5種檢測(cè)化妝品中金黃色葡萄球菌方法的比較

陶明，王媛，郭琦，蔡克亞，趙高嶺

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450008； 2.鄭州安圖生物工程股份有限公司,河南 鄭州 450000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus)，有“嗜肉菌"的別稱，是革蘭陽(yáng)性菌的代表，可引起許多嚴(yán)重感染。美國(guó)疾病控制中心報(bào)告，由金黃色葡萄球菌引起的感染占第2位，僅次于大腸桿菌?；瘖y品中的金黃色葡萄球菌也是衛(wèi)生學(xué)檢驗(yàn)的重要致病菌指標(biāo)之一，檢驗(yàn)的依據(jù)為《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》(2015年版)中規(guī)定的培養(yǎng)法，鑒定主要依賴于菌落形態(tài)、染色特性、顯微鏡下形態(tài)特征、生化反應(yīng)以及選擇性培養(yǎng)基等，但這種傳統(tǒng)的鑒定方法繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)，同時(shí)也會(huì)受到培養(yǎng)時(shí)間以及檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)?zāi)芰Φ纫恍┤藶橐蛩氐挠绊?。選用合適的鑒定系統(tǒng)是提高實(shí)驗(yàn)室能力的重要保障。本實(shí)驗(yàn)室收到中國(guó)食品藥品檢定研究院組織NIFDC-PT-188 化妝品中金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)?zāi)芰︱?yàn)證盲樣2個(gè)：CODE1和CODE2,結(jié)合目前對(duì)微生物鑒定的常用手段[1-4]，本實(shí)驗(yàn)室采用VITEK2 Compact、杜邦BAX Q7、miniVIDAS、MALDI-TOF質(zhì)譜(Autof ms1000)、國(guó)標(biāo)法聯(lián)合檢測(cè)盲樣中是否存在金黃色葡萄球菌。最后建立本實(shí)驗(yàn)室藥品化妝品微生物聯(lián)合檢測(cè)程序，提高實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)能力。

1 材料

1.1 樣品

金黃色葡萄球菌盲樣CODE1和CODE2,由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器

BD240 恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)BINDER)；JY10002電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；ESCO生物安全柜(新加坡ESCO科技有限公司)；Yamato SQ810C 立式壓力蒸汽滅菌器(重慶雅馬拓科技有限公司)；VITEK 2 Compact 自動(dòng)微生物快速檢測(cè)分析系統(tǒng)(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)；杜邦BAX Q7、miniVIDAS(法國(guó)生物梅里埃股份有限公司)；Autof ms1000(安圖生物)。

1.3 菌種

微生物限度檢查法用標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；大腸埃希菌(Escherichiacoli) [CMCC(B)44102]，在中國(guó)食品藥品檢定研究院購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)室傳代保藏。

1.4 試劑

凍干兔血漿(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：6333802);REAL-TIME PCR AssayStaphylococcusaureu(美國(guó)杜邦，批號(hào)Q8114);VITEK2 CP、GN鑒定卡(法國(guó)梅里埃，批號(hào)：2420735203、2410627103)；VIDAS金黃色葡萄球菌測(cè)試試劑盒(法國(guó)梅里埃，批號(hào)：1006051870)。

1.5 培養(yǎng)基

SCDLP液體培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：6333802)；Baird-Parker瓊脂(鄭州貝瑞特，批號(hào)：0011916)；血平板(鄭州貝瑞特批號(hào)：0011916)；胰酪大豆胨瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，批號(hào)：J0167Y)；甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20170509)，以上培養(yǎng)基均進(jìn)行培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)合格后使用。

2 方法與結(jié)果

2.1 國(guó)標(biāo)法

2.1.1 樣品前處理 樣品的西林瓶在生物安全柜中打開，無菌操作向西林瓶中加入6 mL SCDLP,將樣品完全混勻，使其分散混懸，轉(zhuǎn)移到滅菌的試管中，然后再用SCDLP潤(rùn)洗西林瓶4次，每次1 mL，最終試管中SCDLP體積為10 mL。

2.1.2 增菌培養(yǎng) 上述稀釋液作為增菌液，于36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.3 分離培養(yǎng) 從上述增菌培養(yǎng)液中，取1環(huán)劃線接種在Baird Parker平板上，置36 ℃培養(yǎng)48 h。劃線接種血平板，置36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.4 純化培養(yǎng) 挑取疑似單個(gè)菌落在血瓊脂平板上，置36 ℃培養(yǎng)24 h。挑取血平板上疑似單個(gè)菌落在胰酪大豆胨瓊脂平板上進(jìn)一步純化，置36 ℃培養(yǎng)24 h。

2.1.5 染色鏡檢 挑取純化的可疑菌落，涂片，革蘭染色。

2.1.6 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn) 取上述分純的菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上加入高度為2～3 mm的滅菌液體石蠟，置36 ℃培養(yǎng)24 h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸溶液顏色變黃者為陽(yáng)性。

2.1.7 血漿凝固酶試驗(yàn) 取凍干兔血漿西林瓶，無菌操作加入0.5 mL生理鹽水，再加入疑似菌24 h肉湯培養(yǎng)物0.3 mL，混勻，置36 ℃培養(yǎng)箱中，每半小時(shí)觀察1次，6 h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽(yáng)性。

2.1.8 檢驗(yàn)結(jié)果報(bào)告 在上述選擇平板上有可疑菌落生長(zhǎng)，經(jīng)染色鏡檢，證明為革蘭陽(yáng)性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗(yàn)陽(yáng)性者，可報(bào)告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。結(jié)果見表1。CODE1在血平板上有白色圓形光滑，無溶血圈疑似菌落，鏡檢為革蘭陽(yáng)性球菌，甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陰性，所以判定未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2在血平板上有金黃色圓形光滑，周圍有溶血圈疑似菌落，鏡檢為革蘭陽(yáng)性球菌，甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)均為陽(yáng)性，所以判定檢出金黃色葡萄球菌。實(shí)驗(yàn)同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，陰性對(duì)照為陰性結(jié)果。

2.2 VITEK2 Compact鑒定

挑取“2.1.4”項(xiàng)下方法純化的單個(gè)菌落，鑒定根據(jù)菌落形態(tài)、革蘭染色結(jié)果，按照儀器說明書配置一定濃度的菌懸液，接種相應(yīng)的鑒定卡，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果見表2。CODE1中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鑒定結(jié)果分別為表皮葡萄球菌、泛菌屬、單核細(xì)胞增生李斯特菌，結(jié)論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用VITEK2 Compact鑒定結(jié)果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬，結(jié)論為檢出金黃色葡萄球菌。

2.3 杜邦BAX Q7鑒定

取“2.1.2”的增菌液5 μL，加入裂解液200 μL，55 ℃保持1 h，95 ℃保持10 min，立即冷卻5 min，取50 μL加入PCR管條中，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果見表3。杜邦BAX Q7鑒定結(jié)果：CODE1為“-”，即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”，即檢出金黃色葡萄球菌。同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為“+”，陰性對(duì)照結(jié)果為“-”。

2.4 miniVIDAS鑒定

儀器定標(biāo)后，取“2.1.2”的增菌液2 mL，使用水浴滅活，取0.5 mL加入試劑條第1個(gè)加樣孔，放入SPR管上機(jī)鑒定。結(jié)果見表3。miniVIDAS鑒定結(jié)果：CODE1為“-”，即未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2為“+”，即檢出金黃色葡萄球菌。同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為“陽(yáng)性”，陰性對(duì)照結(jié)果為“陰性”。

2.5 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定

安圖生物的全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)，型號(hào)：Autof ms1000。處理方法如下:在1.5 mL離心管中加入300 μL去離子水。取“2.1.4”項(xiàng)下純化的單個(gè)菌落于離心管中，充分振蕩混勻。加入900 μL無水乙醇，充分混勻。室溫離心2～4 min(轉(zhuǎn)速13 000 r/min)，倒去上清，再次離心，使用移液槍完全除去上清。37～40 ℃干燥沉淀2～5 min，至沉淀表面無明顯水跡。加入10 μL裂解液1，充分混勻。加入10 μL等體積的裂解液2，充分混勻。室溫離心2～4 min(轉(zhuǎn)速13 000 r/min)。吸取1 μL上清液，滴加到樣品靶上，晾干至樣品點(diǎn)無明顯水跡。取1 μL基質(zhì)溶液覆蓋在上述樣品點(diǎn)上，晾干至樣品點(diǎn)無水跡。上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果見表4。CODE1中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別為表皮葡萄球菌、阪崎克洛諾桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌，結(jié)論為未檢出金黃色葡萄球菌。CODE2中分離出疑似菌落1，非疑似菌落2和菌落3，利用MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果分別為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、沙門菌屬，結(jié)論為檢出金黃色葡萄球菌。

2.6 結(jié)果比較

國(guó)標(biāo)法的鑒定主要靠傳統(tǒng)的手工生化法，結(jié)果受人員的操作和判定有很大的影響。其他4種儀器法采用不同的原理對(duì)樣品進(jìn)行鑒定，大大縮短了檢出時(shí)間，減少了人為因素的影響，但需要儀器和試劑成本有所提高。5種方法的結(jié)果見表5，比較發(fā)現(xiàn)結(jié)果均一致。CODE1均未檢出金黃色葡萄球菌，CODE2均檢出金黃色葡萄球菌。

表1 國(guó)標(biāo)法試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of national standard method

注：陽(yáng)性對(duì)照為金黃色葡萄球菌，陰性對(duì)照為大腸埃希菌。

表2 VITEK2 Compact鑒定結(jié)果Table 2 Results of VITEK2 Compact

表3 杜邦BAX Q7和miniVIDAS鑒定結(jié)果Table 3 Results of BAX Q7 and miniVIDAS

注：陽(yáng)性對(duì)照為金黃色葡萄球菌，陰性對(duì)照為大腸埃希菌。

表4 MALDI-TOF質(zhì)譜鑒定結(jié)果Table 4 Results of MALDI-TOF MS

表5 5種鑒定方法結(jié)果Table 5 Results of five identification methods

3 討論

檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)能力是評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室能力重要條件[5]。為了加強(qiáng)藥品化妝品微生物檢測(cè)質(zhì)量的控制，提高本檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)微生物檢測(cè)能力，特進(jìn)行此次驗(yàn)證活動(dòng)。盲樣中除可能添加目標(biāo)菌金黃色葡萄球菌外，還會(huì)添加多種其他菌以干擾陽(yáng)性菌的檢出。各種細(xì)菌具有不同的酶系統(tǒng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，國(guó)標(biāo)法利用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬。由于許多不同種屬菌在相同選擇性培養(yǎng)基上有相似或相同的菌落形態(tài)，如試驗(yàn)中干擾菌與金黃色葡萄球菌在血平板上有極相似的形態(tài)，這就導(dǎo)致傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法非常依賴檢驗(yàn)人員經(jīng)驗(yàn)?zāi)芰Γ苋菀壮霈F(xiàn)漏檢、假陰性結(jié)果出現(xiàn)。并且傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法通常至少需要5～7 d時(shí)間，試驗(yàn)周期過長(zhǎng)。所以使用儀器進(jìn)行輔助有助于提高檢出率和結(jié)果的準(zhǔn)確性[6-10]。

為縮短試驗(yàn)時(shí)間，實(shí)現(xiàn)快速鑒定。越來越多的現(xiàn)代分子生物學(xué)手段和儀器運(yùn)用到了細(xì)菌種屬鑒定上。杜邦BAX Q7采用實(shí)時(shí)定量熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)微生物，miniVIDAS利用酶聯(lián)免疫的原理對(duì)微生物或毒素等進(jìn)行篩選檢測(cè)。兩種方法都是增菌后即可進(jìn)行檢測(cè)，30 h左右就可得到試驗(yàn)結(jié)果，大大縮短了試驗(yàn)周期，而且準(zhǔn)確率高，不容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

為滿足更多的工作需要，本實(shí)驗(yàn)室不僅僅停留在目標(biāo)菌檢出或未檢出的層面，而是有能力鑒定出樣品中篩選到的所有菌。上述3種鑒定手段顯然已經(jīng)不能滿足我們的需要。VITEK2 Compact和MALDI-TOF MS則能很好地解決這一問題。儀器法中VITEK2 Compact利用集成了眾多的生化試驗(yàn)的鑒定卡，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得出結(jié)論。MALDI-TOF MS是近年發(fā)展起來的一種軟電離技術(shù)，通過細(xì)菌的蛋白質(zhì)指紋圖譜與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知菌種的標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對(duì)，幾分鐘內(nèi)就可以完成鑒定。上述兩種方法都可鑒定出金黃色葡萄球菌和篩出的所有干擾菌種屬，通量高，準(zhǔn)確性好。但試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這兩種方法都依賴數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，由于各自公司數(shù)據(jù)庫(kù)容量不同，對(duì)于一些不常見種屬的細(xì)菌種屬鑒定上可能存在差異。如CODE1的菌落2，VITEK2的鑒定結(jié)果為泛菌屬(Pantoeaspp)，而MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果則為阪崎克洛諾桿菌(Cronobactersakazakii)。出現(xiàn)這種情況時(shí)，就需要通過16SrRNA基因測(cè)序方法進(jìn)行進(jìn)一步鑒定[11-14]。

綜上所述，根據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康目梢赃x擇不同的試驗(yàn)方法。本實(shí)驗(yàn)室建立的藥品化妝品微生物致病菌檢測(cè)程序如下：盲樣經(jīng)增菌后，劃線分離的同時(shí)可以先使用杜邦BAX Q7和miniVIDAS進(jìn)行初篩。根據(jù)初篩的結(jié)果更有針對(duì)性的從分離培養(yǎng)基中挑取疑似的和非疑似的菌落，分別利用國(guó)標(biāo)法、VITEK2 Compact和全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)Autof ms1000對(duì)其進(jìn)行鑒定。以期通過多種實(shí)驗(yàn)手段互相佐證，得出最全面最準(zhǔn)確的結(jié)果。