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    性別分子標(biāo)記在毛花獼猴桃中的通用性驗證

    2021-05-16 02:18:18呂正鑫廖光聯(lián)黃春輝賈東峰徐小彪
    關(guān)鍵詞:毛花雄株雌雄

    呂正鑫,劉 青,廖光聯(lián),2,黃春輝,賈東峰,徐小彪,2*

    (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院∕獼猴桃研究所,江西南昌 330045;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,江西南昌 330045)

    【研究意義】毛花獼猴桃(Actinidia erianthaBenth.)為獼猴桃科(Actinidiaceae)獼猴桃屬(Actinidia)雌雄異株的多年生藤本果樹,作為我國特有的獼猴桃種質(zhì)資源,在長江以南200~1 000 m海拔處的山區(qū)廣泛分布[1]。目前世界獼猴桃的主栽品種比較單一,隨著獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,消費水平的升級,培育新的栽培品種具有重要意義[2]。毛花獼猴桃果實維生素C含量為中華獼猴桃的3~4倍[3],且具有抗逆性強、富含礦物質(zhì)及風(fēng)味好、口感佳等優(yōu)點,有巨大的發(fā)展?jié)摿?,是潛在的?yōu)質(zhì)獼猴桃種質(zhì)資源選育的新品種[4]。雌雄異株現(xiàn)象在果樹作物中普遍存在,植株自身的經(jīng)濟價值往往因性別的差異而有很大不同。從形態(tài)學(xué)上看,獼猴桃科(Actinidiaceae)為功能性雌雄異株植物,目前生產(chǎn)上以雌株果實產(chǎn)生經(jīng)濟價值,其經(jīng)濟價值明顯高于雄株,雄株在生產(chǎn)上多作為授粉配對用樹,雖然雄花的花青苷含量較高、花色明艷、具有一定觀賞價值,但現(xiàn)階段毛花獼猴桃的育種工作仍集中在優(yōu)質(zhì)雌株的選育方面。獼猴桃實生育種過程中童期較漫長,一般為5~7 a[5],雌雄異株和幼苗期的性別很難分辨,對品種改良和育種工作造成阻礙。因此,對幼苗早期性別鑒定技術(shù)的研究將在極大程度上節(jié)約育種成本并縮短育種周期,在生產(chǎn)和遺傳育種上都有重要意義。【前人研究進(jìn)展】前人嘗試?yán)眯螒B(tài)學(xué)[6]、生理生化[7]和同工酶[8]等方法鑒別獼猴桃的性別,但常因環(huán)境因素的影響導(dǎo)致結(jié)果準(zhǔn)確度不高,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,利用分子標(biāo)記技術(shù)在基因?qū)用骅b定親緣關(guān)系的方法越來越受到學(xué)者們的青睞。SSR(simple sequence repeat)分子標(biāo)記以個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ),可直接反映出生物個體遺傳變異,可以檢測出生物個體之間在核苷酸序列水平上的差異[9],極大降低了環(huán)境因素的干擾,目前已在遺傳多樣性分析、指紋圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等各個方面有廣泛的應(yīng)用[10],在獼猴桃等雌雄異株植物中可有效鑒定早期性別。目前,在開發(fā)獼猴桃屬植物性別鑒定分子標(biāo)記的研究上取得了一些進(jìn)展,但暫未有毛花獼猴桃上的相關(guān)報道。使用山梨獼猴桃(Actinidia rufa)和中華獼猴桃(Actinidia chinensisPlanch.)原變種的種間雜交后代F1群體進(jìn)行試驗,在174個F1代個體中進(jìn)行驗證,利用RAD-seq技術(shù)開發(fā)的SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記,最終篩選出A001、A002和A003這3個有較好特異性的分子標(biāo)記;A001為雌性特異標(biāo)記,具有較高的鑒定準(zhǔn)確性;A002和A003在雌、雄個體中均具有良好的差異性及多態(tài)性,可用于植株性別的鑒定;A003能夠區(qū)分山梨獼猴桃和中華獼猴桃原變種;組合使用A001和A002這2個標(biāo)記可有效鑒定中華獼猴桃和山梨獼猴桃性別[11]。UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408為‘和平紅陽’獼猴桃上篩選出的在雌、雄株上表現(xiàn)出良好的差異性及多態(tài)性的SSR標(biāo)記,其多態(tài)性百分比均在88.9%以上,可鑒定植株性別[12]。

    【本研究切入點】目前標(biāo)記A001、A002和A003不僅在前人研究所涉及的材料中進(jìn)行了應(yīng)用驗證,在其它品種如軟棗獼猴桃上也已進(jìn)行了通用性驗證[13],其余標(biāo)記目前尚未有在其它栽培種類上的通用性驗證?!緮M解決的關(guān)鍵問題】目前關(guān)于毛花獼猴桃性別標(biāo)記的報道較少,本試驗利用已知性別的野生毛花獼猴桃種質(zhì)資源作為材料,旨在探討A001、A002、A003和UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404、UDK97-408兩組分子標(biāo)記在毛花獼猴桃性別鑒定中的通用性,以期為毛花獼猴桃育種群體的早期性別分子鑒定提供快捷、高效的方法,優(yōu)化生產(chǎn)上早期的雌雄配比,加快育種進(jìn)程。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    試驗于2018—2019年進(jìn)行,材料來自江西省麻姑山,采用已知性別的毛花獼猴桃樣品10份(雌、雄各5株)。選擇標(biāo)準(zhǔn)為樹勢較強、生長結(jié)果正常的成齡植株,采下其一年生枝蔓上的幼嫩葉片置于冰盒,隨后立即帶回實驗室,轉(zhuǎn)移至裝滿吸水硅膠的自封袋中,充分脫水干燥后保存待用。

    1.2 標(biāo)記來源

    A001、A002及A003來自Zhang等,UDK96-009、UDK96-013、UDK96-019、UDK97-404及UDK97-408來自楊妙賢等,所用引物由上海生工生物工程有限公司合成提供,引物信息具體見表1。

    1.3 DNA提取

    使用北京華越洋生物科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA快速提取試劑盒,改良后的CTAB法提取DNA,選取獼猴桃雌雄株幼嫩葉片,放入自封袋中用硅膠充分脫水干燥,稱取葉片100~200 mg,用磨樣機研磨至細(xì)粉狀。具體提取步驟均參照試劑盒說明書進(jìn)行。所得DNA使用紫外分光計進(jìn)行檢測,并配合1%(ω)瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質(zhì)量及完整性是否合格。將模板DNA質(zhì)量濃度稀釋至20 ng∕mL,保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 PCR擴增

    PCR擴增程序:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,47~64 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共28~34個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min于12 ℃保存。對不同引物的退火溫度進(jìn)行多次檢驗,篩選出最佳退火溫度,以期每個標(biāo)記所對應(yīng)的產(chǎn)物中能產(chǎn)生清晰且長度一致的多態(tài)性條帶。PCR擴增產(chǎn)物采用8%(ω)非變性PAGE電泳,快速銀染法對條帶進(jìn)行檢測,拍照記錄后進(jìn)行分析。

    表1 8個獼猴桃性別標(biāo)記引物信息Tab.1 Information of eight kiwifruit gender marker primers

    2 結(jié)果與分析

    2.1 A001、A002和A003標(biāo)記在毛花獼猴桃樣品中的驗證結(jié)果

    A001和A002 2個標(biāo)記在10個已知性別的毛花獼猴桃雌雄樣品基因組DNA中的擴增結(jié)果顯示,在A001和A002的擴增產(chǎn)物中均出現(xiàn)了多態(tài)性條帶,但并未在雌雄株之間發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律,即2個標(biāo)記對毛花獼猴桃種質(zhì)資源均未能表現(xiàn)出性別特異性(圖1a);對A003標(biāo)記的擴增結(jié)果進(jìn)行觀測分析,未能檢測出清晰的多態(tài)性條帶(圖1b)。

    圖1 A001、A002和A003標(biāo)記的驗證結(jié)果Fig.1 The outcome of A001,A002 and A003

    2.2 UDK96-009、UDK96-013等5個標(biāo)記在毛花獼猴桃樣品中的驗證結(jié)果

    在對毛花獼猴桃基因組DNA擴增最適退火溫度的多次檢驗后,UDK96-009標(biāo)記均無法檢測出清晰的多態(tài)性條帶,結(jié)果與A003標(biāo)記結(jié)果類似,無良好多態(tài)性;UDK96-013和UDK96-019標(biāo)記的擴增產(chǎn)物中均出現(xiàn)了多態(tài)性片段,但并未在雌雄株之間發(fā)現(xiàn)明顯的規(guī)律,即2個標(biāo)記對毛花獼猴桃種質(zhì)資源均未能表現(xiàn)出性別特異性(圖2a);UDK97-404和UDK97-408標(biāo)記分別在退火溫度為52 ℃和64 ℃時部分樣品擴增出少量多態(tài)性條帶(圖2b),無良好多態(tài)性。

    圖2 UDK96-013、UDK96-019和UDK97-404、UDK97-408標(biāo)記的驗證結(jié)果Fig.2 The outcome of UDK96-013,UDK96-019 and UDK97-404,UDK97-408

    3 討論

    對獼猴桃早期性別鑒定方法的研究在實踐中有重要意義,作為雌雄異株的經(jīng)濟作物,獼猴桃雌株產(chǎn)生的經(jīng)濟價值往往遠(yuǎn)高于雄株,但因其童期較長且到達(dá)豐產(chǎn)的成熟期過長[5],導(dǎo)致早期雌、雄株很難分辨,所以在生產(chǎn)上合理配置雌雄個體對提高產(chǎn)量及經(jīng)濟效益顯得尤為關(guān)鍵。毛花獼猴桃的雄株相較于其它品種獼猴桃雄株不僅具有授粉的傳統(tǒng)作用,更具有花色艷麗、花青素含量高的特點[14],在實際生產(chǎn)中可作為觀賞花推廣,其花瓣中富含的花青素在抗氧化、抗癌及預(yù)防慢性代謝性疾病等方面有著良好的功效[15]。王金碩等[16]在對雄性軟棗獼猴桃的研究發(fā)現(xiàn),合理配置雄株具有確保產(chǎn)量、增加果實大小、減少畸形果和提高果實品質(zhì)等優(yōu)點,所以合理配置雄株,可進(jìn)一步提高其經(jīng)濟價值。

    目前對獼猴桃性別鑒定的方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生理生化、同工酶鑒定和DNA分子標(biāo)記等。形態(tài)學(xué)鑒定主要通過對生殖器官的研究進(jìn)而區(qū)分雌雄株,觀察雌雄株獨有的器官或觀察其在發(fā)育過程中的獨特變化進(jìn)而判斷性別,對軟棗獼猴桃和狗棗獼猴桃的生殖器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)解剖,發(fā)現(xiàn)其雌花中的雄蕊退化,雄花中的雌蕊退化,但總體上雌花與雄花在表型上非常相似[17];軟棗獼猴桃雌株葉痕間距和皮孔密度顯著大于雄株,而枝條顏色、橫切解剖結(jié)構(gòu)、葉柄粗細(xì)長短和葉縱橫徑之比均未出現(xiàn)顯著差異[6]。生理生化是以雌雄植株在新陳代謝、特異蛋白質(zhì)和生理指標(biāo)等方面所體現(xiàn)出的差異為依據(jù),對差異的分析鑒定雌雄株性別的一種方法,李旭等[6]通過BTB法、TTC法和總酚含量測定等方法,測定軟棗獼猴桃雌雄株在生理生化上的差異,在蘆筍[18]、栝樓[19]、楊梅[20]和復(fù)葉槭樹[21]等植物上有相似結(jié)果,但這些方法目前只應(yīng)用在成熟植株上,對童期植株是否使用還有待進(jìn)一步研究。同工酶屬于分子水平的指標(biāo),雌雄株間的某些本質(zhì)差異可以通過其得以表現(xiàn),這種方法通過對組織、發(fā)育及物種之間的特異性的檢測分析,找出編碼相應(yīng)酶的等位基因間的差異[22],因此同工酶是基因差異在表達(dá)水平的體現(xiàn)。如陳曉玲等[23]采用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),對6個獼猴桃品種雌雄株的酯酶同工酶和過氧化物酶進(jìn)行檢測分析后發(fā)現(xiàn),兩者在不同獼猴桃品種中均存在一定差異,但對雌雄株進(jìn)行酶譜分析時無特征條帶出現(xiàn),同工酶在鑒別獼猴桃性別的研究上目前依舊主要集中在成熟植株上,童期植株的適用性鮮有研究。DNA分子標(biāo)記(DNA molecular markers)是DNA水平遺傳變異的直接反映,與其它方法相比,具有采樣要求低、測定結(jié)果易標(biāo)準(zhǔn)化和鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點[24],目前RAPD、SCAR和AFLP等DNA分子標(biāo)記常被用于獼猴桃性別鑒定研究,通過PCR技術(shù)與群體分離分析方法(Bulked Segregant Analysis,BSA)的結(jié)合,可在早期對雌雄異株植物的性別進(jìn)行鑒定,其方法是根據(jù)目標(biāo)性狀將分離群體分為2組,構(gòu)建在目標(biāo)基因區(qū)段存在差異的2個基因混合池,提取基因池中DNA作為模板進(jìn)行RAPD分析,2個基因混合池間多態(tài)性有差異的標(biāo)記與目的基因必定產(chǎn)生關(guān)聯(lián),Gill等[25]使用該方法開發(fā)出可用于鑒定中華獼猴桃原變種為親本的3個家系(包括親本及其產(chǎn)生的F1代)的SmY1和SmX,在馬尾藻、巨體舌魚和黃連木的性別鑒定研究中均有應(yīng)用這種BSA混池測序技術(shù),有較好的通用性。通過RAD-seq基因圖譜技術(shù)得到了本試驗所使用的A001、A002和A003這3個SSR分子標(biāo)記,該技術(shù)能有效檢測DNA多態(tài)性,且可對基因組序列尚不清楚的物種進(jìn)行檢測,大多數(shù)模式生物及部分非模式生物都有應(yīng)用,如開心果和西瓜等。除本試驗中所選用的8個標(biāo)記,已開發(fā)出可用于鑒定中華獼猴桃原變種和美味獼猴桃原變種植株性別的RAPD標(biāo)記S1032-850,但其尚未轉(zhuǎn)化為相對更穩(wěn)定、準(zhǔn)確率更高的SCAR標(biāo)記[26],所以本文并未對其在毛花獼猴桃中的通用性進(jìn)行驗證。

    目前對獼猴桃性別鑒定方法的研究主要集中于上述幾種方法,隨著分子研究技術(shù)的不斷進(jìn)步,對性別分化相關(guān)基因的研究不斷深入,性別鑒定的研究深度便捷度、和準(zhǔn)確度都有了很大的提升。植物體中的微RNA(microRNA miRNA)長約21 nt,通過轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控的方式參與調(diào)節(jié)多種植物發(fā)育和內(nèi)外應(yīng)答反應(yīng),如花器官發(fā)育和花的性別分化等[27]。近年來,基于miRNA深度測序研究基因功能已在木瓜[28]、玉米[29]和楊樹[30]等多種植物之中都有應(yīng)用。閆明科等[31]運用高通量測序技術(shù)及生物信息學(xué)進(jìn)行分析,對獼猴桃雌、雄花中表達(dá)的小RNA(sRNA)進(jìn)行鑒定,得出其中進(jìn)化上保守的miRNA,推測出新的雌、雄花特異miRNA,篩選出一批差異表達(dá)的miRNA并預(yù)測了其靶基因,從遺傳學(xué)角度為獼猴桃雌、雄株的性別分化研究奠定基礎(chǔ)[31]。但有研究表明,植物的性別并不絕對取決于其遺傳因子,植物激素和表觀遺傳修飾等因素也在一定程度上產(chǎn)生影響,因素之間相互獨立又共同作用,在以花為主的被子植物生殖器官表型上這些因素的作用結(jié)果得到表現(xiàn),使得性別表型產(chǎn)生多樣性。獼猴桃染色體倍性復(fù)雜,如中華獼猴桃主要為二倍體和四倍體[32],美味獼猴桃倍性較多,有四倍體、五倍體和六倍體[33],毛花獼猴桃?guī)缀蹙鶠槎扼w[34]。從遺傳學(xué)角度來看,獼猴桃雜交后代群體的性別分化符合XY型性染色體性別決定系統(tǒng)[35];對核型的進(jìn)一步觀察[36]和多基因連鎖圖譜的構(gòu)建[37],發(fā)現(xiàn)中華獼猴桃的XY染色體的長度及外觀形態(tài)非常類似,在被子植物性染色體進(jìn)化的六個時期中[38]的第二個時期,Y染色體上的亞端粒部位存在某些性別決定位點不能與X染色體自由重組,而這些缺乏重組的位點正是性別決定部位的特點[39],同時在原始Y染色體上有一個小的雄性特異區(qū)形成,并且出現(xiàn)了全雄及全雌植株。據(jù)此發(fā)現(xiàn),獼猴桃的性別分化表現(xiàn)與蘆筍類似,認(rèn)為獼猴桃的性染色體應(yīng)處于進(jìn)化階段的第二個時期,此時Y染色體未能進(jìn)化完全,仍處于處于早期進(jìn)化階段。文中所使用的8個標(biāo)記均在中華獼猴桃原變種中得到驗證,但在毛花獼猴桃上不具通用性,推測與以上原因有關(guān),認(rèn)為毛花獼猴桃可能在性別特異區(qū)域位置或序列上與原文研究的獼猴桃品種有差異所導(dǎo)致。

    此外,在其它雌雄異株植物上也有諸多性別標(biāo)記的報道,如杜仲[40]、甜瓜[41]和柿[42]等都已開發(fā)出一系列用于鑒定性別的標(biāo)記。本文所使用的8對標(biāo)記均未有效鑒別出毛花獼猴桃的性別,分析認(rèn)為是獼猴桃性別決定符合孟德爾遺傳定律,表現(xiàn)為單基因控制的特點,但是現(xiàn)有研究仍然沒有找到獼猴桃性別決定相關(guān)的QTL。目前已有報道的的性別決定相關(guān)marker在獼猴桃屬不同種間存在局限性,因而,除了已報道的若干種外,其它獼猴桃種的性別鑒定需要開發(fā)新的分析標(biāo)記。隨著分子生物技術(shù)的不斷進(jìn)步,今后獼猴桃性別鑒定的研究也會更傾向于基因?qū)用?,但在探明其性別表型形成的機理之前,利用多種鑒別方法相結(jié)合進(jìn)行性別鑒定,可在育種早期高效、精準(zhǔn)的鑒定性別,可降低育種成本,加快田間育種進(jìn)度,在發(fā)育早期更合理的配置雌雄植株,降低不必要的損耗,更好更快地促進(jìn)育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,為實現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展做出保障。

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