利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人HPRT1基因定點(diǎn)突變細(xì)胞株

張楷，劉蔚，劉小鳳，陳瑤生，劉小紅，何祖勇

研究報告

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建人基因定點(diǎn)突變細(xì)胞株

張楷，劉蔚，劉小鳳，陳瑤生，劉小紅，何祖勇

中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實驗室，廣州 510006

Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase1 ()基因突變會導(dǎo)致次黃嘌呤和鳥嘌呤代謝異常，嚴(yán)重的代謝障礙被稱為Lesch-Nyhan綜合征，表現(xiàn)為智力低下，行為上出現(xiàn)強(qiáng)迫性自我毀傷，并伴隨痛風(fēng)或腎結(jié)石等癥狀。基因具有多種突變模式，近年來對其突變譜的研究表明該基因具有一些“突變熱點(diǎn)”。本研究選取了導(dǎo)致翻譯提前終止的熱點(diǎn)突變c.508C>T突變和c.151C>T突變，在HEK293T和HeLa細(xì)胞中，以單鏈寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)作為同源重組模板，利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了這兩種突變的單克隆細(xì)胞株，發(fā)生定點(diǎn)突變的效率分別為16.3%和10%。進(jìn)一步通過Western blot檢測點(diǎn)突變的單克隆細(xì)胞的HPRT1蛋白表達(dá)水平，通過6-TG毒性實驗檢測點(diǎn)突變的單克隆細(xì)胞的次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性，結(jié)果表明純合突變的單細(xì)胞克隆不能正常表達(dá)HPRT1蛋白，其次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性喪失；雜合突變的單細(xì)胞克隆的HPRT1蛋白表達(dá)量降低，仍具有部分次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性?；蚨c(diǎn)突變細(xì)胞模型的建立可為今后建立其他基因突變的細(xì)胞系或動物模型提供借鑒，為研究Lesch-Nyhan致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

CRISPR/Cas9；；基因定點(diǎn)突變

CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)自問世以來獲得了舉世矚目的關(guān)注與飛速的發(fā)展，被廣泛地應(yīng)用到多個物種，同時因其高效、精準(zhǔn)的特點(diǎn)被越來越多地運(yùn)用到分子治療領(lǐng)域。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時，經(jīng)由sgRNA對靶位點(diǎn)識別后，Cas9蛋白會結(jié)合到靶位點(diǎn)上對其進(jìn)行切割，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(DNA double-stranded breaks, DSBs)。發(fā)生DNA雙鏈斷裂的細(xì)胞會啟動自身的修復(fù)機(jī)制，主要有兩類不同的修復(fù)途徑：非同源染色體末端連接(no-nhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(hom-ology-directed repair, HDR)。其中，NHEJ是DNA修復(fù)的最主要途徑，這一途徑常在連接時發(fā)生堿基插入或缺失突變，因此往往用于單位點(diǎn)基因敲除或大片段的刪除[1,2]。HDR途徑則是以另一條染色體或具有同源臂的外源的DNA片段作為模板進(jìn)行基因重組。這一機(jī)制可以用于引入基因單核苷酸突變或片段的插入或刪除，從而對基因進(jìn)行更加可控的、定向的、精確的編輯。通常來說，細(xì)胞內(nèi)HDR發(fā)生的頻率要小于NHEJ，并且只發(fā)生在細(xì)胞分裂時，且很大程度上受細(xì)胞種類、周期和同源重組模板影響[3]。因此在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時，利用NHEJ機(jī)制對靶位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)的基因敲除的效率通常較高，但是利用HDR機(jī)制對靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變則相對比較困難。研究表明利用單鏈寡核苷酸(single-stranded oligo-deoxyribonucleotides, ssODN)做為同源重組的模板，可以增加HDR的頻率，誘導(dǎo)細(xì)胞向特定的方向突變，從而達(dá)到精確的基因編輯的效果[4]。因此，本研究擬以ssODN作為模板，應(yīng)用CRISPR/Cas9對次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1 (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase1,)基因進(jìn)行精確的點(diǎn)突變遺傳修飾。

基因位于X染色體末端q26-27區(qū)域，編碼序列長44 kb，其結(jié)構(gòu)包括8個內(nèi)含子和9個外顯子，共編碼217個氨基酸，蛋白質(zhì)大小為25 kDa。次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶1可以促進(jìn)次黃嘌呤或鳥嘌呤與磷酸核糖焦磷酸進(jìn)行轉(zhuǎn)磷酸核糖基作用，生成相應(yīng)的核苷-5-磷酸。HPRT1蛋白參與核苷酸合成的補(bǔ)救途徑，對于維持細(xì)胞內(nèi)嘌呤核苷酸的濃度具有重要意義。HPRT1蛋白的功能障礙會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)尿酸過量生成并排出，引起血液內(nèi)尿酸濃度過高，從而導(dǎo)致高尿酸血癥的發(fā)生。大約10%的高尿酸血癥患者會出現(xiàn)尿酸鹽的結(jié)晶在關(guān)節(jié)附近的沉積從而引起痛風(fēng)[5~7]。嚴(yán)重的基因突變會引起大腦基底神經(jīng)節(jié)的功能障礙，從而表現(xiàn)出一些神經(jīng)行為疾病癥狀，如自殘、腦發(fā)育不足、智力低下等，被稱為Lesch-Nyhan綜合征(又稱自毀容貌癥)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，基因存在多個遺傳變異位點(diǎn)，且這些突變位點(diǎn)不完全是隨機(jī)分布的，存在某些位點(diǎn)出現(xiàn)突變的頻率很高，因此這些高突變頻率位點(diǎn)很可能與疾病的發(fā)生密切相關(guān)。Jinnah等[5]對271個基因突變病例的統(tǒng)計分析表明，不同突變可以導(dǎo)致氨基酸單位點(diǎn)替換、翻譯提前終止、mRNA剪接錯誤或大片段刪除。不同突變導(dǎo)致的癥狀也不盡相同，部分癥狀輕微的突變可能僅僅表現(xiàn)為高尿酸血癥或輕度的神經(jīng)疾病，但有一部分(196個病例)表現(xiàn)為嚴(yán)重的Lesch-Nyhan綜合征。在該196個病例當(dāng)中，有25個病例為翻譯提前終止突變的病例，其中有11個病例發(fā)生了c.151 C>T突變，使該位點(diǎn)編碼精氨酸的密碼子變?yōu)榻K止密碼子；有10個病例發(fā)生了c.508 C>T突變，同樣使精氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。在這些突變病例當(dāng)中，除1例癥狀未知，1例表現(xiàn)為輕微神經(jīng)障礙以外，其余均呈現(xiàn)嚴(yán)重的Lesch-Nyhan綜合征[6]，由此推測這兩個位點(diǎn)的突變可能和Lesch-Nyhan綜合征的發(fā)病機(jī)制有密切的關(guān)聯(lián)。因此，本研究在HEK293T和HeLa細(xì)胞中，以ssODN作為同源重組模板，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)技術(shù)構(gòu)建了這兩種突變的單克隆細(xì)胞株。進(jìn)一步通過Western blot以及6-TG毒性實驗分別對點(diǎn)突變的單克隆細(xì)胞的HPRT1蛋白表達(dá)水平和次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明純合突變的單細(xì)胞克隆不能正常表達(dá)HPRT1蛋白，其次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性喪失；雜合突變的單細(xì)胞克隆的HPRT1蛋白表達(dá)量降低，仍具有部分次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞由本實驗室保存，pX458質(zhì)粒(Cas9/sgRNA/EGFP共同表達(dá)質(zhì)粒)購于美國Addgene公司，引物和Oligo、ssODN由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，Ⅰ、Ⅲ、T7E1等核酸內(nèi)切酶購于美國NEB公司，HPRT抗體和6-TG購于德國Sigma-Aldrich公司。

1.2 sgRNA設(shè)計和CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

在靶位點(diǎn)附近尋找PAM序列(5￠NGG3￠)，在PAM序列上游選取20 bp序列即為sgRNA結(jié)合序列。對于起始堿基不是G的gRNA需要在5￠端加G。隨后在正反向gRNA的5￠端分別添加Ⅰ酶在pX458質(zhì)粒上的粘性末端CACC (加在正向序列前)和AAAC (加在反向序列前)即可。本研究針對c.508C> T位點(diǎn)設(shè)計了4條gRNA，針對c.151C>T位點(diǎn)設(shè)計1條gRNA (表1)，5條gRNA在基因上的位置如圖1A所示。將合成的gRNA正負(fù)鏈分別加入超純水溶解稀釋到100 μL進(jìn)行磷酸化和退火，使之成為帶有Ⅰ酶切位點(diǎn)的雙鏈DNA片段，克隆到pX458質(zhì)粒載體中。將構(gòu)建完成的質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化，涂平板，過夜培養(yǎng)后挑取單克隆，測序驗證表達(dá)質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。

1.3 ssODN設(shè)計

選擇突變位點(diǎn)左右各40 bp序列作為同源臂，合成含有突變位點(diǎn)的反義鏈作為同源重組的ssODN (表2)。設(shè)計ssODN時，在不引起氨基酸移碼突變或錯義突變的前提下，為防止基因組DNA成功突變后CRISPR/Cas9系統(tǒng)在突變位點(diǎn)繼續(xù)發(fā)揮切割活性，同時對PAM位點(diǎn)進(jìn)行突變以終止其切割活性。同時為方便后續(xù)的鑒定，在突變位點(diǎn)附近引入一個新的限制酶識別位點(diǎn)(?圖1B)：(1)在c.508C>T突變位點(diǎn)前4個堿基處進(jìn)行c.504C>A的同義突變，使該處的PAM位點(diǎn)GGG突變?yōu)镚GT，重組后即可令此處失去Cas9蛋白的切割活性；c.508C>T突變本身向該位點(diǎn)引入了限制性內(nèi)切酶Ⅲ的識別位點(diǎn)(CATG)，因而無需另外引入其他酶切位點(diǎn)；(2)在c.151C>T突變位點(diǎn)下游第15~16位的GA堿基突變?yōu)锳C堿基(模板上的反向互補(bǔ)序列為TC>GT)，使該處的PAM位點(diǎn)失活的同時引入了Ⅰ酶切位點(diǎn)(GAAGAC)。

表1 CRISPR/Cas9基因編輯質(zhì)粒Oligo序列

圖1 gRNA和ssODN位點(diǎn)示意圖

A：基因gRNA位置(藍(lán)色表示突變位點(diǎn)，紅色表示PAM序列)；B：ssODN設(shè)計示意圖(箭頭表示靶位點(diǎn)，紅色字母表示為破壞PAM序列或引入酶切位點(diǎn)而引入的無義突變)。

表2 HPRT1基因的同源重組寡核苷酸序列

大寫字母表示與基因序列不同的堿基，即引入的突變位點(diǎn)。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h將細(xì)胞接種至六孔板中，用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到70%~80%進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。用Opti-MEM減血清培養(yǎng)基分別將3 μL待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒和5 μL PEI-MAX溶液(2 μg/μL)稀釋至150 μL，輕輕吹打混勻，室溫靜置5 min后混合，再次吹打混勻后室溫靜置15 min。將混合液緩緩加入6孔板中，搖勻，37℃培養(yǎng)過夜，24 h后更換新鮮培養(yǎng)基并在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況并拍照。

1.5 流式細(xì)胞分選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，棄培養(yǎng)基并用PBS洗細(xì)胞兩次后用胰酶消化，200×離心5 min，棄上清，PBS洗一次，棄上清，用600 μL PBS重懸，經(jīng)孔徑為40 μm的細(xì)胞網(wǎng)篩篩入流式管中，分選GFP陽性較強(qiáng)的部分細(xì)胞。使用單細(xì)胞模式直接分選到96孔板，每孔1個細(xì)胞，96孔板中預(yù)加200 μL培養(yǎng)基(新鮮培養(yǎng)基和舊培養(yǎng)基1∶1混合后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后使用)。另外使用富集模式分選一管用于基因組DNA提取和T7E1實驗。

1.6 T7E1實驗

T7核酸內(nèi)切酶1 (T7E1)可以識別DNA上的莖環(huán)結(jié)構(gòu)并切開DNA雙鏈，即由基因編輯產(chǎn)生的含有雜交異源雙鏈DNA，酶切產(chǎn)物中包括擴(kuò)增主帶以及酶切形成的兩條較小的DNA條帶，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離3條大小不一的條帶，即可根據(jù)亮度估算CRISPR/Cas9的編輯效率。提取分選后的細(xì)胞的基因組DNA，設(shè)計包含突變位點(diǎn)且不位于擴(kuò)增片段中央的擴(kuò)增長度約500 bp的PCR引物(表3)并進(jìn)行擴(kuò)增，用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化。純化后的PCR產(chǎn)物經(jīng)變性和退火后即可形成異源雙鏈DNA，在經(jīng)變性退火的產(chǎn)物中加入0.5 μL T7E1酶，37℃水浴30 min。在新鮮配置的10% PAGE膠中120 V恒壓電泳90 min。電泳結(jié)束后小心取出PAGE膠，EB溶液染色15 min后用蒸餾水洗3次，置于凝膠成像儀中拍照，反色后用ImageJ軟件計算每個條帶的灰度，根據(jù)公式：突變率=1-[c/(a+b+c)]0.5(其中a，b，c分別為峰面積，c為最大峰面積)估算切割效率。

表3 T7E1酶切實驗所用引物

1.7 單克隆培養(yǎng)和鑒定

分選至96孔板的細(xì)胞培養(yǎng)7 d后在顯微鏡下觀察形態(tài)和狀態(tài)。選取只有單個細(xì)胞團(tuán)的孔的細(xì)胞進(jìn)行傳代并擴(kuò)大培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞形成一個單克隆細(xì)胞團(tuán)時棄去培養(yǎng)基，用PBS洗兩遍后加入20 μL胰酶消化，終止消化后吹散并轉(zhuǎn)移至48孔板再擴(kuò)大培養(yǎng)，以此類推。在從48孔板向24孔板轉(zhuǎn)移時取少量細(xì)胞提取基因組DNA，擴(kuò)增含有突變位點(diǎn)的片段并克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化涂板，培養(yǎng)過夜后挑單克隆進(jìn)行測序鑒定基因型。

1.8 Western blot檢測

將細(xì)胞接種于六孔板中，待生長至匯合度達(dá)到約90%時，棄培養(yǎng)基并用PBS洗2遍，加入100 μL含有1 mmol/L PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液中，冰上裂解2 min后收集懸液至1.5 mL離心管中。加入5×SDS Loading Buffer，100℃水浴10 min，14000×離心5 min，在12%濃度分離膠的SDS-PAGE膠中電泳。電泳結(jié)束后小心剝下凝膠，采用半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫封閉1 h，4℃孵育一抗過夜。孵育完畢用TBST洗膜3次，隨后室溫孵育二抗1 h，孵育完畢用TBST洗膜3次，采用ECL法在化學(xué)發(fā)光自顯影儀檢測蛋白條帶并拍照。

1.9 6-TG毒性實驗

將細(xì)胞接種于6孔板中傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)期時，加入6-TG至終濃度為5 μL/mL，48 h后在顯微鏡白光下觀察細(xì)胞狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 gRNA的活性鑒定

將構(gòu)建成功的5個pX458-gRNA載體分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞并提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增切割位點(diǎn)兩側(cè)片段，通過T7E1實驗檢測gRNA對基因相應(yīng)位點(diǎn)的切割活性。另將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化涂板并過夜培養(yǎng)，16 h后在各板上挑選50個單克隆測序，以鑒定gRNA的實際切割效率。T7E1實驗結(jié)果顯示5條gRNA均表現(xiàn)出切割活性，活性分別為21.2%、27.6%、31.2%、29.8%和35.2% (圖2A)。靶位點(diǎn)測序結(jié)果表明，151位點(diǎn)的gRNA有約31.7%的切割活性，對于508位點(diǎn)，活性最高的一條gRNA是3號gRNA，其切割活性達(dá)到約30.2% (圖2B)。后續(xù)的基因定點(diǎn)突變實驗選用以上兩條gRNA進(jìn)行。

2.2 流式分選富集HPRT1基因點(diǎn)突變細(xì)胞

將pX458-gRNA載體和對應(yīng)位點(diǎn)的ssODN共轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察帶有綠色熒光的細(xì)胞并拍照(圖3A)。繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到90％以上進(jìn)行流式分析，結(jié)果表明pX458-508gRNA3和pX458-151gRNA的陽性率分別為41.0%和38.5% (圖3B)。對兩個樣品分別將熒光強(qiáng)度最強(qiáng)的24.5%和21.4%的細(xì)胞分選出來用于提取基因組DNA，同時提取未經(jīng)分選的細(xì)胞基因組DNA，通過T7E1實驗和靶位點(diǎn)測序結(jié)果分析對比分析兩者基因組DNA發(fā)生編輯的效率。經(jīng)分選的細(xì)胞用T7E1和各自通過ssODN引入的酶切位點(diǎn)的酶，其酶切條帶亮度都更高于未分選的細(xì)胞，灰度掃描結(jié)果顯示，c.508位點(diǎn)的T7E1酶切和Ⅲ酶切DNA量分別提高了1.5倍和4倍，c.151位點(diǎn)的T7E1酶切和Ⅰ酶切DNA量分別提高了2.4倍和1.5倍(圖3C)。說明經(jīng)流式分選后的細(xì)胞群表現(xiàn)了更強(qiáng)的DNA雙鏈切割效率和更高的基因組DNA重組效率。與酶切實驗結(jié)論相同，靶位點(diǎn)測序結(jié)果也證明經(jīng)過流式分選富集后的細(xì)胞，其總體突變效率和基因組DNA發(fā)生重組的概率都高于未分選的細(xì)胞，c.508位點(diǎn)分選前的點(diǎn)突變和總體突變率分別為2.0%和32%，經(jīng)分選后分別提高到16.3%和56.3%，c.151位點(diǎn)分選前的點(diǎn)突變和總體突變率分別為2.22%和28.9%，分選后分別提高到10%和56.7% (圖3D)。

圖2 gRNA活性檢測和切割效率驗證

A：T7E1實驗（紅色箭頭示T7E1酶切條帶）；B：靶位點(diǎn)測序結(jié)果比對（紅色字體示gRNA識別序列，黑色加粗字體示PAM位點(diǎn)）。

2.3 HPRT1基因點(diǎn)突變單克隆細(xì)胞株構(gòu)建

重新將pX458-508gRNA3和pX458-151gRNA與相應(yīng)的ssODN分別共轉(zhuǎn)到HEK293T細(xì)胞和HeLa細(xì)胞，48 h后以單細(xì)胞模式分選到96孔板，待細(xì)胞形成單克隆(圖4A)時進(jìn)行傳代擴(kuò)大培養(yǎng)。細(xì)胞擴(kuò)大到24孔板時收集部分細(xì)胞提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增含有靶位點(diǎn)的片段，對PCR產(chǎn)物直接測序。選擇目標(biāo)位點(diǎn)出現(xiàn)雙峰且雙峰包括基因突變后的T堿基的細(xì)胞株(圖4B)，將其PCR產(chǎn)物純化并連接T載體，轉(zhuǎn)化涂板，過夜培養(yǎng)后挑取10個菌落單克隆測序，以鑒定該單克隆細(xì)胞株的基因型(圖4C)。c.508位點(diǎn)基因編輯的HEK293T細(xì)胞最終得到43個正常增殖的單克隆細(xì)胞株，其中3個克隆(#1、#2和#3)的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在靶位點(diǎn)顯示雙峰。細(xì)胞單克隆靶位點(diǎn)測序結(jié)果顯示：#1單克隆細(xì)胞株的靶位點(diǎn)測序的10個菌落單克隆中有3個發(fā)生了定點(diǎn)突變，7個為野生型，因HEK293T細(xì)胞含有3條X染色體[7]，故可認(rèn)為的一個等位基因發(fā)生了c.508C>T突變，另外兩個等基因未發(fā)生編輯，仍為野生型；#2單克隆細(xì)胞株的靶位點(diǎn)測序的10個菌落單克隆中有7個發(fā)生了定點(diǎn)突變，3個在切割位點(diǎn)下游發(fā)生一段長為27 bp的DNA片段插入，該插入片段在原讀碼框下游8個氨基酸處引入了一個終止密碼子(TGA)，該條染色體的轉(zhuǎn)錄本也會使蛋白翻譯提前終止，推測該株細(xì)胞的3個等位基因中2個發(fā)生了定點(diǎn)突變，另一個等位基因發(fā)生翻譯提前終止的突變，該株細(xì)胞近似看作翻譯提前終止的純合細(xì)胞株；#3單克隆細(xì)胞株的靶位點(diǎn)測序的10個菌落單克隆中有3個發(fā)生了定點(diǎn)突變，3個為野生型，4個發(fā)生了17 bp的刪除突變，該刪除突變造成移碼，突變位點(diǎn)的第4個密碼子為TAA，同樣造成翻譯提前終止，推測該株細(xì)胞的3個等位基因的2個發(fā)生了預(yù)期的定點(diǎn)突變和刪除突變，1個為野生型(圖4C，表4)。c.151位點(diǎn)突變的HeLa細(xì)胞最終得到60個正常增殖的細(xì)胞株，其中2個克隆(#4和#5)的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在靶位點(diǎn)顯示雙峰。細(xì)胞單克隆測序結(jié)果顯示：#4單克隆細(xì)胞株的靶位點(diǎn)測序的10個菌落單克隆中5個為野生型，5個同時發(fā)生了C>T和GA>AC突變，該株細(xì)胞為定點(diǎn)突變的雜合子；#5單克隆細(xì)胞株的靶位點(diǎn)測序的10個菌落單克隆中10個單克隆中4個同時發(fā)生了C>T和GA>AC突變，6個僅發(fā)生GA>AC突變，使該處由谷氨酸突變?yōu)樘K氨酸，但不影響該條染色體轉(zhuǎn)錄合成完整的HPRT1肽鏈，該株細(xì)胞同樣視為定點(diǎn)突變的雜合子(圖4C，表4)。

圖3 流式分選富集GFP陽性細(xì)胞提高突變頻率和重組效率

A：轉(zhuǎn)染24 h后熒光拍照；B：流式分選較強(qiáng)GFP陽性細(xì)胞；C：酶切實驗(US: unsorted；S: sorted；T: T7E1 cleaved；N:Ⅲ cleaved；B:Ⅰ cleaved；M: 100 bp DNA marker)；D：流式分選前后靶位點(diǎn)測序結(jié)果對比。

圖4 細(xì)胞單克隆基因型鑒定

A：細(xì)胞單克隆左：HEK29T細(xì)胞，508位點(diǎn)；右：HeLa細(xì)胞，151位點(diǎn))；B：PCR產(chǎn)物測序結(jié)果；C：細(xì)胞單克隆T-A克隆測序結(jié)果（紅色字體示gRNA識別序列，黑色加粗字體示PAM位點(diǎn)，綠色字體示ssODN引入的無義突變）。

表4 單克隆細(xì)胞基因型鑒定

2.4 Western blot驗證突變株的HPRT1蛋白表達(dá)情況

培養(yǎng)上述5株細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行Western Blot實驗，使用抗原結(jié)合位點(diǎn)為HPRT1蛋白N端序列的抗體，以野生型細(xì)胞為對照，檢測基因突變的細(xì)胞株的HPRT1蛋白表達(dá)情況。在508位點(diǎn)突變的HEK293T細(xì)胞株中，#1細(xì)胞克隆可以正常表達(dá)大小為25 kDa的完整的HPRT1蛋白，3條染色體均發(fā)生轉(zhuǎn)錄提前終止的#2細(xì)胞克隆則完全不表達(dá)正常的HPRT1蛋白，2條X染色體發(fā)生翻譯提前終止的#3細(xì)胞克隆的HPRT1蛋白表達(dá)量明顯下降。另外，在預(yù)期的17 kDa位置未檢測到翻譯提前終止產(chǎn)生的截短的蛋白。在151位點(diǎn)突變的2個HeLa細(xì)胞株中，HPRT1蛋白表達(dá)量均下調(diào)，同樣地，在預(yù)期的5 kDa的位置也未檢測到截短的蛋白條帶(圖5A)。這表明兩種突變可能意味著嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶功能的完全喪失。

2.5 6-TG實驗檢測突變株的次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性

6-TG是一種嘌呤類似物，經(jīng)HPRT1酶催化可以在DNA復(fù)制過程中摻入DNA雙鏈中，誘導(dǎo)DNA的雙鏈斷裂，破壞DNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性并產(chǎn)生細(xì)胞毒性?；虻墓δ苋毕輹贵w外培養(yǎng)的細(xì)胞能夠抵抗6-TG的毒性從而在含有6-TG的培養(yǎng)基中正常存活。因此6-TG實驗是一種普遍使用的篩選突變細(xì)胞的方式。在細(xì)胞達(dá)到對數(shù)生長期時加入6-TG繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，光鏡下可見，5株細(xì)胞中僅有#2細(xì)胞克隆可以存活，其他4株細(xì)胞均大量死亡，這表明僅有#2細(xì)胞克隆由于完全不表達(dá)正常的HPRT1蛋白，所以幾乎完全喪失了HPRT1蛋白的次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性，其他4株細(xì)胞由于仍能表達(dá)少量的HPRT1蛋白，其次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性未完全喪失，因而導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖5B)。

圖5 Western blot和6-TG實驗結(jié)果

A：Western blot結(jié)果。HPRT1蛋白僅在1條等位基因翻譯提前終止的#1細(xì)胞株中正常表達(dá)，其他4株細(xì)胞中都不能正常表達(dá)，且在預(yù)測的可能出現(xiàn)截短肽鏈的位置均未能檢測到截短的肽鏈；B：6-TG實驗結(jié)果。僅全部HPRT1等位基因翻譯提前終止的#2細(xì)胞株可以在添加6-TG的培養(yǎng)體系中存活，其他4株細(xì)胞都死亡。

3 討論

本研究針對基因，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合流式細(xì)胞分選的富集手段，成功進(jìn)行了c.508C>T和c.151C>T的點(diǎn)突變，經(jīng)流式分選后細(xì)胞總體的突變頻率從2%提高到了10%~20%，說明流式分選富集GFP陽性細(xì)胞是一種有效的篩選和提高突變頻率的手段。此外，在對c.151位點(diǎn)進(jìn)行突變時，本研究同時突變了其gRNA對應(yīng)的PAM序列，T-A克隆測序結(jié)果表明：#5細(xì)胞克隆的10個T-A克隆產(chǎn)物均發(fā)生了GA>AC的突變，僅有4個單克隆出現(xiàn)了C>T的突變。這可能是由于DNA雙鏈斷裂修復(fù)中HDR的效率受位點(diǎn)與DSB位點(diǎn)的距離有關(guān)，在更靠近DSB位點(diǎn)的位置上HDR的效率更高[8]。本研究對這些突變的細(xì)胞株進(jìn)行了Western blot實驗檢測其HPRT1蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)除了3個位于不同X染色體上的等位基因全部發(fā)生翻譯提前終止突變的508位點(diǎn)#2號細(xì)胞克隆株完全不表達(dá)HPRT1蛋白以外，其余4個雜合的突變細(xì)胞株均表達(dá)部分正常的HPRT1蛋白。但在翻譯提前終止的#3細(xì)胞克隆、#5細(xì)胞克隆中未檢測到被截短的肽鏈，說明這兩個位點(diǎn)的翻譯提前終止突變導(dǎo)致了最終細(xì)胞內(nèi)該蛋白水平的降低甚至完全消失，而不是存在具有部分次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶功能的蛋白質(zhì)殘基，推測這可能是由于真核生物廣泛存在的無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)機(jī)制的存在，由于突變引入了一個新的提前終止密碼子，引起Upf蛋白復(fù)合物識別并降解了突變的mRNA序列[9,10]。與此同時，只有508位點(diǎn)的#2細(xì)胞克隆能在含有6-TG的培養(yǎng)基中存活，由此推測HPRT1蛋白的翻譯提前終止導(dǎo)致不能正常而穩(wěn)定地表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)次黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶活性幾乎完全消失，是該位點(diǎn)突變導(dǎo)致嚴(yán)重的Lesch-Nyhan疾病的主要原因。

基因定點(diǎn)突變細(xì)胞模型的建立可為今后建立其他HPRT1基因突變的細(xì)胞系或動物模型提供借鑒，為深入研究Lesch-Nyhan致病機(jī)制提供基礎(chǔ)。

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Generation of cell strains containing point mutations inby CRISPR/Cas9

Kai Zhang, Wei Liu, Xiaofeng Liu, Yaosheng Chen, Xiaohong Liu, Zuyong He

Mutations in Hypoxanthine-guanine Phosphoribosyltransferase1 () gene can lead to metabolic disorder of hypoxanthine and guanine metabolism, and other severe symptoms such as hypophrenia, gout, and kidney stones, called the Lesch-Nyhan disease (LND). Although the mutations are widely distributed throughout thegene, there are some isolated hot spots. In this study, we aim to introduce two previously reported hot spots, c.508 C>T and c.151 C>T, which could lead to premature translational termination ingene. Through CRISPR/Cas9 mediated homology-directed repair (HDR) by using single-stranded oligo-deoxyribonucleotides (ssODN) as donor template, we obtained cell clones containing these two mutations in HEK293T or HeLa cells. Targeted mutation of c.508 C>T and c.151 C>T reached to 16.3% and 10%, respectively. We further detect HPRT1 protein levels with Western blot and enzyme activity with 6-TG in 5 different cell clones. HPRT1 protein and its enzymatic activity both was hardly detected in homozygous mutant cells, while reduced HPRT1 protein expression and enzymatic activity was detected in heterozygous mutant cells. Our study will be beneficial to those who working on generation of cell or animal models of HRPT1 mutations, and provides a basis for further investigations on the genetic mechanism of Lesch-Nyhan disease.

CRISPR/Cas9;; site-directed mutagenesis

2019-05-27;

2019-06-28

國家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(編號：2016ZX08006003-006)和廣東省重點(diǎn)領(lǐng)域研發(fā)計劃項目(編號：2018B020203003)資助[Supported by the National Transgenic Major Program (No. 2016ZX08006003-006) and the Key R&D Program of Guangdong Province (No. 2018B020203003)]

張楷，碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: zhangk48@mail2.sysu.edu.cn

劉蔚，碩士研究生，專業(yè)方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)。E-mail: 1119035661@qq.com

張楷和劉蔚并列第一作者。

何祖勇，博士，副教授，研究方向：動物遺傳與育種。E-mail: zuyonghe@foxmail.com

10.16288/j.yczz.19-108

2019/7/9 17:03:42

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20190709.1702.002.html

(責(zé)任編委: 吳強(qiáng))