豬早期胚胎發(fā)育中SOX2基因啟動子活性分析

趙劍超，柴壯，郭詩萌，劉忠華

研究報告

豬早期胚胎發(fā)育中基因啟動子活性分析

趙劍超，柴壯，郭詩萌，劉忠華

東北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030

轉錄因子SOX2 (sex determining region Y-box2)在早期胚胎發(fā)育第一次譜系分化以及內(nèi)細胞團多能性維持等方面具有重要的作用。但是目前有關基因啟動子的系統(tǒng)研究較少，尤其是在豬()中尚無相關報道。為系統(tǒng)分析豬基因啟動子在早期胚胎中的活性，本研究通過優(yōu)化顯微注射體系中綠色熒光蛋白表達載體種類和注射時間，構建了適合豬基因啟動子活性分析的參照體系和顯微注射體系；對豬基因翻譯起始位點上游5000 bp區(qū)域進行轉錄因子結合位點的預測，發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在4個轉錄因子結合位點簇；針對上述區(qū)域設計并構建相應的缺失型基因啟動子報告載體，利用建立的顯微注射體系將其導入胚胎，通過mCherry熒光強度以及qRT-PCR定量分析基因啟動子中不同轉錄因子結合位點簇對啟動子活性的影響。結果表明，與全長基因啟動子相比，基因翻譯起始位點上游2254~2442 bp區(qū)域缺失后，豬4-細胞和8-細胞胚胎中基因啟動子活性下降至17.8%，該缺失區(qū)域中僅包含兩個NF-AT(nuclear factor of activated T cells)轉錄因子結合位點。因此，本研究結果推測豬基因啟動子中NF-AT轉錄因子結合位點是影響豬早期胚胎基因啟動子活性的關鍵位點。本研究為揭示豬早期胚胎發(fā)育中基因表達調(diào)控機制提供了數(shù)據(jù)支持。

基因；啟動子活性；豬

SOX2蛋白作為重要的轉錄因子，廣泛表達于胚胎、原始生殖細胞、神經(jīng)元等多種組織與細胞中。在胚胎發(fā)育過程中，基因的表達是大腦皮層形成和發(fā)育所必需的，同時也參與指導食道與前胃的形成[1]。此外，基因在多種癌細胞與腫瘤干細胞中廣泛表達[2~4]。近年來，SOX2轉錄因子在早期胚胎發(fā)育和維持干細胞多能性方面的作用受到廣泛關注[5~7]。

在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中，第一次譜系分化發(fā)生在囊胚腔形成時期，胚胎由全能性的卵裂球分化形成多潛能性的滋養(yǎng)層細胞(trophectoderm, TE)和內(nèi)細胞團細胞(inner cell mass, ICM)。然而，關于第一次譜系分化形成滋養(yǎng)層和內(nèi)細胞團細胞的機制目前尚不清楚。SOX2蛋白作為核心多能性轉錄因子之一，在早期胚胎發(fā)育中第一次譜系分化以及內(nèi)細胞團多能性維持等方面具有重要的作用[8,9]。2003年，Avilion等[10]證實小鼠()基因敲除的囊胚中仍存在ICM，但導致其喪失多能性，同時失去產(chǎn)生胚胎干細胞的能力。2014年，Wicklow等[11]發(fā)現(xiàn)小鼠中基因的表達不受CDX2蛋白調(diào)控，且基因在內(nèi)細胞團中特異性表達并具有重要功能。在豬早期胚胎發(fā)育中，SOX2轉錄因子備受關注。2015年，Liu等[12]研究表明，雖然基因在豬內(nèi)細胞團中特異性表達，但表達模式與小鼠不同：(1)在早期囊胚內(nèi)細胞團前體細胞中即出現(xiàn)基因特異性表達，但此時基因尚未表達；(2)在囊胚期，滋養(yǎng)層細胞中基因表達沉默先于極化的發(fā)生，而小鼠中由于細胞的極化導致滋養(yǎng)層細胞中基因表達沉默。表達模式的差異暗示豬基因表達上游調(diào)控機制不同于小鼠。此外，在豬誘導性多能性干細胞(induced pluripotent stem cells, iPSC)的建系研究中，利用SOX2蛋白在內(nèi)的經(jīng)典4因子對體細胞重編程，雖然可以獲得具有一定多能性的iPS細胞系[13~16]，但豬iPSC同時具有內(nèi)源基因不激活、外源基因不沉默以及不具嵌合能力等問題[17]。同時，參考小鼠和人胚胎干細胞系建系的經(jīng)驗，至今仍無法獲得豬胚胎干細胞系[18,19]。上述研究表明，豬與小鼠、人等多能性調(diào)控網(wǎng)絡存在差異，建立豬多能性相關調(diào)控網(wǎng)絡機制具有重要的科學意義。

其次，用戶端向傳感器端發(fā)送驗證傳感器的身份的請求。用戶端的計算公式為（9）—（10），其中R1是隨機數(shù)是時間戳：

本研究通過檢測基因啟動子介導的報告基因表達水平評價其啟動活性，預測了啟動子區(qū)域轉錄因子結合位點，分析了各區(qū)域?qū)騿幼踊钚缘挠绊?，進而揭示豬早期胚胎發(fā)育中基因表達調(diào)控關鍵因子，為進一步研究豬早期胚胎第一次譜系分化以及多能性干細胞建立提供理論基礎[20]。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒載體構建

本研究所用的質(zhì)粒包括：pEGFP-C1 (Clontech，美國)，pRL-TK (Promega E2241，美國)，F(xiàn)UGW (Addgene 14883，美國)和pLV-mCherry (Addgene 36084，美國)。載體構建中片段克隆所用的DNA聚合酶為PrimeSTAR?Max DNA Polymerase (TaKaRa R045A，日本)，反應體系為25 μL，反應條件中退火溫度設定為58℃，時間15 s；DNA片段連接所用的試劑盒為NEBuilder?高保真 DNA 組裝克隆試劑盒(NEB E2621S，美國)，引物重復序列長度25 bp，20 μL反應體系中共加入0.2 pmol DNA片段總量，反應時間15 min。PCR和qRT-PCR所用全部引物信息見表1。

表1 引物信息

*引物序列中未標出用于無縫克隆的重復序列。

將質(zhì)粒Sp0、Sp1、Sp2、Sp3、Sp4與內(nèi)參質(zhì)粒pEGFP-C1以4∶1的比例混合，終濃度為100 ng/μL。對豬胚胎進行注射并培養(yǎng)72 h，以檢測mCherry以及EGFP蛋白的表達情況(圖5 A)。結果顯示，與Sp0注射組相比，Sp1注射組胚胎無法檢測到mCherry蛋白信號；Sp3與Sp4注射組mCherry蛋白信號顯著下降；而Sp2注射組胚胎mCherry蛋白水平與Sp0注射組無顯著差異(圖5 B)。進一步利用qRT-PCR對各組胚胎的基因相對表達量進行定量分析。結果顯示，相對于Sp0注射組胚胎，各組胚胎基因相對表達量均有不同程度的下降，但與熒光檢測結果不同的是，Sp3注射組胚胎基因的mRNA表達水平最低，僅為Sp0注射組的0.18(±0.0034) (圖5 C)。據(jù)此推斷，Sp3質(zhì)粒中缺失的轉錄因子結合位點簇d3可能為基因啟動子活性關鍵區(qū)域。根據(jù)轉錄因子結合位點預測結果，d3中僅包含兩個NF-AT轉錄因子結合位點，推測NF-AT轉錄因子家族是調(diào)節(jié)豬早期胚胎中基因表達的關鍵轉錄因子。

顯微操作系統(tǒng)為倒置顯微鏡(Nikon TS-100，日本)、顯微注射系統(tǒng)(Nikon IM-9A，日本)及Femtojet Express定量注射系統(tǒng)(Eppendorf，德國)。取100 μL胚胎操作液(MAN)于平皿中央，并用石蠟油覆蓋后放置于顯微操作儀39℃恒溫工作臺上，向MAN液滴中加入卵母細胞準備注射。將5 μL質(zhì)粒溶液通過微量上樣槍頭加至注射針內(nèi)進行注射操作。注射系統(tǒng)相關參數(shù)為：注射壓力(Pi)100 hPa、注射時間(Ti)0.5 s和補償壓力(Pc)40 hPa。顯微鏡下對豬卵母細胞進行胞質(zhì)注射，注射量約為30 pL/枚。

(1)For high power semiconductor lasers,working current Iop is usually much larger than the threshold current Ith,so in formula(5)Ith has relatively small effect.

以Sp0質(zhì)粒為模板，分別以sox2 pro[1]-p、sox2 pro[2]-p、sox2 pro[3]-p和sox2 pro[4]-p為引物進行克隆，將得到的克隆產(chǎn)物直接自連，分別獲得質(zhì)粒Sp1、Sp2、Sp3和Sp4，其特點為：分別缺失相應結合位點簇的基因啟動子介導的mCherry表達載體。

以豬基因組為模板，利用引物sox2+-p進行克??；再以克隆產(chǎn)物為模板，利用引物sox2-p克隆得到翻譯起始位點上游5000 bp片段，即本研究中基因全長啟動子，命名為sox2 pro 5k。以pLV-mCherry質(zhì)粒為模板，利用引物mCherry-p克隆得到mCherry片段；以pEGFP-C1質(zhì)粒為載體骨架，利用引物C1 line-p克隆得到線性化的載體骨架；將sox2 pro 5k片段、mCherry片段和線性化的載體骨架連接，獲得質(zhì)粒Sp0，其特點為：以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎骨架的5000 bp基因啟動子介導的mCherry表達載體。

構建完成的質(zhì)粒去內(nèi)毒素提取后–20℃保存。

本工作提出的改進的模型預測直接轉矩控制方法,通過優(yōu)化矢量選擇器得到需要進行價值函數(shù)優(yōu)化控制的3個電壓矢量,可有效降低模型預測直接轉矩控制的優(yōu)化計算量.對于控制延時對系統(tǒng)性能的影響,延時補償控制能夠顯著減小由控制延時引起的電流紋波和轉矩脈動.通過在MPDTC的價值函數(shù)中加入開關切換次數(shù)的約束,增大開關頻率的權重因子可降低逆變器的開關頻率,但同時會使得電流畸變率有所增加.仿真和實驗結果表明,由全階磁鏈觀測器得到的磁鏈能夠準確地跟蹤其給定值,改進的MPDTC具有良好的動、靜態(tài)性能,并且可以有效降低逆變器的開關頻率.

圖1 報告質(zhì)粒圖譜

A, B：報告質(zhì)粒pEGFP-C1和pEGFP-UBC構建圖譜；C~E：pRL-TK質(zhì)粒和pRL-CMV、pRL-UBC報告質(zhì)粒構建圖譜。

表2 報告質(zhì)粒信息對比

1.2 胚胎培養(yǎng)與顯微注射

2.1.1 報告載體的篩選

以pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，利用引物CMV pro-p和EGFP-p分別克隆得到CMV啟動子片段和增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)片段；以pRL-TK質(zhì)粒為基礎載體，利用引物pRL line-p克隆得到線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體；將CMV啟動子片段、EGFP片段和線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體連接，獲得pRL-CMV質(zhì)粒，將UBC啟動子片段、EGFP片段和線性化的pRL-TK質(zhì)粒載體連接，獲得pRL-UBC質(zhì)粒。其特點為：以pRL-TK質(zhì)粒為基礎骨架的CMV或UBC啟動子介導的EGFP表達載體(圖1，C~E；表2)。

1.3 啟動子信息獲取與預測

表3 sox2pro 5k片段中預測的轉錄因子結合位點

1.4 啟動子活性分析

2.1.2 注射時間選擇

2 結果與分析

2.1 豬胚胎顯微注射體系的建立

從屠宰場收集豬卵巢，在37℃生理鹽水中抽取直徑2~8 mm卵泡。將獲得的卵泡液靜置，棄上清，并用HEPES緩沖液清洗稀釋后，在39℃恒溫工作臺上借助顯微鏡挑出有3層以上卵丘細胞包裹的卵母細胞，50枚一組培養(yǎng)在500 μL預平衡的成熟培養(yǎng)液(MAT)中，條件為39℃、5%CO2的飽和濕度環(huán)境。避光靜置培養(yǎng)42 h后，將卵母細胞置于0.5%透明質(zhì)酸酶中震蕩去除卵丘細胞，在39℃恒溫工作臺上借助顯微鏡挑出具有第一極體的MII期卵母細胞。將獲得的MII期卵母細胞置于細胞融合液(FM)中排成一列，附加兩次120 V/mm、30 μs的矩形脈沖以完成孤雌激活，之后50枚一組培養(yǎng)在500 μL預平衡的胚胎培養(yǎng)液(PZM-3)，條件為39℃、5% CO2的飽和濕度環(huán)境中。

對豬胚胎顯微注射體系中報告載體的類型進行篩選，以獲得高效表達外源報告基因的載體。選擇兩種載體骨架以及兩種廣譜型啟動子共計4種載體作為備選報告載體，分別是pEGFP-C1、pEGFP-UBC、pRL-CMV和pRL-UBC (圖1)。孤雌激活后4 h用上述4種質(zhì)粒對胚胎進行顯微注射，注射質(zhì)粒濃度為20 ng/μL。觀察EGFP蛋白表達情況以及胚胎發(fā)育情況(圖2，A和B)。結果表明，注射pEGFP-C1質(zhì)粒的胚胎EGFP陽性率為39.33% (±1.76%)，顯著高于其他組(圖2，C和D)。由于早期胚胎發(fā)育會受外源DNA濃度的影響，因此又分別選擇20 ng/μL與100 ng/μL濃度的pEGFP-C1進行顯微注射。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，當注射濃度提高至100 ng/μL時，注射胚胎發(fā)育情況與20 ng/μL濃度組無顯著差異(圖2B)，但EGFP表達效果更好(圖2，C和D)。因此，在后續(xù)研究中選擇pEGFP-C1質(zhì)粒為內(nèi)參和基本載體骨架，質(zhì)粒總濃度為100 ng/μL。

紙飛機飛得很遠，再慢慢滑翔下去，安安靜靜地扎在街心花園的草叢里。阮小棉看著它，久久地久久地看，真想自己也和它一樣，那么輕那么輕，可以滑翔，墜地的時候沒有一點聲響。

為了確定豬胚胎顯微注射體系中最佳注射時間，分別針對孤雌前卵母細胞(–0 h)與孤雌激活0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h以及11 h后胚胎顯微注射pEGFP-C1質(zhì)粒，觀察各組胚胎發(fā)育與EGFP蛋白表達情況(圖3)。結果表明，不同注射時間對于胚胎發(fā)育與EGFP蛋白表達影響較大。其中–0 h組對胚胎發(fā)育影響最小，但EGFP蛋白表達水平最低；而2 h、4 h與6 h組對胚胎發(fā)育影響較小，同時EGFP蛋白高水平表達(圖3，A和B)。綜合胚胎發(fā)育情況及EGFP蛋白表達水平，選擇孤雌后2~6 h作為最佳注射時間。此外，觀察發(fā)現(xiàn)胚胎在4-細胞期開始表達EGFP蛋白，在8-細胞期EGFP蛋白表達陽性胚胎比例達到最高。因此，在后續(xù)基因啟動子活性檢測研究中選擇孤雌后72 h收集4-細胞和8-細胞胚胎進行檢測(圖3 C)。

2.2 啟動子結構預測分析與報告載體構建

本研究對豬基因翻譯起始位點上游5000 bp序列進行轉錄因子結合位點預測分析。結果發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域中轉錄因子結合位點成簇分布于4個區(qū)域，以與翻譯起始位點的距離分別命名d1~d4(圖4 A，表3)。針對4個結合位點簇分別設計并構建相應缺失的基因啟動子報告載體，將構建的啟動子片段分別命名為sox2 pro [1~4]，構建的質(zhì)粒分別命名為Sp1~4 (圖4，B和C)。同時針對豬基因翻譯起始位點上游5000 bp序列，與小鼠進行相似性比對分析，結果顯示，序列相似點的排布近似斜率為1的直線，相似性為71% (圖4 D)。因此，小鼠的相關研究結果在豬中具有一定參考價值。

圖2 4種質(zhì)粒對胚胎熒光標記的效果

A：用4種質(zhì)粒分別對孤雌激活4 h后的胚胎進行注射，培養(yǎng)5 d后熒光鏡下觀察基因表達情況；B：以孤雌胚胎為對照，各注射組培養(yǎng)5 d內(nèi)胚胎各階段發(fā)育情況統(tǒng)計；C：各注射組在培養(yǎng)5 d后胚胎基因表達陽性率；D：各注射組在培養(yǎng)5 d后胚胎EGFP平均熒光強度。括號中20和100分別代表質(zhì)粒濃度為20 ng/μL和100 ng/μL。

2.3 啟動子活性檢測

以FUGW質(zhì)粒為模板，利用引物UBC pro-p克隆得到泛素C (ubiquitin-C, UBC)啟動子片段；以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎載體，利用引物pEGFP line-p克隆得到線性化的pEGFP-C1質(zhì)粒載體；將UBC啟動子片段和線性化的pEGFP-C1質(zhì)粒載體連接，獲得pEGFP-UBC質(zhì)粒。pEGFP-C1和pEGFP-UBC質(zhì)粒特點：以pEGFP-C1質(zhì)粒為基礎骨架的CMV (cytomegalovirus)或UBC啟動子介導的EGFP表達載體(圖1，A和B；表2)。

圖3 孤雌激活前后不同注射時間的熒光標記效果

A：分別在孤雌前(–0 h)和孤雌后0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、11 h注射pEGFP-C1質(zhì)粒，培養(yǎng)6 d后觀察基因表達情況；B：各注射組胚胎基因表達陽性率及發(fā)育率統(tǒng)計；C：2 h、4 h和6 h注射組在培養(yǎng)6 d時間內(nèi)胚胎各階段發(fā)育情況統(tǒng)計。

3 討論

SOX2蛋白是哺乳動物早期胚胎發(fā)育中關鍵轉錄因子之一，對于基因上游調(diào)控網(wǎng)絡的研究可以揭示早期胚胎發(fā)育中細胞命運決定、胚胎干細胞多能性維持等相關分子機制[21]。本研究通過對豬早期胚胎中基因啟動子活性分析，發(fā)現(xiàn)NF-AT轉錄因子結合位點是4-細胞與8-細胞胚胎中調(diào)控基因表達的關鍵順式調(diào)控元件。NF-AT是一個鈣離子敏感的轉錄因子家族，在內(nèi)皮細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞和神經(jīng)元等多種細胞中廣泛表達[22]。但是NF-AT轉錄因子在早期胚胎發(fā)育中的作用功能尚不明確，同時NF-AT蛋白調(diào)控基因表達的相關研究尚未報道。因此，研究NF-AT轉錄因子對于豬早期胚胎發(fā)育的調(diào)控功能具有重要意義。

對Sp1注射組的報告基因檢測時發(fā)現(xiàn)，其蛋白水平與mRNA水平并不一致。在小鼠中，基因啟動子無“TATA box”核心啟動元件，而上游約60 bp處存在倒轉的“CCAAT box”元件[23,24]，該元件作為基因啟動子的核心啟動元件，轉錄因子NF-Y (nuclear factor-Y)可識別、結合“CCAAT box”并募集RNA聚合酶復合體，啟動基因的轉 錄[25~27]。而Sp1質(zhì)粒中sox2 pro [1]啟動子片段缺失區(qū)域d1上存在預測的NF-Y結合位點，且與翻譯起始位點的距離同小鼠類似，因此推測d1中包含核心啟動元件以及轉錄起始位點。然而本研究結果顯示，Sp1注射組中可以檢測到報告基因的mRNA表達。據(jù)此推斷，在基因啟動子的其他區(qū)域中存在第二轉錄起始位點，由于sox2 pro[1]中并未破壞第二轉錄起始位點，導致該組中檢測到報告基因的mRNA表達，但由于移碼突變產(chǎn)生的無義蛋白不具有熒光特性，因此無法檢測到報告基因蛋白。預測分析結果顯示d2區(qū)域包括C/EBP (CCAAT-en-hancer-binding protein)結合位點，而C/EBP轉錄因子家族具有募集RNA聚合酶復合體、啟動轉錄的能力[28~30]，因此推測第二轉錄起始位點位于d2中。在后續(xù)研究中，本課題組將針對這兩個潛在的轉錄起始位點進行分析，明確豬基因轉錄起始位點特性。

這幾年，城市就像氣球，不斷膨脹。老城之外，又衍生出新城。車多了，人也多了，老城的路跟不上時代了，城市的機關單位就得挪出去，搬到城市的外圍。路修得寬寬的，向北京的長安街看齊，生怕再過幾年又落后了。嗅覺靈敏的開發(fā)商早瞅準時機，在新城的四周豎起一幢又一幢樓盤。

2007年，為提高服務業(yè)整體發(fā)展水平和國際競爭力，更好發(fā)揮標準化對服務業(yè)發(fā)展的促進作用，國家標準委積極探索服務業(yè)標準有效實施的途徑，創(chuàng)新服務業(yè)標準化工作的機制和模式，與國家發(fā)展和改革委員會等六部委聯(lián)合下發(fā)《關于推進服務標準化試點工作的意見》[1]，在全國范圍內(nèi)，全面啟動了服務標準化試點建設工作，涉及旅游、物流、金融、運輸、社區(qū)、餐飲、商貿(mào)及家政等領域。

圖4 豬SOX2翻譯起始位點上游5000 bp序列結構分析

A：豬基因翻譯起始位點上游5000 bp序列預測的轉錄因子結合位點(紅色條)以及4個轉錄因子結合位點成簇分布的區(qū)域d1~d4；B：豬基因翻譯起始位點上游5000 bp全長啟動子、4個轉錄因子結合位點成簇分布的區(qū)域d1~d4和構建的各區(qū)域缺失型啟動子sox2 pro [1~4]；C：基因啟動子報告載體圖譜；D：豬翻譯起始位點上游5000 bp序列與小鼠對應序列相似性比較。

根據(jù)上述結果以及相關分析，可以確定調(diào)控基因啟動子的潛在關鍵因子包括NF-AT[31]、NF-Y[32]、C/EBP[33]和AP-2 rep (Krueppel-like factor 12) 4種轉錄因子[34]。Cao等[35]對豬早期胚胎發(fā)育表達模式進行分析，發(fā)現(xiàn)上述4種轉錄因子在早期胚胎發(fā)育中都有表達。其中，NF-Y和C/EBP轉錄因子可能與豬基因的轉錄起始相關；NF-AT轉錄因子可以增強基因啟動子的啟動活性；而AP-2 rep轉錄因子或?qū)F-AT轉錄因子的功能產(chǎn)生影響[36,37]。因此推斷這4類轉錄因子是潛在調(diào)節(jié)基因表達的關鍵因子。

圖5 各啟動子片段的活性分析

A：孤雌胚胎分別注射Sp0~4各組質(zhì)粒并培養(yǎng)72 h后在熒光鏡下觀察和基因表達情況（Bar=100 μm）；B：孤雌胚胎注射并培養(yǎng)72 h后各注射組基因表達統(tǒng)計；C：孤雌胚胎注射并培養(yǎng)72 h后qRT-PCR檢測相對表達量。

雙螢光素酶檢測系統(tǒng)[38]雖然是啟動子活性檢測的常規(guī)技術[39]，然而受到早期胚胎樣品收集困難以及細胞數(shù)低的制約，本研究無法采用雙螢光素酶檢測系統(tǒng)進行基因啟動子活性評價。因此選擇報告基因表達水平檢測的方式評價啟動子活性[40]。通過qRT-PCR檢測報告基因mRNA的相對表達水平，避免蛋白降解周期對結果的干擾；利用內(nèi)參質(zhì)粒的表達水平檢測，排除顯微注射體系的系統(tǒng)誤差；利用內(nèi)源基因的表達水平檢測，排除各組間因胚胎狀態(tài)差異導致的誤差，通過計算獲得報告基因相對表達水平可以最高程度地體現(xiàn)相應啟動子的轉錄活性。同時，本研究對胚胎顯微注射條件進行探索，最終確定孤雌激活2~6 h進行顯微注射可以在保證報告基因表達的前提下最小限度地影響胚胎發(fā)育。本研究技術體系可以更廣泛地應用于豬早期胚胎中啟動子活性的研究，篩選分析豬早期胚胎中相關基因調(diào)控元件，揭示豬早期胚胎發(fā)育特點。

從H在2017年工資與福利發(fā)放表中可以查出H 2017計提工資薪金2 026 830 003.08元，實際發(fā)放只有1 918 170 240.84元。兩者之間差了108 659 762.2元。只能扣除在規(guī)定限額內(nèi)的實際發(fā)放的工資和薪金，其余均不能扣除。所以，在最終環(huán)節(jié)，計算最終應納稅費的稅基時，H應先對多計提并計入相關成本費用的部分進行相應的調(diào)增。調(diào)增數(shù)額為108 659 762.2元，還需補繳稅款 108 659 762.2×25%=27 164 940.55 元。 所以在籌劃時應盡量縮小實發(fā)與計提之間的差額。

綜上所述，本研究利用報告基因表達檢測的方法，以pEGFP-C1質(zhì)粒為內(nèi)參和啟動子報告載體骨架，對孤雌后2~4 h胚胎注射，并在72 h后檢測報告基因表達水平，評估啟動子活性。分析豬基因翻譯起始位點上游5000 bp，發(fā)現(xiàn)4個轉錄因子結合位點成簇分布的區(qū)域，類似于小鼠基因表達調(diào)控中超級增強子(super-enhancer)結構[41,42]。通過分析這4個區(qū)域?qū)ωi基因啟動子活性的影響，發(fā)現(xiàn)存在NF-TA轉錄因子結合位點簇的關鍵區(qū)域，該區(qū)域的缺失導致基因啟動子活性降低。本研究結果為豬基因啟動子結構以及上游調(diào)控機制的研究提供了數(shù)據(jù)支持。

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Analysis ofgene promoter activity in porcine early embryonic development

Jianchao Zhao, Zhuang Chai, Shimeng Guo, Zhonghua Liu

SOX2 (sex determining region Y-box2) is one of the critical pluripotent factors that play a crucial role in the first lineage differentiation and maintenance of pluripotency in inner cell mass during early embryonic development. However, there are few researches about the regulation of thepromoter, especially in. To analyzed the activity ofpromoter in early porcine embryos, we determined the control system and established the microinjection system for assessingpromoter activity by analyzing the embryonic development and the expression of enhanced green fluorescence protein (EGFP) after micro-injected different EGFP plasmids at different times after activation of the oocytes. Then, we analyzed the structure of 5000 bp upstream of thetranslation initiation site and found there were four transcription factor binding site clusters. Next, we designed and constructed promoter-containing plasmids to analyze the function of each cluster. To detect the activity of different promoters, we assessed the mCherry expression in protein levels and mRNA levels by analyzing the mCherry fluorescence intensity and qRT-PCR after injecting plasmids into embryos. These results showed that the activity of the shorted promoter, with the region from 2254 bp to 2442 bp upstream of translation initiation site deleted, decreased to 17.8% at 4-cell and 8-cell stages compared with the full-length promoter. This region included two NF-AT transcription factor binding sites, which indicated that the NF-AT binding site is a key region to regulate the activity of thepromoter. The results provide important data for determination the mechanism of porcineregulation.

gene; promoter activity; pig

2019-02-21;

2019-06-17

國家自然科學基金面上項目(編號：31872360)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31872360)]

趙劍超，碩士研究生，專業(yè)方向：發(fā)育生物學。E-mail: arabidopsis@yeah.net

劉忠華，教授，博士生導師，研究方向：早期胚胎發(fā)育與豬干細胞研究。E-mail: liuzhonghua@neau.edu.cn

10.16288/j.yczz.19-045

2019/7/5 14:07:50

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190705.1407.002.html

(責任編委: 李明洲)