冰片配伍黃芪甲苷與三七總皂苷對(duì)腦缺血/再灌注后血腦屏障通透性的影響

丁 煌，唐 三，楊筱倩，劉曉丹，黃小平，鄧常清

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)分子病理實(shí)驗(yàn)室，中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，細(xì)胞生物學(xué)與分子技術(shù)湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410208)

血腦屏障(blood brain barrier,BBB)是介于血液和腦組織間對(duì)物質(zhì)通過(guò)具有選擇性的動(dòng)態(tài)界面，主要由血管內(nèi)皮細(xì)胞、緊密連接(tight junctions，TJs)、基底膜、周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞終足共同構(gòu)成[1]。TJs是BBB的結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)，存在于相鄰血管內(nèi)皮細(xì)胞之間，主要由閉合蛋白(Claudin)、咬合蛋白(Occludin)和連接黏附分子三種跨膜蛋白組成[2]。它們通過(guò)閉鎖小帶蛋白(zonula cccludens，ZO)與血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架相連，并能識(shí)別TJs位置及傳遞各類(lèi)信號(hào)。緊密連接蛋白表達(dá)減少會(huì)破壞TJs整體性，進(jìn)而破壞BBB，導(dǎo)致腦水腫和腦損傷[3]。腦缺血后，可導(dǎo)致BBB的破壞，血管壁通透性增加[4]。

黃芪和三七是治療心腦血管疾病的常用中藥，黃芪總苷(astragalosides，AST)是黃芪中的主要藥效組分，主要含黃芪甲苷(astragalosides Ⅳ，AST Ⅳ)；三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要藥效組分，主要含人參皂苷Rg1、Rb1和三七皂苷R1等。冰片是小分子脂溶性單萜類(lèi)化合物，既可促進(jìn)藥物透過(guò)BBB，又能維持BBB結(jié)構(gòu)的完整性，并降低其通透性，從而對(duì)BBB及腦組織起到保護(hù)作用[5]。我們根據(jù)中藥歸經(jīng)理論，將冰片與AST Ⅳ和PNS配伍后，可促進(jìn)AST Ⅳ、Rg1、Rb1和R1吸收入腦，增加藥物成分在腦組織的富集[6]。由于腦缺血可導(dǎo)致BBB破壞、血管壁通透性增加，而B(niǎo)BB的通透性增加又可以促進(jìn)藥物成分進(jìn)入腦組織，本研究的主要目的是探討冰片“引藥上行”促進(jìn)AST Ⅳ與PNS有效成分入腦的作用是否與BBB的破壞和開(kāi)放有關(guān)，對(duì)BBB的結(jié)構(gòu)和受損的腦組織又起怎樣的作用，從而為冰片配伍AST Ⅳ與PNS抗腦缺血作用的合理應(yīng)用與開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥品與試劑冰片(左旋龍腦，主要成分為1，7-三甲基-二環(huán)庚-2-醇，含量86%，購(gòu)自湖北俊輝有限公司，批號(hào)20170815)；AST Ⅳ(純度≥98%，批號(hào)MUST-17022804)；PNS(純度≥98%，批號(hào)MUST-17060601)、人參皂苷Rg1(純度≥98%，批號(hào)MUST-17030829)、Rb1(純度≥98%，批號(hào)MUST-17022510)和三七皂苷R1(純度≥98%，批號(hào)MUST-17071228)均購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司，藥物用時(shí)以0.5%羧甲基纖維素鈉配置成相應(yīng)濃度混懸液。依達(dá)拉奉注射液購(gòu)自南京先聲東元制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)80-090104，規(guī)格每支10 mg(5 mL)。

二甲基砷酸鈉(Sigma公司，批號(hào)C0250)、戊二醛溶液(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)G810413)、硝酸鑭(上海麥克林生化科技有限公司，批號(hào)L812372)、Claudin5兔單克隆抗體(英國(guó)abcam公司，批號(hào)ab131259)、Occludin兔單克隆抗體(英國(guó)abcam公司，批號(hào)ab167161)、ZO-1兔單克隆抗體(美國(guó)proteintech公司，批號(hào)21773-1-AP)、ZO-2兔單克隆抗體(美國(guó)proteintech公司，批號(hào)18900-1-AP)、β-actin兔多克隆抗體(美國(guó)ABclonal公司，批號(hào)AC026)、 HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(美國(guó)proteintech公司，批號(hào)SA00001-1)、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(美國(guó)proteintech公司，批號(hào)SA00001-2)，RIPA裂解液(康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)cw2333s)、ECL化學(xué)發(fā)光液(北京鼎國(guó)昌盛生物科技有限公司，批號(hào)GE2301)、蛋白Marker(美國(guó)Thermo fisher，批號(hào)515683)、BCA試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K176810E)。

1.2 動(dòng)物SPF級(jí)♂ Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量(200～250) g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)：No.43004700037715)。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(場(chǎng)地許可證號(hào)：SKY(湘)2013-0005)。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)(5～7) d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.3 儀器透射電鏡(日本，日立HT7700)，高速冷凍離心機(jī)(YINGTAI，TGL20)，酶標(biāo)儀(美國(guó)，ELX800)，電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司，041BR132283)，蛋白轉(zhuǎn)膜槽(美國(guó)Bio-Rad公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司，ChemiDoC XRS+)。

2 方法

2.1 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)再灌注模型制作采用前期方法[7]制作MCAO局灶性腦缺血模型，阻斷2 h后，拔出線栓進(jìn)行再灌注22 h。

2.2 給藥、取材根據(jù)我們前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[8]，將動(dòng)物隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、單用冰片(15 mg·kg-1)組、單用AST Ⅳ(20 mg·kg-1)組、單用PNS(50 mg·kg-1)組、AST Ⅳ(20 mg·kg-1)+PNS(50 mg·kg-1)組、冰片(15 mg·kg-1)+AST Ⅳ(20 mg·kg-1)+PNS(50 mg·kg-1)組及依達(dá)拉奉4 mg·kg-1組，每組5只大鼠。各中藥組于造模前2 d開(kāi)始灌胃，每天兩次，兩次給藥間隔12 h。依達(dá)拉奉組進(jìn)行腹腔注射，每天1次。假手術(shù)組及模型組灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉。于給藥d 3灌胃1 h后行缺血2 h，再灌注22 h，術(shù)后繼續(xù)同前給藥，再灌注結(jié)束后處死動(dòng)物，做相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 神經(jīng)功能評(píng)分大鼠再灌注22 h后，取材前按前法[7]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分越高，表明神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

2.4 血腦屏障通透性檢測(cè)(鑭示蹤電鏡)

2.4.1取材 再灌注結(jié)束后取材。腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL·kg-1)麻醉大鼠，暴露心臟剪開(kāi)右心耳，將灌注用針從心尖插入左心室，注入生理鹽水，至動(dòng)物出現(xiàn)肝臟、肺變白及右心房流出澄清液體后，灌注鑭醛固定液200 mL(4.28 g二甲基砷酸鈉，溶于40.8 mL的0.2 mol·L-1鹽酸，定容至400 mL，配成二甲基砷酸鈉溶液；再稱(chēng)取20 g多聚甲醛，溶解于60 ℃ 500 mL超純水，倒入20 mL 50%戊二醛溶液及80 mL二甲基砷酸鈉溶液，調(diào)pH值至7.4，加入20 g硝酸鑭，定容至1 L即得)至動(dòng)物全身僵硬，斷頭取患側(cè)大腦置鑭醛固定液中保存。

2.4.2鑭電鏡檢測(cè) 取固定后的右腦切至1×1×3 mm3，用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液漂洗3次，每次10～15 min，1%鋨酸固定液固定1～2 h，0.1 M磷酸漂洗液漂洗3次每次10～15 min后，脫水處理：50%丙酮10～15 min，70%丙酮10～15 min，90%丙酮10～15 min，100%丙酮15～20 min，純丙酮+包埋液(1 ∶1)37 ℃12 h，純包埋液37 ℃ 10～12 h，37 ℃烘箱內(nèi)過(guò)夜。再將腦組織60 ℃烘烤12～24 h，超薄切片至50～100 nm，3%醋酸鈾以及硝酸鉛雙染，置于日立HT7700透射電鏡觀察、拍片。鑭顆粒為重金屬，不易通過(guò)BBB，當(dāng)BBB完整性破壞時(shí)，鑭從毛細(xì)血管漏出，且被示蹤在腦毛細(xì)血管的周?chē)M織，故可用鑭示蹤法評(píng)價(jià)BBB完整性。

2.5 腦含水量測(cè)定(干濕重法)斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干等部位，分離雙側(cè)大腦半球，立即置電子天平測(cè)定腦組織濕重[室溫(20～25)℃，濕度60%～75%]，然后將腦組織于80 ℃烤2 d以上至恒重，測(cè)定腦組織干重(兩次測(cè)定值之差小于0.2 mg)。腦含水量/%=(濕重-干重)/濕重×100%[9]。

2.6 腦組織ZO-1、ZO-2、Claudin5、Occludin蛋白的定位及定量檢測(cè)(免疫組織化學(xué)染色法)取患側(cè)視交叉后2～6 mm腦組織，冠狀切開(kāi)，迅速置于4%多聚甲醛溶液固定。石蠟包埋后切片，片厚4 μm。進(jìn)行免疫組化染色測(cè)定，ZO-1單克隆抗體、ZO-2單克隆抗體、Claudin5單克隆抗體及Occludin單克隆抗體分別作1 ∶500稀釋。每張切片在顯微鏡(10×40)下隨機(jī)選取皮質(zhì)區(qū)5個(gè)有毛細(xì)血管的視野，觀察ZO-1、ZO-2、Claudin5、Occludin蛋白沿毛細(xì)血管分布情況，棕色顆粒即為陽(yáng)性表達(dá)。Image pro-plus軟件測(cè)定每個(gè)視野下每個(gè)血管壁上棕色顆粒的光密度(optical density，OD)值，計(jì)算平均值，代表相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

2.7 腦組織ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin5蛋白表達(dá)(Western blot法)取患側(cè)視交叉后2～6 mm腦組織50 mg，加入1 mL預(yù)冷的RIPA，冰上勻漿，靜置20 min后12 000 r·min-14 ℃離心10 min，取上清，BCA試劑盒測(cè)定總蛋白含量。每個(gè)樣本取80 μg蛋白，100℃水浴10 min變性，110 V恒壓電泳90 min，200 mA轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，再分別與ZO-1抗體(1 ∶500)、ZO-2抗體(1 ∶500)、Claudin5抗體(1 ∶5 000)、Occludin抗體(1 ∶10 000)、β-actin抗體(1 ∶8 000)孵育，4 ℃靜置過(guò)夜，TBST洗3次，每次10 min；然后分別加羊抗兔二抗(1 ∶5 000)或羊抗小鼠二抗(1 ∶8 000)，于37 ℃孵育1 h或常溫水平搖床上孵育2 h后，TBST洗膜3次，每次10 min，加ECL化學(xué)發(fā)光劑于凝膠成像儀中顯影。用Image Lab圖像分析軟件測(cè)定目的條帶的積分光密度值(integral optical density，IOD)，以目的條帶的IOD值與β-actin條帶IOD值的比值作為該目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 各組神經(jīng)功能評(píng)分比較假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)缺損癥狀。與假手術(shù)組比較，模型組神經(jīng)功能評(píng)分明顯升高(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組神經(jīng)功能評(píng)分明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且冰片+AST Ⅳ+PNS組的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)(見(jiàn)Fig 1)。

3.2 各組腦含水量的比較模型組腦組織含水量明顯高于假手術(shù)組(P<0.01)。與模型組比較，各藥物組腦含水量明顯降低(P<0.05或P<0.01)，且AST Ⅳ+PNS組明顯低于AST Ⅳ單用組及PNS單用組(均P<0.05)，冰片+AST Ⅳ+PNS組明顯低于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1 Comparison of neurologic function score

A: Sham; B: Model; C: Borneol; D: AST Ⅳ; E: PNS; F: AST Ⅳ+PNS; G: Borneol+AST Ⅳ+PNS; H: Edaravone.△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 2 Comparison of brain water content among each group , n=5)

A: Sham; B: Model; C: Borneol; D: AST Ⅳ; E: PNS; F: AST Ⅳ+PNS; G: Borneol+AST Ⅳ+PNS; H: Edaravone.△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

3.3 各組BBB通透性的變化假手術(shù)組高密度的鑭顆粒僅附著在毛細(xì)血管內(nèi)壁表面，呈連續(xù)線性分布，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接、基底膜及毛細(xì)血管外均未見(jiàn)鑭顆粒沉積，腦組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。在模型組，鑭顆粒彌漫分布在基底膜、腦組織細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)，BBB破壞嚴(yán)重，通透性增加，腦組織高度水腫，內(nèi)皮細(xì)胞及周?chē)窠?jīng)細(xì)胞失去正常形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在冰片組和AST Ⅳ、PNS單用組，鑭顆粒在腦組織中的分布有所減少，腦組織水腫有所減輕。在AST Ⅳ+PNS組，水腫明顯減輕，BBB緊密連接呈部分開(kāi)放，鑭顆粒大部分分布在毛細(xì)血管內(nèi)表面，少部分穿過(guò)毛細(xì)血管壁進(jìn)入基底膜，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯鑭顆粒浸潤(rùn)。在冰片+AST Ⅳ+PNS組以及陽(yáng)性對(duì)照依達(dá)拉奉組，鑭顆粒在毛細(xì)血管內(nèi)壁呈線性排列，腦組織無(wú)明顯水腫，腦實(shí)質(zhì)未見(jiàn)鑭顆粒浸潤(rùn)，周細(xì)胞、各細(xì)胞器形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常(Fig 3)。

3.4 各組微血管內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1、ZO-2、Occludin及Claudin5蛋白分布表達(dá)的比較(免疫組化法)Fig 4～6和Tab 1顯示，ZO-1、ZO-2和Occludin蛋白在假手術(shù)組微血管內(nèi)皮細(xì)胞上分布較多；腦缺血/再灌注后，各蛋白的分布及含量均明顯低于假手術(shù)組(均P<0.01)。與模型組比較，冰片、PNS及AST Ⅳ+PNS組ZO-1和Occludin蛋白表達(dá)明顯增多(P<0.05或P<0.01)，AST Ⅳ組ZO-1表達(dá)增加(P<0.05)，且AST Ⅳ+PNS升高ZO-1的效應(yīng)明顯強(qiáng)于AST Ⅳ、PNS單用(P<0.05或P<0.01)。冰片+AST Ⅳ+PNS及依達(dá)拉奉組ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05或P<0.01)，且冰片+AST Ⅳ+PNS增加ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白的效應(yīng)明顯強(qiáng)于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS(P<0.05或P<0.01)。

3.5 各組腦組織ZO-1、ZO-2、Occludin及Claudin-5蛋白表達(dá)的比較(Western-blot法)Fig 7和Tab 2結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注后，ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(均P<0.01)。與模型組比較，AST Ⅳ組ZO-1蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，冰片組與PNS組ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)，AST Ⅳ+PNS組、冰片+AST Ⅳ+PNS組及依達(dá)拉奉組ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達(dá)增加(P<0.05或P<0.01)。且AST Ⅳ+PNS組上調(diào)ZO-1、Occludin蛋白表達(dá)的效應(yīng)明顯強(qiáng)于AST Ⅳ、PNS單用組(P<0.05或P<0.01)，冰片+AST Ⅳ+PNS組上調(diào)ZO-1、ZO-2及Occludin蛋白表達(dá)的效應(yīng)明顯強(qiáng)于各藥物單用組及AST Ⅳ+PNS組(P<0.05或P<0.01)。各藥物對(duì)Claudin-5蛋白表達(dá)的下調(diào)無(wú)明顯效應(yīng)(P>0.05)。

Tab 1 Comparison of expressions of tight junction proteins such as ZO-1, ZO-2, Occludin in microvascular endothelial cells among each group , n=5)

△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,●●P<0.01vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 3 Comparison of BBB permeability among each group (×15 000, bar=2 μm)

A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 4 Immunohistochemistry pattern of ZO-1 protein in each group (×400)

The arrow indicates the positive expression of ZO-1 protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 5 Immunohistochemistry pattern of ZO-2 protein in each group(×400)

The arrow indicates the positive expression of ZO-2 protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Fig 6 Immunohistochemistry pattern of Occludin protein in each group(×400)

The arrow indicates the positive expression of Occludin protein on the vascular wall. A：Sham;B:Model;C:Borneol;D:AST Ⅳ；E：PNS；F：AST Ⅳ+PNS；G：Borneol+AST Ⅳ+PNS;H:Edaravone

Tab 2 Comparison of expressions of ZO-1, ZO-2, Occludin and Claudin-5 proteins in rat brain tissues of each group , n=5)

△P<0.05,△△P<0.01vssham;★P<0.05,★★P<0.01vsmodel;●P<0.05,●●P<0.01vsAST Ⅳ+PNS;#P<0.05,##P<0.01vsborneol +AST Ⅳ+PNS

Fig 7 Western blot pattern of ZO-1, ZO-2, Occludin proteins in rat brain tissues of each group

4 討論

BBB的屏障特性主要取決于毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和細(xì)胞間緊密連接(TJs)結(jié)構(gòu)和功能的完整性[10]。緊密連接蛋白由多種蛋白組成，主要包括胞漿黏附蛋白(ZO)家族、跨膜蛋白和細(xì)胞骨架蛋白，跨膜蛋白又包括咬合蛋白(Occludin)、閉合蛋白(Claudin)和連接黏附分子[2]。ZO-1是一種細(xì)胞質(zhì)附著蛋白，位于緊密連接內(nèi)皮細(xì)胞的胞質(zhì)面。作為緊密連接復(fù)合體的重要組成單元，ZO-1、Occludin和Claudin 蛋白連同肌動(dòng)蛋白一起，將跨膜蛋白錨定在形成細(xì)胞骨架的內(nèi)皮細(xì)胞上[11]。ZO-1表達(dá)水平與BBB開(kāi)放與關(guān)閉狀態(tài)密切相關(guān)，其功能和結(jié)構(gòu)的改變可導(dǎo)致TJs解離，繼而引起細(xì)胞間隙和血管通透性增加[12]，ZO-1表達(dá)下調(diào)常提示BBB完整性受損，可作為BBB破壞的標(biāo)志。ZO-2與ZO-1以復(fù)合物的方式定位于TJs的胞質(zhì)側(cè)，共同參與組成調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞功能的信號(hào)傳導(dǎo)通路[13]。 Occludin和Claudin-5是調(diào)節(jié)BBB通透性的兩種重要跨膜蛋白[14]，在腦微血管內(nèi)皮上高度表達(dá)，Claudin-5、Occludin蛋白表達(dá)下降可作為BBB損傷的標(biāo)志[15]。

本研究結(jié)果顯示，腦缺血/再灌注后，神經(jīng)功能評(píng)分和腦組織含水量明顯增加。各藥物組能明顯降低神經(jīng)功能評(píng)分和腦含水量，以冰片+AST Ⅳ+PNS組與依達(dá)拉奉組的效應(yīng)最強(qiáng)，且冰片+AST Ⅳ+PNS組的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS組。說(shuō)明冰片與AST Ⅳ、PNS配伍能更好地緩解腦缺血后神經(jīng)功能缺損癥狀和腦水腫。

鑭示蹤電鏡結(jié)果顯示，在正常腦組織，硝酸鑭顆粒未滲透至毛細(xì)血管管腔外，緊密連接和BBB通透性正常。腦缺血/再灌注后，毛細(xì)血管內(nèi)大量鑭顆粒漏出，分布在基底膜、腦組織細(xì)胞間隙及細(xì)胞內(nèi)，腦組織水腫明顯，表明缺血導(dǎo)致緊密連接及BBB破壞，血管通透性增加，導(dǎo)致腦水腫和腦組織損傷。各藥物組均能減輕上述病理改變，尤以冰片+AST Ⅳ+PNS組及陽(yáng)性對(duì)照依達(dá)拉奉組作用更明顯。說(shuō)明冰片、AST Ⅳ、PNS能夠降低腦缺血/再灌后BBB破壞和毛細(xì)血管通透性，減輕腦水腫和腦組織損傷，且三藥合用后作用增強(qiáng)。同時(shí)也說(shuō)明冰片促進(jìn)AST Ⅳ及PNS有效成分進(jìn)入腦組織的作用并非是通過(guò)增強(qiáng)BBB通透性、開(kāi)放BBB來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

ZO-1、ZO-2、Occludin、Claudin-5檢測(cè)結(jié)果表明，這4種蛋白在正常大鼠毛細(xì)血管壁上均有表達(dá)，腦缺血/再灌注后，其表達(dá)均明顯減少，表明緊密連接蛋白表達(dá)降低是引起腦缺血/再灌注后BBB通透性增加的重要原因。各藥物可明顯抑制ZO-1蛋白表達(dá)的降低；除AST Ⅳ外，各藥能明顯上調(diào)Occludin蛋白表達(dá)；冰片+AST Ⅳ+PNS和依達(dá)拉奉還能明顯上調(diào)ZO-2蛋白表達(dá)。且冰片+AST Ⅳ+PNS上調(diào)ZO-1、ZO-2、Occludin的效應(yīng)強(qiáng)于各藥物單用及AST Ⅳ+PNS。說(shuō)明各藥物對(duì)腦缺血后ZO-1、ZO-2、Occludin表達(dá)均有促進(jìn)作用，三種藥物配伍的效應(yīng)比藥物單用和AST Ⅳ+PNS更加明顯，這對(duì)于更好地維持腦缺血后緊密連接的穩(wěn)定性和BBB的通透性具有重要的意義。

綜上所述，腦缺血/再灌注后，大鼠BBB破壞、毛細(xì)血管通透性增加，出現(xiàn)腦水腫和腦組織損傷。冰片、AST Ⅳ和PNS能不同程度降低BBB通透性，減輕腦水腫和腦組織損傷，三種藥物合用能起到增效作用。說(shuō)明冰片與AST Ⅳ、PNS聯(lián)用，其“引藥上行”促進(jìn)AST Ⅳ及PNS有效成分入腦的作用不但不是通過(guò)開(kāi)放BBB來(lái)實(shí)現(xiàn)，而且還可降低腦缺血/再灌注后BBB的通透性、減輕腦水腫，增強(qiáng)AST Ⅳ及PNS抗缺血性腦損傷的作用，該作用可能與協(xié)同抑制腦缺血/再灌注后緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2、Occludin蛋白表達(dá)的下調(diào)有關(guān)。