ℃，光照時(shí)間12 h/d的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每天定時(shí)加處理液并更換濾紙，連續(xù)培養(yǎng)7 d，每24 h觀察發(fā)芽數(shù)。第8天時(shí)，以芽長超過1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢，發(fā)芽指數(shù)，并測其胚根長和胚芽長，胚芽鮮重，胚根鮮重，胚芽干重，胚根干重。

1.2.2 盆栽試驗(yàn) 將營養(yǎng)土，沙子，黃土以1∶1∶1的比例混合，裝入直徑為15 cm的花盆中，每個(gè)盆中裝入1.5 kg，然后將沖洗干凈的種子均勻地灑在花盆中，每個(gè)盆中大約50顆左右，定期澆水，1周后設(shè)置7組實(shí)驗(yàn)組(CK，Cr，Cr+50，Cr+100，Cr+200，Cr+500，Cr+1000)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，連續(xù)處理7 d。待幼苗3片真葉完全展平時(shí)，取葉片測定葉綠素(Chl)含量，丙二醛(MDA)含量，游離脯氨酸(Pro)含量，過氧化氫酶(CAT)活性，超氧化物酶(SOD)活性以及電導(dǎo)率(REC)。

1.3 測試方法

1.3.1 發(fā)芽率測定 以芽長超過1 mm為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，以根數(shù)發(fā)出3個(gè)以上為發(fā)根標(biāo)準(zhǔn)，并測其培根長和胚芽長。每天記錄發(fā)芽數(shù)，發(fā)根數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)。

發(fā)芽率=培養(yǎng)結(jié)束時(shí)種子萌發(fā)數(shù)÷供試種子數(shù)×100 %

發(fā)芽勢=培養(yǎng)第4天時(shí)種子萌發(fā)數(shù)÷供試種子數(shù)×100 %

發(fā)芽指數(shù)=∑(第n天種子凈萌發(fā)數(shù)/萌發(fā)天數(shù))

活力指數(shù)=第n天胚根及胚軸的總長度×發(fā)芽指數(shù)

1.3.2 生理生化指標(biāo)的測定 采用丙酮提取液法測定葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)和類胡蘿卜素(Car)的含量[17]，硫代巴比妥酸法測定MDA含量[18]，酸性茚三酮比色法測定游離Pro含量[17]；硫代巴比妥酸法測定CAT活性[19]，氮藍(lán)四唑(NBT)法測定SOD活性[20]，電導(dǎo)率儀法測定REC[18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2007 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析計(jì)算；SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差檢驗(yàn)和最小顯著性差異法檢驗(yàn)，顯著性水平為α=0.05；用OriginPro 9.0作圖。

表1 不同濃度SNP對Cr脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)的影響

注：同列中不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Note: Different capital letters in the same column meant significant difference at 0.05 level. The same as below.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對Cr脅迫下娃娃菜種子萌發(fā)的影響

Cr脅迫下娃娃菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)與CK相比顯著降低，分別降低了15.8 %、18.7 %和27.1 %，發(fā)芽指數(shù)與CK對比也降低了12.1 %(P<0.05)，說明Cr脅迫下娃娃菜種子的萌發(fā)受到了抑制。使用不同濃度SNP處理Cr脅迫下娃娃菜種子，隨SNP濃度的增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)的整體趨勢表現(xiàn)為先升高后降低。與Cr脅迫下種子萌發(fā)情況相比，SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)顯著升高，分別升高了14.1 %、21.8 %和29 %(P<0.05)，而發(fā)芽指數(shù)高了7.8 %。但是，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)升高時(shí)，娃娃菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)開始顯著降低(表1)。單因素方差分析可知，Cr與SNP均能對娃娃菜種子的萌發(fā)產(chǎn)生顯著的影響，而一定濃度的SNP能緩解Cr對娃娃菜種子萌發(fā)的抑制作用，其中在SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)，緩解效果最為顯著。

2.2 外源NO對Cr脅迫下娃娃菜幼苗生長的影響

50 μmol·L-1Cr脅迫使娃娃菜幼苗的胚芽和胚根的長度、鮮重與干重對比CK均顯著降低(P<0.05)，分別降低了25 %和33.5 %、27 %和3.1 %與4.4 %和3.2 %。不同濃度SNP處理均能促進(jìn)Cr脅迫下娃娃菜幼苗的生長，當(dāng)SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)，幼苗的胚芽長、胚根長、胚芽鮮重、胚芽干重和胚根干重均有顯著升高(P<0.05)，對比Cr脅迫下未加SNP的處理組分別提高了31.5 %、35.6 %、35 %、4.4 %和2.2 %(表2)。但隨著SNP濃度的升高，對幼苗生長的促進(jìn)效果開始減緩。單因素方差分析顯示，一定濃度的SNP能夠緩解Cr對幼苗的脅迫作用，當(dāng)SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)，緩解脅迫的效果最為顯著。

2.3 外源NO對Cr脅迫下娃娃菜幼苗生理特性的影響

2.3.1 SNP對Cr脅迫下娃娃菜幼苗葉片葉綠素含量的影響 與CK相比，Cr脅迫下娃娃菜中Chla、Chlb、Car和Chl總量顯著降低(P<0.05)，分別降低了14.6 %、12.0 %、14.0 %和10.1 %。施加不同濃度SNP能增加Chl含量，其中當(dāng)SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)，較Cr脅迫下未施加SNP處理組Chla、Chlb、Car和Chl總量分別增加了36.3 %、30.2 %、29.3 %和34.8 %(P<0.05)。隨SNP濃度進(jìn)一步增加Chl含量不再增加，反而開始呈現(xiàn)下降的趨勢，但仍高于Cr脅迫下未施加SNP處理組，表明添加不同濃度SNP均能增加Cr脅迫下娃娃菜幼苗Chl含量，其中SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)Chl含量增加最顯著(圖1)。

表2 不同濃度SNP對Cr脅迫下娃娃菜幼苗生長的影響

圖1 不同濃度SNP對Cr脅迫下娃娃菜幼苗葉綠素含量的影響

2.3.2 外源NO對Cd脅迫下娃娃菜幼苗葉片MDA含量和REC的影響 Cr脅迫下，娃娃菜幼苗的MDA含量和REC均顯著增加(P<0.05)，對比CK分別增加了136.0 %和122.4 %。施加不同濃度SNP均可不同程度地降低MDA含量和REC，其中，當(dāng)SNP濃度為200 μmol·L-1時(shí)，降低效果最顯著(P<0.05)，相比Cr脅迫下未施加SNP處理組分別降低了49.7 %和34.4 %。但是，當(dāng)SNP濃度繼續(xù)增加時(shí)，MDA含量與REC反而開始呈現(xiàn)增加趨勢(圖2)。

2.3.3 外源NO對Cd脅迫下娃娃菜幼苗葉片SOD和CAT活性的影響 Cr脅迫下娃娃菜幼苗中抗氧化酶活性均有升高，但與CK相比并無顯著性變化(P>0.05)。施加不同濃度SNP均能增加SOD和CAT活性，其中，200 μmol·L-1SNP能顯著提高SOD和CAT活性(P<0.05)，對比Cr脅迫下未施加SNP的處理組分別升高了25.6 %和64.9 %。但是，隨著SNP濃度的進(jìn)一步升高，SOD與CAT活性呈現(xiàn)出降低的趨勢(圖3)。

2.3.4 外源NO對Cr脅迫下娃娃菜幼苗葉片滲透Pro含量的影響 Cr脅迫下娃娃菜幼苗中的Pro含量有所增加，但對比CK增加不顯著(P>0.05)。施加不同濃度SNP后，Pro含量均有增加，其中施加200 μmol·L-1SNP使Pro含量增加最顯著，對比Cr脅迫而未施加SNP的處理組，增加了118.5 %(P<0.05)，而隨著SNP濃度的增加， Pro含量呈現(xiàn)降低的趨勢(圖4)。

圖2 不同濃度SNP對Cr脅迫下娃娃菜幼苗葉片MDA含量(A)和REC(B)的影響

圖3 不同濃度SNP對Cr脅迫下娃娃菜幼苗葉片SOD(A)和CAT(B)活性的影響

圖4 NO對Cd脅迫下娃娃菜幼苗葉片Pro含量的影響

3 討 論

Cr(Ⅵ)作為工業(yè)的五毒之一，是一種毒性較大的致畸、致突變劑[21]，對動(dòng)植物的生長發(fā)育有極強(qiáng)的傷害。高濃度Cr抑制植物根細(xì)胞分化，阻礙水分吸收，從而導(dǎo)致植株矮小，葉片泛黃，葉面積明顯減少，生物量降低，對植物產(chǎn)生毒害作用；低濃度Cr促進(jìn)根、根毛生長，增加根中髓質(zhì)和外皮組織層的比例，促進(jìn)植物的生長[22-23]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，土壤中加入外源Cr后，娃娃菜種子的萌發(fā)和幼苗生長受到了顯著的抑制，幼苗葉片Chl含量降低，影響光合作用，進(jìn)一步影響幼苗的生長發(fā)育，MDA含量和REC均升高，說明Cr脅迫造成了膜脂過氧化加劇，對娃娃菜種子的萌發(fā)和幼苗生長有顯著的影響。

NO是在植物體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種生物活性分子，研究表明，其作為信號分子廣泛參與植物對各種逆境脅迫的應(yīng)答過程[24-25]。本研究中，不同濃度的SNP能緩解Cr對娃娃菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用，在施加SNP后，娃娃菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)以及胚芽和胚根的長度、鮮重和干重均有提高，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相似[26]。SNP能促進(jìn)種子萌發(fā)，可能是由于NO能提高蛋白酶和淀粉酶的活性，從而加速了種子內(nèi)大分子貯藏營養(yǎng)物質(zhì)降解為可吸收的小分子[27]。結(jié)果顯示，添加SNP能顯著提高Cr脅迫下娃娃菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)，說明SNP可以在一定程度上緩解Cr脅迫對種子萌發(fā)的抑制作用。

葉綠素是光合作用的主要色素，其含量的高低在一定程度上反映了植物光合作用的強(qiáng)弱，直接標(biāo)志著植物的生長能力。低濃度Cr脅迫促進(jìn)葉綠素合成，而高濃度則抑制葉綠素的合成[28-29]。本研究中，施加不同濃度的SNP使娃娃菜幼苗葉片的Chl含量，其中SNP濃度為100～200 μmol·L-1時(shí)，增加的效果最佳。Cr脅迫導(dǎo)致Chl含量的降低，可能是Cr的脅迫使葉綠素降解酶活性提高，加速了葉綠素的降解，導(dǎo)致葉綠素含量降低[30]，此外，Cr會(huì)引起植物體內(nèi)ROS積累[31]，過量的ROS會(huì)損傷細(xì)胞的膜系統(tǒng)，破壞葉綠體中類囊體結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致光合作用的場所受到嚴(yán)重?fù)p傷，從而阻礙了光合作用進(jìn)而影響植物的生長發(fā)育[32]。SNP對Cr脅迫的緩解作用可能是由于NO清除了部分ROS，緩解了Cr對葉綠體的膜結(jié)構(gòu)的毒害作用，提高了幼苗的光系統(tǒng)(Ⅱ)光化學(xué)轉(zhuǎn)換效率，提高了植物的潛在光合活性[31]，以及活化了葉綠素合成的相關(guān)酶類，提高了葉綠素的合成[33]，從而增加了有機(jī)物質(zhì)的積累，促進(jìn)幼苗的生長。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SNP能有效緩解Cr對植物的損傷，但是這種緩解作用與NO的濃度相關(guān)，適中濃度(100～200 μmol·L-1)的SNP處理能夠顯著地增加Chl的含量，降低MDA含量和REC，以及提高SOD、CAT活性和增加Pro的積累。但隨著SNP濃度的進(jìn)一步增大，對Chl、MDA、REC、SOD、CAT和Pro的影響并不顯著。這表明，SNP緩解Cr對娃娃菜脅迫的能力并不隨其濃度的增加而增加，且高濃度的NO對植物具有損傷性，這與陳銀萍等[31]和楊志娟等[39]的研究結(jié)果一致。有研究表明，低濃度的NO可以作為ROS清除劑緩解Cr對植物的脅迫作用，而高濃度的NO則可與ROS產(chǎn)生毒性更加劇烈的氧化物，如過氧亞硝酸(HOONO)，對細(xì)胞膜的損傷更嚴(yán)重。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)適中濃度(100～200 μmol·L-1)的SNP能夠有效的提高娃娃菜種子的萌發(fā)率、促進(jìn)胚芽和胚根的生長，而當(dāng)SNP濃度繼續(xù)升高時(shí)，種子的萌發(fā)率和胚芽、胚根的生物量開始呈現(xiàn)降低趨勢，這同樣證實(shí)了高濃度NO對植物具有脅迫作用。因此，只有最適的NO濃度才能在植物體內(nèi)起到最佳的生物學(xué)效應(yīng)，濃度過高或過低的NO都無法起到緩解氧化脅迫的作用。

4 結(jié) 論

Cr對娃娃菜種子的萌發(fā)、胚芽和胚根的生長均具有抑制作用，通過添加外源NO可以提高娃娃菜種子的萌發(fā)率、增加胚芽和胚根生物量、增加幼苗葉片中Chl含量、降低MDA含量和REC、提高抗氧化酶活性和增加Pro的積累量，清除幼苗中的ROS，緩解膜脂過氧化損傷，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，從而降低Cr對娃娃菜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用。此外，SNP的緩解作用又與其濃度有關(guān)，濃度為200 μmol·L-1的SNP緩解Cr對娃娃菜脅迫的能力最佳，過高或過低濃度的SNP緩解Cr脅迫的效果均不理想。