細(xì)胞縫隙連接對miR-124抗腫瘤作用的影響和機(jī)制研究

張素枝，陶 亮，張曉堅，郭三星

(1. 鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，河南 鄭州 450052；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東 廣州 510080；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州 450052)

MicroRNAs(miRNAs)是一類小分子非編碼RNA，通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合于靶mRNA，使之沉默或降解從而在轉(zhuǎn)錄后水平上抑制靶蛋白的合成[1]。MiR-124是一種高度保守的小編碼RNA，從秀麗隱球菌到人等46種動物中均表達(dá)存在。它高表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)形成和神經(jīng)元的功能發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[2]。相較于正常組織，miR-124在膠質(zhì)瘤中表達(dá)量下降，轉(zhuǎn)染miR-124可抑制膠質(zhì)瘤的增殖[3]。同樣，在宮頸癌組織樣本及宮頸癌細(xì)胞系中，miR-124表達(dá)下調(diào)，恢復(fù)miR-124水平可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖[4]。

細(xì)胞縫隙連接(gap junction，GJ)是一種連接相鄰細(xì)胞胞質(zhì)的中空性蛋白質(zhì)通道，由特殊的通道蛋白-連接蛋白 (connexi， Cx) 組成，可傳遞和擴(kuò)散小分子物質(zhì)(如代謝產(chǎn)物、離子等)到毗鄰細(xì)胞內(nèi)[5]。目前，人體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)21種Cx及相關(guān)基因，其中Cx43、Cx32、Cx26分布較廣泛。不同器官、組織中Cx的分布也不同，例如：肝臟主要表達(dá)Cx32和Cx26，大腦和肺臟主要表達(dá)Cx43，乳腺組織Cx32和Cx26表達(dá)豐富，而宮頸癌Hela細(xì)胞內(nèi)無任何Cx的表達(dá)[6]。另外，不同Cx組成的GJ通道，由于其通道孔徑大小和對可通透物質(zhì)的選擇性不同，導(dǎo)致其傳遞的細(xì)胞信號也不同[7]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，GJ可影響miRNA的抗腫瘤作用，但主要集中在Cx43組成的GJ通道上。Hong等研究報道，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，GJ可在細(xì)胞間傳遞miR-5096和miR-4519從而促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[8]。我們課題組也發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-124可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87和C6的增殖，改變GJ功能可影響miR-124對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑增殖作用[9]。但是，其它Cx組成的GJ對miRNA抗腫瘤作用的影響，及不同GJ在miRNA抗腫瘤過程中發(fā)揮作用的異同卻缺乏相關(guān)研究。因此，我們選取了3種腫瘤細(xì)胞，分別表達(dá)不同的Cx及GJ，觀察并對比miR-124對這3種細(xì)胞增殖性的影響，從而了解GJ在miRNA影響腫瘤細(xì)胞增殖過程中的不同作用。

1 材料與方法

1.1 試劑青霉素/鏈霉素(penicillin/streptomycin)、DMEM、FBS、胰酶(typsin)和多西環(huán)素(doxycyclin，Dox)購自于Gibco；甲叉雙丙烯酰、BSA 蛋白定量試劑盒和丙烯酰胺均購自于美國Bio-rad公司；Calcein AM和lipofectamineTM2000購自于Invitrogen；miR-124 mimics和cy3標(biāo)記的miR-124 mimics購自于銳博公司； ECL-plus化學(xué)發(fā)光劑購自 GE 公司；G418、結(jié)晶紫、二甲基亞砜、潮霉素和所有一抗均購自于Sigma公司；HRP標(biāo)記的鼠二抗、硝酸纖維素膜(NC 膜)購自于美國Amersham公司。

1.2 細(xì)胞系的獲得和培養(yǎng)本實驗用到的細(xì)胞系均由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院藥理教研室陶亮教授惠贈。Hela26和Hela32細(xì)胞由含有1個多克隆位點(用于表達(dá)Cx)和1個LacZ基因(用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的鑒定)的雙向表達(dá)載體質(zhì)粒PBI(BD Biosciences公司)轉(zhuǎn)染Tet-On Hela細(xì)胞，并經(jīng)過挑選、擴(kuò)增而構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。該P(yáng)BI質(zhì)粒Cx的表達(dá)是可以通過四環(huán)素對啟動子的誘導(dǎo)而加以控制的。在野生型U87細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染PRP.EX3d-MCS1>shCx43>PGK/puro質(zhì)粒或?qū)φ召|(zhì)粒PRP.EX3d-MCS1>negative control>PGK/puro(賽業(yè)公司構(gòu)建)，并經(jīng)過G418(0.3 mg·L-1)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)shRNA-Cx43的U87細(xì)胞株(U87shRNA-Cx43細(xì)胞)及其陰性對照細(xì)胞株(U87shRNA-NC細(xì)胞)。其中，Hela32和Hela26細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、G418(終濃度0.1 mg·L-1)、HYG(終濃度0.2 mg·L-1)和DMEM的細(xì)胞篩選液中，并在每次實驗前48小時加Dox(終濃度1 mg·L-1)誘導(dǎo)Cx的表達(dá)；U87shRNA-Cx43和U87shRNA-NC細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、G418(終濃度0.3 mg·L-1)和DMEM的細(xì)胞篩選液中；野生型U87細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS和DMEM的培養(yǎng)液中；以上所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 儀器細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoScientific 公司)；倒置熒光顯微鏡(Motic公司)；凝膠成像儀(Vilber公司)；電泳儀、電泳槽及轉(zhuǎn)移槽(六一生物科技有限公司)；膜片鉗系統(tǒng)(HEKA公司)，膜片鉗顯微鏡(Olympus公司)；Sigma Plot10.0軟件(Jandel Scientific 公司)

1.4 MiR-124轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM2000說明書操作，分別在實驗細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-124 mimics和陰性對照miR-NC,Cy3標(biāo)記的miR-124作為對照用于轉(zhuǎn)染效率的測定。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞集落形成分析法(standard colony forming assay)測定miR-124對各實驗細(xì)胞集落(克隆)形成的影響細(xì)胞經(jīng)過篩選或誘導(dǎo)后種板，轉(zhuǎn)染所需濃度的miR-124，6 h后，洗去培養(yǎng)液，胰酶消化收獲細(xì)胞，計數(shù)并以50個/cm2的密度種在新的6孔板里，培養(yǎng)7 d后固定細(xì)胞，并以1%乙醇結(jié)晶紫常溫孵育染色，洗掉多余的結(jié)晶紫，顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞集落。

1.6 細(xì)胞接種熒光示蹤實驗(parachute Dye-coupling assay)檢測GJ功能將實驗細(xì)胞接種至12孔板，待生長融合后，取其中一孔吸掉培養(yǎng)液并加入含熒光指示劑calcein-AM(0.5 μmol·L-1)的DMED高糖培養(yǎng)基(0.5 mL)作為“供體細(xì)胞”，在37 ℃ 避光孵育30 min。Calcein-AM上所帶的乙酰甲酯(acetoxymethylester，AM)在其進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞的內(nèi)酯酶水解，形成一種發(fā)綠色熒光能夠在GJ間傳遞但不能透過細(xì)胞膜的calcein。胰酶收集孵育好的“供體細(xì)胞”，以500個/孔的密度接種到已生長融合的細(xì)胞(受體細(xì)胞)上。37 ℃避光共孵育4 h，待細(xì)胞貼壁并能形成穩(wěn)定的GJ后，熒光顯微鏡拍照計數(shù)一個“供體細(xì)胞”周圍含有發(fā)綠色熒光的“受體細(xì)胞”的個數(shù)作為評價GJ功能的指標(biāo)。

1.7 WB檢測Cx43、Cx26和Cx32的蛋白表達(dá)去除實驗細(xì)胞的培養(yǎng)液，冰冷PBS清洗2遍后加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，細(xì)胞刮匙收獲細(xì)胞后超聲破碎，于4 ℃，12 000 g離心30 min取上清，采用BSA法蛋白定量后，制備含25 μg蛋白量的樣品，95 ℃水浴鍋中變性5 min，SDS-PAGE凝膠電泳中分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉/TBST封閉30分鐘，孵育抗體，并用ECL-plus化學(xué)發(fā)光劑和凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照，ImageJ軟件對目的條帶進(jìn)行灰度分析。其中，抗體孵育條件如Tab 1所示。

Tab 1 Protein antibody concentration for WB

1.8 膜片鉗參考Ran等[10]和Valiunas等[11]文獻(xiàn)中的膜片鉗方法，觀察Cy3熒光標(biāo)記的miRNA是否能在細(xì)胞之間傳遞。(1)準(zhǔn)備載玻片和鑷子。膜片鉗針對12孔板的專用載玻片先用75%酒精消毒浸泡30分鐘，然后放在干凈的錫箔紙上在生物安全柜中正反面分別紫外消毒30 min，鑷子也做相同的處理；(2)種板準(zhǔn)備細(xì)胞。將消毒好的載玻片用鑷子放入12孔板，并將處于對數(shù)生長期的U87細(xì)胞按照12萬/孔的密度于實驗前1 d傍晚種12孔板，鋪板后顯微鏡下觀察細(xì)胞均勻地鋪在12孔板內(nèi)以及載玻片上；(3)配制膜片鉗電極內(nèi)液和電極外液。按照Ran et al. (2012)文獻(xiàn)中提到的濃度配制電極內(nèi)外液：電極外液(in mmol·L-1)： 101 NaCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 3KCl, 5 glucose, 1.25 NaH2PO4, 20.7 NaHCO3, pH 7.2, 250 Osm。電極內(nèi)液(in mmol·L-1)： 102 K-gluconate, 0.085 CaCl2, 1.7 MgCl2, 17 NaCl, 0.94 EGTA, 8.5 HEPES，pH 7.2，235 mOsM，配制過濾好后分裝入EP管內(nèi)，避免污染；(4)d 2待細(xì)胞融合度為95%有GJ形成時，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，必須狀態(tài)良好，胞膜清楚光滑，折光性強(qiáng)才可以繼續(xù)試驗。鑷子取出一個孔內(nèi)的載玻片，放入含有電極外液的載波板內(nèi)，用外液清洗幾次細(xì)胞，放入防震臺的顯微鏡下，暫時不用的孔板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱。避光的條件下，取5 nmol的Cy3標(biāo)記的miR-124 mimics溶解在20 μL的電極內(nèi)液中，然后打入拉好的電極內(nèi)，先高阻封接胞膜，如果細(xì)胞不能自動破膜則抽吸吸管進(jìn)行破膜，穩(wěn)定后，關(guān)掉明場，打開熒光，觀察電極尖與細(xì)胞接觸處的熒光量，一切正常后用×20物鏡的ABX51WI顯微鏡進(jìn)行明場和暗場記錄拍照。

2 結(jié)果

2.1 在有/無Dox誘導(dǎo)條件下，miR-124對Hela26細(xì)胞增殖性的影響將有/無Dox誘導(dǎo)的Hela26細(xì)胞按15萬/mL的密度分別種板，parachute和WB檢測細(xì)胞GJ功能和Cx26表達(dá)。Fig 1A和1B結(jié)果顯示：加Dox誘導(dǎo)的Hela26細(xì)胞，有明顯的GJ功能和Cx26蛋白表達(dá)；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR-124進(jìn)Hela26細(xì)胞，甲醇固定細(xì)胞后熒光顯微鏡下計數(shù)發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)，轉(zhuǎn)染比例大于90%(Fig 1C)。在細(xì)胞密度為70%的時候轉(zhuǎn)染50 nmol·L-1的miR-124 mimics，集落實驗觀察對細(xì)胞增殖性的影響，F(xiàn)ig 1D結(jié)果顯示：Dox誘導(dǎo)不能影響Hela26細(xì)胞增殖；無論有/無Dox誘導(dǎo)，miR-124均可抑制Hela26細(xì)胞的增殖，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 在有/無Dox誘導(dǎo)條件下，miR-124對Hela32細(xì)胞增殖性的影響同樣，將有/無Dox誘導(dǎo)的Hela32細(xì)胞按15萬/mL的密度分別種板，parachute和WB觀察細(xì)胞GJ功能和Cx32表達(dá)，結(jié)果顯示：相較于無Dox誘導(dǎo)，Dox誘導(dǎo)的Hela32細(xì)胞有顯著的GJ功能和明顯的Cx32蛋白表達(dá)(Fig 2A和2B)；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR-124到Hela32細(xì)胞，甲醇固定，熒光顯微鏡下對熒光細(xì)胞計數(shù)，得到轉(zhuǎn)染比例大于90%(Fig 2C)。集落實驗觀察miR-124(50 nmol·L-1)對細(xì)胞增殖性的影響，F(xiàn)ig 2D結(jié)果顯示：Dox誘導(dǎo)不影響Hela32細(xì)胞增殖；無論有/無Dox誘導(dǎo)，miR-124均可抑制Hela32細(xì)胞的增殖，但兩者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig 1 Effect of miR-124(50 nmol·L-1)on proliferation of Hela26 cells

A: Dox induces Cx26 expression on Hela26 cells, as shown by Western blot. B: Dye spreads through Cx26-derived gap junctions, as shown by parachute dye coupling assay (Magnification:100). C: Identification of transfection efficiency using fluorescence microscopy in Hela26 cells with Cy3 labeled miR-124 transfection. D: Clonogenic survival of Hela26 cells in the presence of 50 nmol·L-1miR-124 mimics.**P<0.01vsmiR-NC group.

Fig 2 Effect of miR-124(50 nmol·L-1)on proliferation of Hela32 cells n=3)

A: Western blot shows Cx32 expression on Hela26 cells after induction of Dox. B: Dye spreads through Cx32-derived gap junctions, as shown by parachute dye coupling assay (Magnification:100). C: Evaluation of transfection efficiency using fluorescence microscopy in Hela32 cells with Cy3 labeled miR-124 transfection. D: Clonogenic survival of Hela32 cells in the presence of 50 nmol·L-1miR-124 mimics.**P<0.01vsmiR-NC group.

2.3 miR-124對U87shRNA-Cx43和U87shRNA-NC細(xì)胞增殖性的影響將U87shRNA-Cx43和U87shRNA-NC細(xì)胞分別按10萬/mL的密度種板，細(xì)胞密度為80%的時候做parachute和90%的時候收集蛋白做WB，F(xiàn)ig 3A和3B結(jié)果顯示：相較于U87shRNA-NC細(xì)胞，U87shRNA-Cx43細(xì)胞中GJ功能和Cx43表達(dá)明顯減弱(P<0.01)；轉(zhuǎn)染Cy3標(biāo)記的miR-124到U87細(xì)胞，直接顯微鏡下計數(shù)熒光細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)染比例大于90%(Fig 3C)。集落實驗檢測50 nmol·L-1的miR-124對U87shRNA-Cx43和U87shRNA-NC細(xì)胞增殖性的影響，F(xiàn)ig 3D結(jié)果顯示：miR-124可抑制U87shRNA-Cx43和U87shRNA-NC細(xì)胞增殖；單獨降低Cx43蛋白表達(dá)不能影響U87細(xì)胞增殖，但聯(lián)合miR-124轉(zhuǎn)染可減弱miR-124的抑制增殖作用，提高細(xì)胞的集落形成數(shù)目(P<0.05)。

2.4 Cy3標(biāo)記的miR-124在U87細(xì)胞中的熒光傳遞情況將處于對數(shù)增長期的野生型U87細(xì)胞接種在鋪有載玻片的12孔板內(nèi)，細(xì)胞融合度95%左右時，選取狀態(tài)好，胞膜光滑平整，折光性好的細(xì)胞導(dǎo)入Cy3熒光標(biāo)記的miR-124，如膜片鉗示意圖所示(Fig 4A)。帶熒光的miR-124被導(dǎo)入玻璃電極內(nèi)的，高阻封接在細(xì)胞膜上，破膜后只有電極尖端處發(fā)熒光，隨著時間的延長，可觀察到熒光逐漸布滿整個細(xì)胞以及傳遞到相鄰的細(xì)胞(Fig 4B)。

3 討論

Cx是一個多基因家族表達(dá)的跨膜蛋白，不同Cx位于羧基末端和胞內(nèi)連接肽鏈的氨基酸數(shù)目及排列方式不同，決定了由不同Cx組成的GJ通道，對信號物質(zhì)的選擇性以及細(xì)胞對其功能的調(diào)節(jié)方式也可以是不同的[7]。本研究中，我們同時觀察了3種不同Cx組成的GJ對miR-124腫瘤抑制作用的影響發(fā)現(xiàn)無論誘導(dǎo)Cx26或Cx32的表達(dá)與否，不影響Hela細(xì)胞的增殖，并且由Cx26或Cx32組成的GJ也不影響miR-124的抗腫瘤作用。降低Cx43表達(dá)對U87細(xì)胞增殖無影響，但降低Cx43組成的GJ功能可減弱miR-124對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑增殖作用。膜片鉗技術(shù)觀察GJ對miR-124的通透性，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記在miR-124上的紅色熒光可在U87細(xì)胞間進(jìn)行傳遞。

Cx26、Cx32和Cx43是人體內(nèi)分布最為廣泛的3種Cx。天然表達(dá)Cx26或Cx32的腫瘤細(xì)胞系也很常見，但通常是同一個細(xì)胞系上同時表達(dá)兩種或兩種以上的Cx。本實驗通過在Hela細(xì)胞上轉(zhuǎn)染含有Cx26 cDNA或Cx32 cDNA的載體質(zhì)粒PBI，并結(jié)合Tet-On系統(tǒng)，從而實現(xiàn)只有在實驗需要的時候?qū)x進(jìn)行誘導(dǎo)，減少持續(xù)表達(dá)對細(xì)胞的傷害。U87細(xì)胞是研究Cx43及其GJ功能的常用細(xì)胞模型，作為U87細(xì)胞上最主要的一種Cx[12]，Cx43及其GJ表達(dá)非常豐富。采用這3種細(xì)胞模型可有效降低其他Cx的影響和干擾，保證研究環(huán)境的相對單一性。

A: The Cx43 expression in U87shRNA-Cx43cells is significantly lower than in U87shRNA-NCcells, as shown by Western blot. B: The dye spreading number in Cx43-deficient cells (U87shRNA-Cx43) is much fewer than in the normal level in Cx43 cells (U87shRNA-NC) (Magnification:100). C: Evaluation of transfection efficiency using fluorescence microscopy in U87 cells with Cy3 labeled miR-124 transfection. D: miR-124 mimics can decrease U87shRNA-Cx43cell survival, but is less effective than in reducing the cell colony forming in U87shRNA-NCcells.*P<0.05,**P<0.01vsmiR-NC group,#P<0.05vsmiR-124 of U87shRNA-NCgroup.

Fig 4 Gap junction-mediated transport of miR-124 between U87 cells

A: Schematic diagram of patch clamp method. B: Cy3 labelled miR-124 were injected into the source cell using the patch clamp technique, and the fluorescence transmitted from the sourcecell to the adjacent cell in 40 min (Magnification: 200).

傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，GJ僅允許不超過1 000～1 500道爾頓的小分子物質(zhì)通過，近年來研究發(fā)現(xiàn)分子量大于1 500道爾頓的物質(zhì)如siRNA、miRNA也可以通過GJ[8-9,11]，但是不同GJ通道通透性的差異決定其對miRNA有選擇性，不是所有的miRNA均能通過GJ。其中Cx43組成的GJ被認(rèn)為可以傳遞miRNA并影響miRNA的抗腫瘤作用[8-9]。Valiunas等[11]在其研究中提到，由Cx26和Cx32組成的異質(zhì)性GJ不能傳遞足夠的siRNA來調(diào)節(jié)相鄰細(xì)胞中聚合酶β基因的表達(dá)，但是Cx43組成的GJ卻能夠做到。Kolodny研究證明，由Cx26和Cx32組成的異質(zhì)性GJ通道及同質(zhì)Cx26組成的GJ對miRNA幾乎都沒有通透性[13]。這些研究提示不同Cx組成的GJ對miRNA的通透性確實存在差異，這可能是不同Cx組成的GJ對miR-124抗腫瘤作用影響不同的主要原因。

不同GJ的孔道內(nèi)徑可能是影響其對miRNA通透性的另一個重要原因。相較于早期研究認(rèn)為GJ通道允許通透的最大分子量為1 000～1 500道爾頓，同型 Cx43 組成的GJ允許2 000～5 000道爾頓分子量的物質(zhì)通過[14]。有人測定過不同Cx組成通道的孔徑，從大到小依次為：Cx43>Cx32>Cx26[15]，這與目前GJ與miRNA傳遞性的研究結(jié)果基本一致。但也不能排除其他因素的影響：如選擇的miRNA的大小。綜上所述，我們的研究結(jié)果提示GJ對miRNA抗腫瘤作用的影響具有Cx異質(zhì)性，此異質(zhì)性可能與GJ對miRNA的通透性有關(guān)。但GJ對miRNA的這種作用是否也存在于其他Cx組成的GJ及是否受到選擇的miRNA的影響還需要進(jìn)一步的研究。

(致謝: 本實驗主要在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部實驗室完成，感謝實驗室全體人員的幫助。)