肝源性糖尿病患者肝組織干擾素誘導(dǎo)蛋白-10表達(dá)變化*

張 梅，石秀英，李林娟，薛亞妮

肝臟作為糖代謝的重要器官，在肝功能損害時(shí)會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)糖原代謝異?；蚴歉卧葱蕴悄虿〉陌l(fā)生。國外學(xué)者研究顯示，大約有50%～80%慢性肝病患者有糖耐量異常，而且患者直接發(fā)展為糖尿病的比例大約是20%～30%[1]。持續(xù)的血糖濃度升高會(huì)對(duì)肝細(xì)胞造成損害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引發(fā)肝衰竭，威脅患者生命[2]。干擾素誘導(dǎo)蛋白-10（interferon-inducibe protein 10，IP-10）是一種炎癥趨化因子，相關(guān)研究認(rèn)為其具有重要的生物學(xué)功能，包括抗病毒免疫、抗腫瘤、抑制血管新生，并在各種炎癥因子介導(dǎo)的疾病發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用[3，4]。本研究檢測(cè)了肝源性糖尿病患者血清和肝組織IP-10水平或表達(dá)情況，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2016年3月～2018年5月我院診治的乙型肝炎肝硬化并發(fā)肝源性糖尿病患者70例，男40例，女30例；年齡38～65歲，平均年齡為（46.3±7.5）歲。乙型肝炎肝硬化患者70例，男37例，女33例；年齡37～62歲，平均年齡為（45.9±6.1）歲。診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)和感染病學(xué)分會(huì)修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》[5]的標(biāo)準(zhǔn)，并符合肝源性糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，即，①在糖尿病發(fā)生前有肝病史，或同時(shí)發(fā)生；②肝功能異常；③無糖尿病史及糖尿病家族史；④空腹血糖≥7.0 mmol/L，餐后2 h血糖≥ 11.1 mmol/L；⑤空腹胰島素水平偏高，餐后胰島素反應(yīng)不良。排除標(biāo)準(zhǔn)：因患有腎上腺或垂體疾病出現(xiàn)的血糖升高等糖代謝異常、由藥物攝入造成的糖代謝紊亂，包括糖皮質(zhì)激素等、伴有心、腦、腎和其他器官嚴(yán)重功能不全者。

1.2 血清IP-10水平檢測(cè) 采用ELISA法，所有患者在空腹?fàn)顟B(tài)下采集靜脈血5 mL，分離血清，使用Alies全自動(dòng)酶標(biāo)儀和美國西格瑪奧德里奇公司提供的試劑檢測(cè)，根據(jù)試劑盒說明書繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得IP-10水平。

1.3 肝組織IP-10 mRNA水平檢測(cè) 常規(guī)行肝穿刺，取肝組織5 mg，根據(jù)說明書要求進(jìn)行總RNA提取。取RNA1μl，加入DEPC水，稀釋比例為1:250，在紫外分光光度劑下檢測(cè)RNA濃度和純度，取A260/A280比值范圍為1.8～2.0的樣品，進(jìn)行試驗(yàn)。取RNA 8 μl，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA（合成試劑盒由上海生工生物公司提供）。檢測(cè)IP-10和甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）的引物序列見表1。在PCR反應(yīng)體系中加入IP-10或GAPDH特異性引物，在一定的溫度參數(shù)下進(jìn)行擴(kuò)增。

1.4 肝組織IP-10蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用SP免疫組化法，取經(jīng)10%福爾馬林固定的肝組織，石蠟包埋（華利電子有限責(zé)任公司提供的ZMN-7803組織包埋機(jī)），切片，常規(guī)脫蠟脫水，切片（德國徠卡有限公司提供的LEICARM 2128切片機(jī)）。使用3%過氧化氫去離子水溫育10～30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。取出切片，放入蒸餾水中洗滌。PBS浸泡5 min，常規(guī)封閉后室溫孵育10 min，滴加一抗工作液于組織片上，37℃孵育1～2 h，用PBS緩沖液反復(fù)清洗3次，滴加二抗工作液于組織片上，37℃孵育10～30 min，用PBS緩沖液清洗3次，每次5 min，接著滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，孵育后沖洗。滴加DAB（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）顯色3～15 min，加入底物顯色。在顯微鏡下，采用雙盲法觀察，發(fā)現(xiàn)深褐色著色者提示為陽性，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率。

表1 PCR反應(yīng)引物序列及其反應(yīng)條件

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的比較采用x2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清和肝組織IP-10水平比較 乙型肝炎肝硬化并發(fā)肝源性糖尿病血清和肝組織IP-10水平顯著高于不伴糖尿病的肝硬化患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，表1）。

表2 兩組血清和肝組織IP-10水平（±s）比較

表2 兩組血清和肝組織IP-10水平（±s）比較

例數(shù) 血清 IP-10（pg/mL）糖尿病 70肝硬化 70 t值P值236.59±28.30 205.31±26.92 6.701＜0.001肝組織IP-10 mRNA（lgcopies/ml）0.59±0.91 0.21±0.66 2.828 0.005

2.2 肝源性糖尿病患者肝組織IP-10表達(dá)情況 乙型肝炎肝硬化并發(fā)糖尿病患者肝組織IP-10陽性率為31.4%，顯著高于不伴糖尿病患者的12.9%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（x2=7.002，P＜0.05，圖 1、圖 2）。

圖1 肝源性糖尿病患者肝組織IP-10表達(dá)情況（SP，100×）

圖2 肝源性糖尿病患者肝組織IP-10表達(dá)情況（SP，40×）

3 討論

肝臟是人體糖代謝的重要調(diào)節(jié)器官，在葡萄糖代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，可對(duì)血糖進(jìn)行調(diào)節(jié)[6，7]。一般而言，人們進(jìn)餐后血糖水平會(huì)上升，小腸吸收血糖后接著會(huì)運(yùn)輸?shù)礁闻K，進(jìn)行肝糖原合成。當(dāng)血糖水平下降時(shí)，所貯存的糖原會(huì)進(jìn)一步分解成游離葡萄糖，促使血糖水平恢復(fù)。所以，各種因素引起的肝功能損傷會(huì)使得肝臟對(duì)糖的調(diào)節(jié)能力下降，導(dǎo)致血糖水平上升或是下降，難以維持正常水平，嚴(yán)重的可導(dǎo)致機(jī)體糖耐量明顯降低，以至于引發(fā)肝源性糖尿病[8，9]。慢性肝病患者胰島素分泌和代謝障礙、細(xì)胞因子和炎性因子等多方面因素在糖代謝紊亂的發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用[10，11]。淋巴細(xì)胞可對(duì)胰島β細(xì)胞造成一定的損傷。然而，現(xiàn)如今關(guān)于淋巴細(xì)胞由血液遷移到胰島炎癥部位的機(jī)制還沒有得到一致的結(jié)論，有待于進(jìn)一步闡明[12，13]。IP-10是上世紀(jì)80年代中期發(fā)現(xiàn)的CXC類炎癥趨化因子，由干擾素γ（IFN-γ）誘導(dǎo)產(chǎn)生，能夠趨化高度表達(dá)CXC受體3（CXCR3）的多種炎癥細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞而到達(dá)炎性部位[14，15]。IP-10可以被IFN-γ所誘導(dǎo)，主要由Th l細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)所誘導(dǎo)。相關(guān)學(xué)者研究認(rèn)為，外周血Th l細(xì)胞因子在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程中起到了重要的作用,而其中代表性因素就是γ-干擾素。對(duì)于慢性乙型肝炎患者來說，γ-干擾素可以顯著提高其免疫活化能力，減小炎癥對(duì)機(jī)體的病理性損傷[16，17]。在肝臟內(nèi)，肝細(xì)胞可產(chǎn)生IP-10，并與CXCR3相互作用，以此趨化單核巨噬細(xì)胞、激活NK細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，啟動(dòng)多種炎性細(xì)胞因子，加重肝細(xì)胞損傷，抑制血管新生。

國外學(xué)者通過IL-1β、INF-γ和dsRNA刺激體外培養(yǎng)的小鼠細(xì)胞和人的胰島β細(xì)胞，采用RT-PCR和ELISA法測(cè)定出高水平的IP-10，說明炎癥性細(xì)胞因子可以刺激胰島β細(xì)胞分泌IP-10高表達(dá)[18，19]。應(yīng)用病毒攻擊，也可獲得類似的結(jié)果。乙型肝炎病毒作用也與肝源性糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，其中乙型肝炎病毒感染后會(huì)引起肝功能受損，進(jìn)而造成糖代謝失去平衡，并且乙型肝炎病毒可直接損害胰腺的胰島組織，引起腺泡炎癥和壞死，胰島細(xì)胞功能失調(diào)，使得胰島素的分泌減少，引起血糖升高[20，21]。國外學(xué)者研究認(rèn)為，丙型肝炎病毒感染者糖尿病的發(fā)生率較高[22]。丙型肝炎病毒容易在肝外組織復(fù)制，損傷胰島細(xì)胞，減少胰島素的分泌，并且該病毒核心蛋白能夠誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3（SOCCS3）的產(chǎn)生，進(jìn)而影響胰島素信號(hào)的傳遞；同時(shí)引起胰島β細(xì)胞的凋亡，引發(fā)胰島素抵抗。為此，清除丙型肝炎病毒RNA可以增加胰島素敏感度，使胰島素水平維持在正常范圍內(nèi)。而且，對(duì)于肝炎患者而言，定期檢查HBV DNA和HCV RNA載量是有必要的。在49例慢性乙型肝炎患者和同期選擇的正常健康人，檢測(cè)血清IP-10水平，結(jié)果顯示慢性乙型肝炎患者血清IP-10水平明顯高于健康人，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[23]。慢性乙型肝炎患者肝損傷程度與血清IP-10水平密切相關(guān)，慢性乙型肝炎中重度肝損傷患者血清IP-10呈高水平，提示乙型肝炎病毒感染人體肝臟組織后會(huì)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。當(dāng)炎癥發(fā)生時(shí)IP-10水平明顯增加，以更好地對(duì)各種炎性細(xì)胞發(fā)揮趨化作用，呈現(xiàn)出抗病毒效應(yīng)，但也會(huì)促使患者肝臟組織損傷程度進(jìn)一步加重。研究發(fā)現(xiàn)HBeAg陰性患者血清IP-10水平明顯低于HBeAg陽性患者，提示乙型肝炎病毒復(fù)制活躍程度可能在一定程度上影響了血清IP-10水平。在肝源性糖尿病患者，病毒基因通過抑制真性胰島素生成，造成胰島素抵抗，以至于發(fā)生了免疫損傷[24-27]。所以，IP-10可能參與肝源性糖尿病的發(fā)生發(fā)展，但能否作為評(píng)估肝源性糖尿病病情及患者預(yù)后的指標(biāo)尚需深入探討。

本研究結(jié)果顯示，采用ELISA法檢測(cè)糖尿病患者血清IP-10水平，發(fā)現(xiàn)伴有糖尿病的肝硬化患者血清IP-10水平顯著高于不伴有糖尿病的肝硬化患者，前者肝組織IP-10 mRNA水平也明顯升高，肝組織IP-10表達(dá)陽性率明顯高于不伴有糖尿病的肝硬化患者,提示檢測(cè)血清和肝組織IP-10表達(dá)，對(duì)研究肝源性糖尿病的發(fā)生機(jī)制，尤其是炎性反應(yīng)在其中的作用，可能有幫助。

綜上所述，伴有肝源性糖尿病的乙型肝炎肝硬化患者肝組織和血清IP-10水平升高，暗示IP-10高表達(dá)可能通過炎癥機(jī)制參與了肝源性糖尿病的發(fā)生，但本研究未分析肝組織IP-10表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系，也不知道這種高表達(dá)對(duì)患者治療應(yīng)答和預(yù)后有何意義，仍需進(jìn)一步研究。