糖耐量正常人糞樣微生物移植對胰島素抵抗小鼠糖脂代謝的影響

田滋潤， 王 燁， 韓 雪， 高 麗， 谷嬌嬌， 王曉曉， 李琳琳

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊 830011)

近年來，隨著與2型糖尿病相關(guān)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)2型糖尿病的發(fā)生除了受遺傳因素和多種環(huán)境因素共同誘導(dǎo)外，腸道菌群在2型糖尿病的發(fā)生中也起著重要作用。目前，大量研究表明，腸道菌群結(jié)構(gòu)的改變是引起肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病的主要原因之一[1-3]。隨著腸道微生物學(xué)研究的深入，糞樣微生物移植技術(shù)應(yīng)運而生。糞菌移植[4]是指通過將健康供體的腸道微生物移植到患病受體腸道內(nèi)，重建患病受體腸道微生態(tài)系統(tǒng)，從而達到實現(xiàn)治療疾病目的的一種技術(shù)手段。本課題組前期研究結(jié)果表明，糖耐量正常人糞樣共生菌液，對高脂飼養(yǎng)誘導(dǎo)的C57BL/6J胰島素抵抗小鼠具有防治作用。本研究在其基礎(chǔ)之上，通過制備糖耐量正常人糞樣共生菌液、菌懸液和無菌濾液，探究糖耐量正常人糞樣微生物移植在改善小鼠胰島素抵抗過程中，觀察腸道微生物、腸道微生物的代謝產(chǎn)物的作用，或兩者共同的作用。為糞菌移植在治療2型糖尿病的發(fā)病機制研究方面提供更堅實的基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物C57BL/6J小鼠，雄性，鼠齡6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，125只，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2016-0006，實驗動物質(zhì)量合格證:11400700307064。

1.2 儀器與試劑全自動酶標(biāo)儀(Multikan GO, Thermo)，離心機(MULTIFUEGX-3R,Thermo Fisher)，高壓蒸汽滅菌器(SANYO公司，型號：MLS-3750)，電子分析天平(賽多利斯天平有限公司)，膽固醇及甘油三酯測定試劑盒(中生北控生物科技股份有限公司，批號20180212)，血清胰島素ELISA試劑盒(英諾診斷有限公司)，96孔板(Labserv.Cat.No.310109008)，無水葡萄糖(天津盛奧化學(xué)，批號20170825)。

1.3 供體的選擇和供體糞樣的收集處理

1.3.1 樣本收集的倫理審核 供體糞便樣本的收集和動物實驗研究均通過了新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)(20130216-141)。

1.3.2 供體納入排除標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2.1 供體的納入標(biāo)準(zhǔn) 選取年齡18～40周歲，在其生活地區(qū)穩(wěn)定居住期超過10年的男性或女性，且具有長期健康的生活方式和良好的飲食習(xí)慣及規(guī)律的排便習(xí)慣。供體空腹血糖(FBG)≤5.6 mmol/L(101 mg/dL)，隨機血糖(GLU)≤11.1 mmol/L(200 mg/dL)或經(jīng)口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)后2 h FBG≤7.8 mmol/L(140 mg/dL)[5]。

1.3.2.2 供體的排除標(biāo)準(zhǔn) (1)孕婦、哺乳期婦女；(2)有精神病史，濫用藥物人群；(3)有手術(shù)及其他應(yīng)急情況人群；(4)近期服用抗菌素，甾體類藥物或微生態(tài)制劑人群；(5)有明顯肝腎功能損害，慢性腸胃功能紊亂，有腹瀉、膽道感染病史和腸炎等胃腸道疾病，血液系統(tǒng)或其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病人群；(6)需要胰島素治療或有酮酸中毒病史人群；(7)排除1型糖尿病、特殊類型糖尿病和妊娠糖尿病人群。

1.3.3 供體糞樣的收集 將收樣用無菌容器、肛拭子稱重后在高壓滅菌鍋121℃滅菌30 min，滅菌完成后，將無菌容器、肛拭子、冰袋、手套、放入泡沫盒中交與篩選合格的供體，并囑咐取樣事宜：早晨，使用肛拭子鏟取大便中末段，將新鮮糞便樣品收集到無菌容器中并密封容器，立即拿回實驗室，稱重記錄后，將樣品迅速轉(zhuǎn)入無菌生物安全柜[6-7]。

1.3.4 供體糞樣的處理

1.3.4.1 供體糞樣共生菌液的制備 參考糞菌移植Amsterdam規(guī)范和相關(guān)糞菌移植文獻[8-11]。稱取轉(zhuǎn)入無菌生物安全柜的樣品100 g，置于攪拌器中，加入500 mL無菌生理鹽水，并攪拌均勻，使其漿體首先通過不銹鋼濾網(wǎng)并過濾以除去大顆粒物質(zhì)，然后逐級透過不銹鋼濾網(wǎng)(2.0、1.0、0.5、0.25 mm孔徑)以除去糞液中未消化的食物和小微粒狀物質(zhì)，即得到糞樣共生菌液，用含20%無菌醫(yī)用甘油的生理鹽水將此溶液等比例稀釋，分裝至5 mL凍存管，封口膜封口，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱保存。

1.3.4.2 供體糞樣菌懸液的制備 將“1.3.3.1”步驟中得到的糞樣共生菌液分配到多個50 mL無菌離心管中，并以12 000 r/min離心10 min，離心后，將離心管下層的沉淀富集，將沉淀重懸浮于等體積0.9%氯化鈉溶液中，即得到糞樣菌懸液，用含20%無菌醫(yī)用甘油的生理鹽水將此溶液等比例稀釋，分裝至5 mL凍存管，封口膜封口，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱保存。

1.3.4.3 供體糞樣無菌濾液的制備 將“1.3.3.2”步驟中各離心管上層糞樣液體，轉(zhuǎn)移到無菌燒杯中，并通過抽濾裝置，(抽濾裝置中的一次性纖維素紙孔徑0.22 μm )抽濾2次，即得到糞樣無菌濾液，分裝至5 mL凍存管，封口膜封口，迅速轉(zhuǎn)移至-80℃低溫冰箱保存。

1.4 實驗方法

1.4.1 小鼠胰島素抵抗模型的建立 取6～8周齡18～22 g雄性C57BL/6J小鼠 125只，單籠單只飼養(yǎng)，環(huán)境為12 h/12 h光照和黑暗交替，正常飲食飲水，飼料為SPF級，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選擇10只繼續(xù)普通飼料飼養(yǎng)，為空白對照組(NCD)，余下115只進行高脂飼料飼養(yǎng)，即為高脂組。在高脂組飼養(yǎng)至8周末時，分別檢測每只小鼠的GLU, FBG, 總膽固醇(TC)和 甘油三酯(TG)水平，并對每組小鼠進行OGTT和胰島素耐量實驗(Insulin tolerance test , ITT)，收集每只小鼠的糞便樣本。

1.4.2 實驗動物的選取和分組 根據(jù)高脂組小鼠8周末ITT實驗數(shù)據(jù)，選出40 min血糖下降百數(shù)小于40%的小鼠，綜合其空腹血糖水平、隨機血糖水平、空腹血漿總膽固醇水平、空腹血漿甘油三酯水平、體質(zhì)量指標(biāo)，篩選出胰島素抵抗小鼠隨機分為選出52只胰島素抵抗小鼠，進行后續(xù)的治療實驗。將造模成功的小鼠隨機分為：高脂飲食組(High fat diet , HFD) 13只，高脂+供體糞樣共生菌液組(High fat diet+Donor fecal symbiotic bacteria liquid , HFD+DFSBL) 13只，高脂+供體糞樣菌懸液組(High fat diet+Donor fecal bacteria suspension , HFD+DFBS)13只 ，高脂+供體糞樣無菌濾液組(High fat diet+Donor fecal sterile filtrate, HFD+DFSF) 13只。

1.4.3 實驗動物檢測指標(biāo) 每組小鼠干預(yù)后，每周稱取體質(zhì)量，在糞菌干預(yù)8周末分別檢測小鼠的隨機血糖、空腹血糖、血漿總膽固醇和血漿甘油三酯水平，并進行口服葡萄糖耐量實驗。

2 結(jié)果

2.1 供體糞樣微生物移植對小鼠體質(zhì)量的影響實驗結(jié)果表明，與NCD組小鼠體質(zhì)量相比，HFD組小鼠體質(zhì)量在實驗的0到8周，均有顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與HFD組相比，HFD+DFBS組小鼠體質(zhì)量在實驗的4到8周開始得到控制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其他干預(yù)組小鼠體質(zhì)量與HFD組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果見表1。

表1 糞樣微生物移植對小鼠體質(zhì)量的影響

注: 與NCD組比較,***P<0.001。

2.2 供體糞樣微生物移植對小鼠血糖水平的影響

2.2.1 供體糞樣微生物移植對小鼠FBG的影響 第8周實驗結(jié)果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠FBG有顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與HFD組相比，HFD+DFSBL組和HFD+DFBS組小鼠FBG水平下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果如圖1(A)所示。

2.2.2 供體糞樣微生物移植對小鼠GLU的影響 第8周實驗結(jié)果表明，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠GLU均有顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與HFD組相比，HFD+DFSBL組、HFD+DFBS組和HFD+DFSF組小鼠GLU在實驗8周上升趨勢得到控制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果如圖1(B)所示。

2.2.3 供體糞樣微生物移植對小鼠OGTT的影響 第8周實驗結(jié)果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠OGTT曲線下面積，有較明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與HFD組相比，HFD+DFSBL組和HFD+DFBS組小鼠OGTT曲線下面積較明顯得到控制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001～0.01)。HFD+DFSF組小鼠OGTT曲線下面積無統(tǒng)計學(xué)差異，具體結(jié)果見圖1(C)所示。

注: 與NCD組比較， ***P<0.001， **P<0.01；與HFD組比較， ###P<0.001, ##P<0.01。

2.3 供體糞樣微生物移植對小鼠血脂水平的影響

2.3.1 供體糞樣微生物移植對小鼠TC的影響 第8周實驗結(jié)果表明，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠TC含量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。與HFD組相比，HFD+DFSBL組小鼠TC含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；HFD+DFBS組和HFD+DFSF組TC含量上升趨勢得到控制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。具體結(jié)果如圖2(A)所示。

2.3.2 供體糞樣微生物移植對小鼠TG的影響 第8周實驗結(jié)果顯示，與NCD組小鼠相比，HFD組小鼠TG含量有較明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與HFD組相比，HFD+DFSBL組TG含量上升趨勢得到控制，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HFD+DFBS組和HFD+DFSF組無明顯變化。具體結(jié)果見圖2(B)所示。

注: 與NCD組比較， ***P<0.001， *P<0.05； 與HFD組比較， #P<0.05。

3 討論

本實驗在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，主要是通過建立動物胰島素抵抗模型，分別給予胰島素抵抗小鼠不同的糞樣處理液體，旨在觀察不同的糞樣移植物對胰島素抵抗小鼠糖脂代謝基礎(chǔ)指標(biāo)的影響，是菌群在改善胰島素抵抗小鼠糖脂代謝指標(biāo)時起作用，還是菌的代謝產(chǎn)物在起作用，還是菌群+代謝產(chǎn)物的作用大于兩者單獨使用。實驗結(jié)果表明：與高脂造模組小鼠相比，給予糖耐量正常人糞樣共生菌液和糞樣菌懸液的胰島素抵抗小鼠，它們的隨機血糖水平、血漿總膽固醇水平、甘油三酯水平和口服葡萄糖耐量實驗曲線下面積呈下降趨勢，糖耐量正常人糞樣中確實存在改善胰島素抵抗小鼠糖脂代謝指標(biāo)的靶標(biāo)菌或菌群，且靶標(biāo)菌或菌群的作用可能優(yōu)于其代謝產(chǎn)物的作用。對于是糞樣中哪種菌或菌群在起主要作用，這種菌或菌群又是通過哪種方式來影響胰島素抵抗相關(guān)表型指標(biāo)的變化，需要本課題進一步的深入研究。