基于數(shù)據(jù)庫(kù)分析肝細(xì)胞癌細(xì)胞XPO5基因水平變化及其臨床意義*

王 剛，趙洪波，朱亞玲，蔣保三，張?jiān)矫溃笥?/p>

肝細(xì)胞癌（hepatocellular caicinoma，HCC）是世界上第六大癌癥和第三大常見(jiàn)的癌癥死因[1，2]。XPO5屬于核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，其轉(zhuǎn)運(yùn)的pre-miRNAs從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的輸出是miRNA成熟不可或缺的一步。XPO5作為通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA來(lái)控制基因表達(dá)的關(guān)鍵分子，其本身的表達(dá)改變或突變對(duì)miRNA水平有顯著的影響[3]。大量研究證明，HCC的發(fā)生發(fā)展與miRNA的差異性表達(dá)有著密切的關(guān)系，甚至相當(dāng)數(shù)量的miRNA直接參與了HCC的分化、凋亡、侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過(guò)程[4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，XPO5表達(dá)與前列腺癌和黑色素瘤等腫瘤相關(guān)，發(fā)現(xiàn)在前列腺癌細(xì)胞，敲低XPO5表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖和前列腺癌的發(fā)展[5]。XPO5過(guò)表達(dá)導(dǎo)致miRNA加工機(jī)制的失調(diào)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)穩(wěn)定性發(fā)生變化，這一過(guò)程可能是通過(guò)較低的泛素化和糖基化而實(shí)現(xiàn)的[6]。但XPO5基因與HCC的相關(guān)報(bào)道還不多，具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫(kù)分析了HCC細(xì)胞XPO5基因水平的變化，并分析了其對(duì)患者預(yù)后的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)分析 Oncomine（https://www.oncomine.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)[7]為收集和標(biāo)準(zhǔn)化分析腫瘤樣本基因表達(dá)譜芯片的數(shù)據(jù)庫(kù)，能提供腫瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。目前，Oncomine已經(jīng)收集了來(lái)自715個(gè)基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，86733個(gè)癌組織和正常組織的樣本數(shù)據(jù)，用于識(shí)別腫瘤基因組中失調(diào)的基因、通路和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Oncomine可以分析多個(gè)基因的差異性表達(dá)，給出比較全面的結(jié)論。從Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選基因，在本研究中設(shè)置的檢索條件如下：①Analysis type：Cancer vs.Normal analysis；②Cancer type：Liver cancer；③Data type：mRNA；④設(shè)定條件：Over-expression；⑤XPO5。分析HCC組織XPO5 mRNA水平。

1.2 基因表達(dá)譜互相作用分析（gene expression profilling interactive analysis，GEPIA，http://gepia.cancer-pku.cn）數(shù)據(jù)庫(kù) 由北京大學(xué)研制開(kāi)發(fā)用于分析基因在癌組織與正常組織差異表達(dá)的在線(xiàn)應(yīng)用程序[8]。在GEPIA中，數(shù)據(jù)是基于TCGA（The Cancer Genome Atlas）和 GTEx（Genotype-Tissue Expression）數(shù)據(jù)庫(kù)，得出標(biāo)準(zhǔn)RNA測(cè)序數(shù)據(jù)。在本研究，首先，在GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇來(lái)源于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的所有HCC和正常組織的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，分析其是否存在差異表達(dá),以驗(yàn)證Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)的結(jié)論。然后，分析不同臨床和病理分級(jí)患者該基因的差異及其該基因水平差異對(duì)患者總體生存率和無(wú)病生存率的影響。

1.3 MethHC（a database of DNA Methylation and gene expression in Human Cancer）數(shù)據(jù)庫(kù)分析 MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)[9]（http：//methhc.mbc.nctu.edu.tw）是關(guān)于腫瘤基因表達(dá)和DNA甲基化的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，由臺(tái)灣國(guó)立交通大學(xué)開(kāi)發(fā)，包含18種人類(lèi)腫瘤，包括正常和腫瘤組織DNA甲基化和mRNA/miRNA表達(dá)譜。利用MethHC可以探討正常和腫瘤組織DNA甲基化模式，并分析甲基化和表達(dá)之間的關(guān)系。我們運(yùn)用該數(shù)據(jù)庫(kù)分析XPO5基因DNA甲基化水平。

1.4 STRING（Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes）數(shù)據(jù)庫(kù)分析 STRING（http：//stringdb.org/）是包含各種蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫(kù)[10]。數(shù)據(jù)來(lái)源主要為文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白質(zhì)相互作用信息以及通過(guò)共表達(dá)研究、高通量實(shí)驗(yàn)和基因組信息分析預(yù)測(cè)的結(jié)果，描述的相互作用關(guān)系包括生理上的直接相互作用和功能上的間接相互作用。該數(shù)據(jù)庫(kù)為本研究提供了HCC組織XPO5相關(guān)蛋白的相互作用的分析資料。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織與正常肝組織XPO5基因水平的比較 在Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)，有Chen Liver（Mol Biol Cell,2002）和 Wurmbach Liver（Hepatology，2007）2個(gè)子數(shù)據(jù)庫(kù)符合篩選條件。分析發(fā)現(xiàn)HCC組織XPO5基因較正常肝組織呈顯著高水平（P值為1×5.11-6，圖 1A、圖 1B）；在 Chen Liver數(shù)據(jù)庫(kù)中，有76例正常肝組織和103例HCC組織，后者XPO5基因呈高水平，其中n=179，F(xiàn)old Change=1.758（P 值為 1×3.80-13，圖 1A）；在 Wurmbach Liver數(shù)據(jù)庫(kù)中，有10例正常肝組織和35例HCC組織，后者 XPO5基因?yàn)楦咚?，其?n=45，F(xiàn)old Change=2.125（P 值為 1×1.02-5，圖 1B）。應(yīng)用GEPIA分析TCGA中HCC數(shù)據(jù)，包括正常肝組織50例和HCC組織369例。HCC組織 XPO5基因水平較正常肝組織顯著升高（P＜0.01，圖 2），與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。

2.2 XPO5基因水平與HCC患者生存期的關(guān)系 利用GEPIA中TCGA數(shù)據(jù)分析XPO5基因水平與HCC患者生存期的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)了182例XPO5基因高水平與182例XPO5基因低水平患者的生存曲線(xiàn)，顯示XPO5基因高水平組總體生存期顯著短于低水平組（P＜0.01，圖3A），XPO5基因高水平組無(wú)病生存期也顯著短于低水平組（P＜0.01，圖3B）。

圖1 Oncomine各子數(shù)據(jù)庫(kù)中HCC組織與正常肝組織XPO5 mRNA水平差異

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)419個(gè)樣本XPO5水平（紅色為369例HCC，灰色為50例正常肝組織）

圖3 XPO5基因水平與HCC生存期的關(guān)系

2.3 XPO5基因水平與HCC病理學(xué)分級(jí)關(guān)系 HCC病理學(xué)分為Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)。Ⅰ/Ⅱ級(jí)為高分化，Ⅲ/Ⅳ級(jí)為低分化。利用GEPIA中TCGA數(shù)據(jù)分析不同病理學(xué)分級(jí)的HCC組織XPO5基因水平的差異，結(jié)果Ⅲ級(jí)HCC組織XPO5水平最高（圖4）。

圖4 不同病理學(xué)分級(jí)的HCC組織XPO5水平比較

2.4 XPO5基因主體區(qū)域DNA甲基化水平分析 在MethHC數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示XPO5基因甲基化轉(zhuǎn)錄模板NM-020750，在HCC中其甲基化水平較正常肝組織低（P＜0.005,圖5A）。分析HCC組織XPO5基因在啟動(dòng)子（promoter）區(qū)域、增強(qiáng)子（enhancer）區(qū)域和基因體（gene body）區(qū)域等區(qū)域甲基化水平，發(fā)現(xiàn)其在基因體區(qū)域甲基化水平較正常肝組織顯著降低（圖5B）。

圖5 XPO5基因體區(qū)域甲基化水平比較

2.5 XPO5相關(guān)作用蛋白網(wǎng)絡(luò) 利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析XPO5蛋白的相互作用，其中以XPO5為中心發(fā)現(xiàn)有多個(gè)相互作用的蛋白質(zhì)，如RAN、DICER1和ILF3等（圖6）。

圖6 XPO5蛋白的相互關(guān)系

3 討論

XPO5存在于核膜，介導(dǎo)pre-miRNA的運(yùn)輸，從而調(diào)控miRNA的表達(dá)。阻止XPO5的表達(dá)能導(dǎo)致miRNA水平的減低。XPO5的突變將導(dǎo)致miRNA合成減少，且減少對(duì)miRNA靶基因的抑制。有文獻(xiàn)報(bào)道，Pin1的敲減能恢復(fù)XPO5功能和miRNA的合成，從而抑制HCC增殖和遷移。因此，研究XPO5與HCC的關(guān)系尤為重要。

我們首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出在HCC組織呈高水平的XPO5基因，并與正常肝組織進(jìn)行比較，結(jié)果2個(gè)子數(shù)據(jù)集均顯示HCC組織XPO5 mRNA水平比正常肝組織高。再選擇TCGA數(shù)據(jù)中369例HCC患者和50例正常人進(jìn)行分析，結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)篩選結(jié)果一致。我們又通過(guò)MethHC網(wǎng)站分析了XPO5基因在HCC和正常肝組織中的甲基化水平，MethHC分析結(jié)果顯示在HCC組織XPO5基因在基因體區(qū)域甲基化水平比正常肝組織中的低，提示XPO5基因在基因體區(qū)域甲基化水平降低可能在HCC的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中扮演著重要的角色。DNA甲基化的主要功能區(qū)域包括promoter、enhancer和gene body。這三個(gè)區(qū)域DNA甲基化對(duì)基因轉(zhuǎn)錄的影響是不同的，啟動(dòng)子甲基化能抑制轉(zhuǎn)錄起始，而轉(zhuǎn)錄延伸會(huì)增強(qiáng)基因體甲基化，增強(qiáng)子的甲基化更加復(fù)雜。研究表明，基因體DNA甲基化可能通過(guò)阻斷啟動(dòng)子的啟動(dòng)或通過(guò)影響轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)重復(fù)DNA的活性來(lái)增加轉(zhuǎn)錄活性，這也正好驗(yàn)證了本研究發(fā)現(xiàn)的HCC患者癌組織XPO5基因體區(qū)域甲基化水平降低的結(jié)論，但其具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

最后，我們利用GEPIA中TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了XPO5基因水平與HCC患者癌組織不同病理學(xué)分級(jí)之間的關(guān)系及其對(duì)患者生存時(shí)間的影響。XPO5基因上的rs11077單核苷酸位點(diǎn)可以改變XPO5的表達(dá)，從而影響miRNA的整體表達(dá)。已有研究證實(shí) rs11077基因多態(tài)性與我國(guó)小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌和肝癌等惡性腫瘤患者預(yù)后相關(guān)。與XPO5基因低水平組相比，XPO5基因呈高水平者總體生存率和無(wú)病生存期均明顯縮短。HCC分級(jí)代表了腫瘤的惡性程度，但是XPO5基因水平卻在Ⅲ級(jí)患者癌組織最高。由于HCC癌組織分化Ⅳ級(jí)比較罕見(jiàn)，可能由于數(shù)量較少造成這一結(jié)果，具體原因仍需進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。我們還利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分析了XPO5蛋白與其他蛋白的相互作用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RAN、ILF3和DICER1等蛋白與XPO5關(guān)系密切。DICER1是miRNA生成的關(guān)鍵酶，是大多數(shù)miRNA合成所需要的酶。XPO5基因調(diào)控DICER1的表達(dá)，而抑制DICER1的表達(dá)，使HCC細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和遷移能力顯著下降。有研究發(fā)現(xiàn),DICER1缺失與其他致癌因子共同作用加速HCC的發(fā)生。有人認(rèn)為DICER1是一個(gè)潛在的腫瘤抑制因子。ILF3蛋白的雙鏈RNA結(jié)合域的功能是作為一種奇特的核輸出序列，其功能的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于XPO5的表達(dá)。ILF3蛋白家族對(duì)病毒感染反應(yīng)、mRNA的運(yùn)輸與定位、翻譯控制、轉(zhuǎn)錄和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面發(fā)揮著非常重要的作用。RAN mRNA及其蛋白在多種腫瘤的細(xì)胞系和組織中呈高表達(dá)，抑制該基因的表達(dá)可以降低腫瘤的發(fā)生，并且RAN可調(diào)控 HCC相關(guān)蛋白有絲分裂在紡錘體的定位。也有研究認(rèn)為可將RAN蛋白作為治療HCC的靶標(biāo)之一。